結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞株中TSPAN1蛋白、mRNA的表達(dá)變化

石剛，張睿，任宇鵬，陳悅，廉波，馬思平，孟慶凱，陳玉澤，劉放

(1中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，沈陽 110042；2遼寧省腫瘤醫(yī)院)

·臨床研究·

結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞株中TSPAN1蛋白、mRNA的表達(dá)變化

石剛1，2，張睿1，2，任宇鵬1，2，陳悅1，2，廉波1，2，馬思平1，2，孟慶凱1，2，陳玉澤1，2，劉放1，2

(1中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，沈陽 110042；2遼寧省腫瘤醫(yī)院)

目的 觀察結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞株中TSPAN1蛋白、mRNA的表達(dá)變化，并探討其意義。方法 結(jié)直腸癌患者31例，手術(shù)治療中留結(jié)直腸癌組織、癌旁組織及距離腫瘤5 cm以上的正常結(jié)直腸組織各31例份，分別采用Western blotting法及qRT-PCR法檢測TSPAN1蛋白、mRNA，并分析TSPAN1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系；另選結(jié)直腸癌細(xì)胞株Colo-205、HCT-116、HT-29、SW620，分別采用Western blotting法及qRT-PCR法檢測各組TSPAN1蛋白、mRNA。結(jié)果 結(jié)直腸癌、癌旁、正常組織中TSPAN1蛋白相對表達(dá)量分別為29.3±4.1、12.8±4.6、10.1±3.7，TSPAN1 mRNA相對表達(dá)量分別為1.6±0.4、0.6±0.5、0.5±0.3，結(jié)直腸癌組織與癌旁、正常組織比較，P均<0.05。組織中TSPAN1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤及血管浸潤有關(guān)(P均<0.05)。Colo-205、HCT-116、HT-29、SW620細(xì)胞中TSPAN1蛋白相對表達(dá)量分別為12.7±2.1、13.6±2.9、11.8±2.4、23.6±3.5，TSPAN1 mRNA相對表達(dá)量分別為1.1±0.3、1.2±0.3、0.9±0.2、1.8±0.1，Colo-205、HCT-116、HT-29細(xì)胞與SW620細(xì)胞比較，P均<0.05。結(jié)論 TSPAN1蛋白、mRNA在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞株中均呈高表達(dá)，可能與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移及浸潤惡性行為有關(guān)。

結(jié)直腸癌；結(jié)直腸腫瘤；結(jié)直腸癌細(xì)胞株；TSPAN1蛋白

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率及病死率均居惡性腫瘤第3位[1]；浸潤生長、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌惡性行為的主要表現(xiàn)，也是結(jié)直腸癌致死的主要原因[2]。原發(fā)病灶浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤及神經(jīng)浸潤是結(jié)直腸癌預(yù)后的重要因素，是評價其浸潤及轉(zhuǎn)移等惡性行為的主要標(biāo)志[3]。結(jié)直腸癌的不同發(fā)展階段有不同的致病因素及基因參與，四跨膜蛋白超家族(TM4SF)是一組跨膜蛋白，在多種惡性腫瘤中均呈高表達(dá)，與腫瘤的惡性行為發(fā)展有相關(guān)性[4]。TSPAN1蛋白是TM4SF家族重要成員之一，其在胰腺癌、肝癌及前列腺癌等惡中表達(dá)上調(diào)[5，6]。本研究觀察了結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞株中TSPAN1蛋白、mRNA的表達(dá)變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1～12月收治的結(jié)直腸癌患者31例，男17例，女14例；年齡49～78歲；腫瘤位于左側(cè)16例，右側(cè)15例；直徑>1/2周徑17例，≤1/2周徑14例；浸潤深度T1、T2 9例，T3、T4 22例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移6例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移25例；高中分化20例，低分化11例；有神經(jīng)浸潤8例，無神經(jīng)浸潤23例；有血管浸潤7例，無血管浸潤24例。手術(shù)留結(jié)直腸癌組織、癌旁組織及距離腫瘤5 cm以上的正常結(jié)直腸組織各31例份，手術(shù)切除標(biāo)本后立即給予取樣，采用液氮罐中進(jìn)行保存。結(jié)直腸癌細(xì)胞株(HCT-116、Colo-205、SW620、HT-29)在中國醫(yī)科大學(xué)實驗中心進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行傳代及保存；引物由大連寶生技術(shù)有限公司進(jìn)行設(shè)計及合成；TSPAN1多克隆抗體購自立陶宛Fermentas公司；BCA試劑盒及RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒購自北京金山生物科技公司，miRNA提取試劑盒購自深圳深安生物科技公司；All-in-OneTMqPCR Mix試劑盒(美國Abcom公司)。

1.2 TSPAN1蛋白檢測方法 采用Western blotting法。剪取各種組織約100 mg，在250 μL的蛋白裂解液中進(jìn)行剪碎，在冰上靜置30 min，在4 ℃、11 000 g 條件下離心30 min，按BCA試劑盒說明對蛋白濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。對各組培養(yǎng)的細(xì)胞中采用250 μL蛋白裂解液，進(jìn)行搖勻及震蕩，提取總蛋白，提取上清液體測定蛋白濃度。組織及細(xì)胞株的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品定量為30 mg/mL，稀釋為0.5 mg/mL的終濃度，10%SDS-PAGE分離蛋白并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉在4 ℃下封閉90 min，分別加入一抗，孵育過夜后加入相應(yīng)二抗，再次孵育，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法顯色，β-actin為內(nèi)參照。應(yīng)用QuantityOne進(jìn)行灰度值檢測，蛋白相對表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參照蛋白灰度值。

1.3 TSPAN1 mRNA檢測方法 采用qRT-PCR法。剪取各種組織標(biāo)本約100 mg，液氮條件下進(jìn)行物理研磨，細(xì)胞株總RNA的提取并純化按照RNA分離試劑盒及TRIzol試劑盒的說明書步驟進(jìn)行操作，將RNA樣本濃度稀釋至1 g/L，采用紫外吸收法測定RNA液濃度及純度，變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA完整性測定。然后進(jìn)行樣品cDNA合成、梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品管家基因(β-actin)的實時定量PCR、制備用來繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線DNA模板，然后對待測基因進(jìn)行實時定量PCR，反應(yīng)體系如下：1.SYBR Green 1染料10 μL，2.上游引物1 μL，3.下游引物1 μL，4.dNTP 1 μL，5.Taq聚合酶2 μL，6.待測樣品cDNA 5 μL，7.ddH2O 30 μL，8.總體積 50 μL。將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件：93 ℃預(yù)變性2 min，然后按94 ℃、1 min，56 ℃、1 min，73 ℃、1 min，共40個循環(huán)，最后73 ℃、7 min延伸。得到目的基因及內(nèi)參照基因Ct值， Ct=ΔCt(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)，ΔΔCt=ΔCt(研究樣本)-ΔCt(對照組樣本)；計算2-ΔΔCt即目的基因mRNA相對表達(dá)量，結(jié)果以相對表達(dá)量進(jìn)行表示。

2 結(jié)果

2.1 TSPAN1蛋白、mRNA在結(jié)直腸癌及癌旁和正常組織中的表達(dá)比較 結(jié)果見表1。

表1 TSPAN1蛋白、mRNA在結(jié)直腸癌及癌旁和正常組織中的表達(dá)比較

注：與癌旁組織、正常組織比較，*P<0.05。

2.2 組織中TSPAN1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)果見表2。由表2可知，組織中TSPAN1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤及血管浸潤有關(guān)(P均<0.05)。

表2 TSPAN1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 TSPAN1蛋白和mRNA在Colo-205、HCT-116、HT-29、SW620細(xì)胞中的表達(dá)比較 結(jié)果見表3。

表3 TSPAN1蛋白和mRNA在Colo-205、HCT-116、HT-29、SW620細(xì)胞中的表達(dá)比較

注：與SW620細(xì)胞比較，*P<0.05。

3 討論

近年來，無論是在歐美還是在中國結(jié)直腸癌發(fā)病率均呈明顯上升趨勢[7]，隨著研究的深入與人群篩查的逐漸普及，尤其是靶向治療藥物的發(fā)展，結(jié)直腸癌病死率在近20年顯著下降，晚期肝轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌在靶向及化療綜合治理基礎(chǔ)上，3年生存率及5年生存率均有大幅提高。對結(jié)直腸癌惡性行為預(yù)測基因的研究是熱點，也是靶向治療靶點研究的基礎(chǔ)[8]。

文獻(xiàn)[9]報道，TSPAN1在胰腺癌表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)呈正相關(guān)性；但也有研究[10]認(rèn)為，在胃癌組織中TSPAN1是作為抑癌基因出現(xiàn)的，受到mir573調(diào)控。TSPAN1往往與整合素或黏附因子組成跨膜四超分子富集區(qū)域，對細(xì)胞的行為進(jìn)行調(diào)控，這種復(fù)合體集中在細(xì)胞的前緣，是細(xì)胞移動性及黏附性增高的基礎(chǔ)，同時也是腫瘤細(xì)胞遷移及種植等惡性行為的前提因素[11]。

本文結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中TSPAN1蛋白、mRNA相對表達(dá)量均高于癌旁及正常組織，這表明在RNA水平TSPAN1可能已經(jīng)參與結(jié)直腸癌惡性行為的調(diào)控，并在蛋白水平高表達(dá)。進(jìn)一步研究顯示，結(jié)直腸癌組織中TSPAN1蛋白高表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤、血管浸潤相關(guān)，這說明TSPAN1或許與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移及浸潤等惡性行為相關(guān)，可能是作為上游基因發(fā)揮調(diào)控作用，也可能是作為下游基因受到其他基因的調(diào)控。刑娜娜等[12]對體外人結(jié)直腸癌細(xì)胞中TSPAN1表達(dá)進(jìn)行了下調(diào)，結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力下降，認(rèn)為TSPAN1通過TGF-β受體及雌激素受體通路調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及侵襲行為。Wang等[11]認(rèn)為，TSPAN1同家族成員CD151、TSPAN12與整合素α6β1、α6β4形成復(fù)合體，調(diào)控腫瘤生長、浸潤、遷移及轉(zhuǎn)移，并和信號傳導(dǎo)及化療藥物敏感性等具有關(guān)聯(lián)。而對結(jié)直腸癌治療過程中影響化療敏感性及耐藥性的基因也是目前研究的熱點，對于治療方案的制定具有越來越明顯的決定作用[13]。

Colo-205、HCT-116、HT-29細(xì)胞來自結(jié)腸癌原發(fā)灶，SW620細(xì)胞來自結(jié)腸腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，TSPAN1在來自轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的SW620細(xì)胞中表達(dá)高于來自原發(fā)灶的細(xì)胞株。本文結(jié)果顯示，SW620細(xì)胞TSPAN1蛋白、mRNA相對表達(dá)量均高于Colo-205、HCT-116、HT-29細(xì)胞，這表明TSPAN1可能與結(jié)直腸遷移的惡性行為有關(guān)。Liu等[14]認(rèn)為，通過小干擾RNA轉(zhuǎn)染下調(diào)在TSPAN1同族成員TSPAN12表達(dá)，結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力減弱，上調(diào)后轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，進(jìn)一步證明TSPAN家族成員與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力具有調(diào)控作用，但其調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步研究探討。Detchokul等[15]研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞從原發(fā)病灶脫離，重新在細(xì)胞間質(zhì)塑形，進(jìn)行遷移、識別和穿過內(nèi)皮細(xì)胞間隙進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，在其他部位種植及生長是轉(zhuǎn)移的主要過程，在這一過程中細(xì)胞骨架的激活和重建是主要因素，并決定著腫瘤細(xì)胞的黏附和運動，而TSPAN等膜蛋白家族成員在細(xì)胞骨架的塑形中具有基礎(chǔ)及決定性的作用，并調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷移及腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞之間的關(guān)系，這在癌癥浸潤及轉(zhuǎn)移中是極為重要的。

總之，TSPAN1蛋白、mRNA在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞株中高表達(dá)，可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

[1] Chow CJ, Al-Refaie WB, Abraham A, et al. Does patient rurality predict quality colon cancer care: a population-based study[J]. Dis Colon Rectum, 2015,58(4):415-422.

[2] 曾云龍,李俊.結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移預(yù)后臨床及病理相關(guān)因素研究進(jìn)展[J].中國腫瘤外科雜志,2016,8(5):287-293.

[3] 鐘敏兒,徐徠,徐瓊，等.陽性淋巴結(jié)對數(shù)比分期預(yù)測Ⅲ期結(jié)腸癌預(yù)后的價值[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報,2016,38(3):294-299.

[4] 何磊.四跨膜蛋白在肝癌中的作用[J].中國腫瘤臨床,2011,38(18):1175-1178.

[5] 石剛,董明,盛偉偉,等.Tspan1及Integrin α6在人胰腺導(dǎo)管腺癌中的表達(dá)及其與臨床特征的關(guān)系[J].中華外科雜志,2014,52(10):781-786.

[6] Xu F, Gao Y, Wang Y, et al. Decreased TSPAN1 promotes prostate cancer progression and is a marker for early biochemical recurrence after radical prostatectomy[J]. Oncotarget, 2016,7(39):63294-63305.

[7] 張志,吳亞運,何宋兵,等.257例大腸癌患者的臨床特征、病理及預(yù)后分析[J].中國血液流變學(xué)雜志,2016,26(1):76-78.

[8] Burz C, Aziz BY, B?l?cescu L, et al. Tumor markers used in monitoring the tumor recurrence in patients with colorectal cancer[J]. Clujul Med, 2016,89(3):378-383.

[9] Hou FQ, Lei XF, Yao JL, et al. Tetraspanin 1 is involved in survival, proliferation and carcinogenesis of pancreatic cancer[J]. Oncol Re, 2015,34(6):3068-3076.

[10] Lu Z, Luo T, Nie M, et al. TSPAN1 functions as an oncogene in gastric cancer and is downregulated by miR-573[J]. FEBS Lett, 2015,589(15):1988-1994.

[11] Wang HX, Li Q, Sharma C, et al. Tetraspanin protein contributions to cancer[J]. Biochem Soc Trans, 2011,39(2):547-552.

[12] 邢娜娜,張慧慧,謝佳琪,等.敲除TSPAN1抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的生長和侵襲[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2016,45(1):29-33.

[13] Hu T, Li Z, Gao CY, et al. Mechanisms of drug resistance in colon cancer and its therapeutic strategies[J]. World J Gastroenterol, 2016,22(30):6876-6889.

[14] Liu J, Chen C, Li G, et al. Upregulation of TSPAN12 is associated with the colorectal cancer growth and metastasis[J]. Am J Transl Res, 2017,9(2):812-822.

[15] Detchokul S, Williams ED, Parker MW, et al. Tetraspanins as regulators of the tumour microenvironment: implications for metastasis and therapeutic strategies[J]. Br J Pharmacol, 2014,171(24):5462-5490.

國家自然科學(xué)基金資助項目(81672427)；遼寧省博士科研啟動基金資助項目(201601417)。

劉放(E-mail: liufang@cancerhosp-ln-cmu.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.31.011

R735.8

B

1002-266X(2017)31-0041-03

2017-04-07)