金鐵鎖灌胃對兔膝骨關(guān)節(jié)炎的治療作用及其機(jī)制探討

王勝民，劉毅，熊華章

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義 563000)

金鐵鎖灌胃對兔膝骨關(guān)節(jié)炎的治療作用及其機(jī)制探討

王勝民，劉毅，熊華章

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義 563000)

目的 觀察金鐵鎖對兔膝骨關(guān)節(jié)炎(OA)的治療作用，并探討其可能機(jī)制。方法 120只兔隨機(jī)分為4組各30只，模型組、金鐵鎖組、氨基葡萄糖組均制備OA模型，空白組不制備模型；制模后金鐵鎖組和氨基葡萄糖組分別灌胃金鐵鎖、氨基葡萄糖，模型組和空白組給予等量生理鹽水。觀察各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨大體、病理學(xué)變化，比較兔膝關(guān)節(jié)軟骨白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP-1)的mRNA及蛋白。結(jié)果 與空白組比較，模型組膝關(guān)節(jié)肉眼觀及病理學(xué)變化明顯，且隨制模時間變化而變化；與模型組比較，氨基葡萄糖組、金鐵鎖組上述情況好轉(zhuǎn)，金鐵鎖組治療效果更佳。與空白組比較，模型組IL-1β、MMP-3、TIMP-1 mRNA及蛋白表達(dá)升高；與模型組比較，氨基葡萄糖組、金鐵鎖組IL-1β、MMP-3 mRNA及蛋白表達(dá)降低，TIMP-1表達(dá)升高；與氨基葡萄糖組比較，金鐵鎖組IL-1β、MMP-3 mRNA及蛋白表達(dá)降低，TIMP-1表達(dá)升高。結(jié)論 金鐵鎖對兔膝OA有治療作用，其機(jī)制可能與下調(diào)膝炎癥因子IL-1β、MMP-3表達(dá)及上調(diào)TIMP-1表達(dá)有關(guān)。

金鐵鎖；中藥；骨關(guān)節(jié)炎；白細(xì)胞介素1β；基質(zhì)金屬蛋白酶3；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹饕卣鞯穆躁P(guān)節(jié)疾病[1]，其好發(fā)于60歲以上老人(約66%)，且女性多于男性[2]。近年OA呈高發(fā)病率、高致殘率和病程久的趨勢，給患病人群帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。白細(xì)胞介素1β(IL-1β)是OA重要的致炎因子之一，其主要由滑膜及關(guān)節(jié)軟骨等產(chǎn)生[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)屬蛋白水解酶類，并主要依靠鋅離子發(fā)揮降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的作用[4]。MMPs可以使OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解平衡紊亂并進(jìn)一步引起關(guān)節(jié)軟骨的破壞及變性[5]。IL-1β與其相應(yīng)受體結(jié)合后，可激活絲裂原活化蛋白激酶信號通路，引起MMPs的增高及降解細(xì)胞外基質(zhì)等過程，進(jìn)而引發(fā)OA[6]。目前，西醫(yī)對OA的治療取得較好效果，但局限于關(guān)節(jié)腔注射藥物及手術(shù)治療等，且并發(fā)癥較多。中醫(yī)認(rèn)為OA屬“痹證”范疇，主要病因由肝腎虧損、外感風(fēng)寒等導(dǎo)致[7]。金鐵鎖屬于石竹科的植物，在貴州等西南地區(qū)居多[8]，主要用于跌打損傷、風(fēng)濕疼痛，可抑制腫瘤壞死因子-α、IL-1β、氧自由基等，具有抗炎、消腫和鎮(zhèn)痛的作用[9,10]。本研究觀察了金鐵鎖對兔膝OA的治療作用，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年健康新西蘭大白兔120只，體質(zhì)量約2.5～3.0 kg，雌雄不限，兔齡12周，由中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供；由遵義醫(yī)學(xué)院動物實驗基地負(fù)責(zé)分籠喂養(yǎng)，兔自由飲水，生活環(huán)境溫度(20±2)℃，自然光照與黑暗時間為12 h交替。實驗過程對兔的操作均符合國家科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》[11]，且得到了遵義醫(yī)學(xué)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器及試劑 SM2000R型病理組織切片機(jī)；ND-1000型核酸蛋白測量儀；CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System；ICyeler iQS型熒光定量PCR儀；DNX-9620A型電腦洗板機(jī)；DNM-9602G型酶標(biāo)分析儀；Centrifuge 5804R型高溫低速離心機(jī)。IL-1β酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒、基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)ELISA試劑盒、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP-1)ELISA試劑盒；總RNA提取試劑盒；Prime ScriptTMRT Reagent Kit；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ；PCR引物(IL-1β、MMP-3、TIMP-1)。

1.3 金鐵鎖制作 首先揀選、粗碎(20目)的金鐵鎖根莖500 g(產(chǎn)地貴州，檢驗符合藥典規(guī)定)；其次加水提取3次(第1次5倍量水1 h、第2次4倍量水1 h、第3次3倍量水1 h)，濾過合并濾液；再者濃縮(常壓)、收膏、加入淀粉混勻干燥；最后粉碎并加入淀粉補(bǔ)足100 g混勻。

1.4 動物分組、模型制備及金鐵鎖灌胃 120只新西蘭大白兔隨機(jī)分為空白組、模型組、金鐵鎖組、氨基葡萄糖組各30只，每組再按制模后4、6、8周分3個亞組各10只。除空白組外其余各組均按改良Hulth法制備OA模型[12]。按照兔體質(zhì)量計算麻醉劑劑量，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉(25 mg/kg)，手術(shù)區(qū)域常規(guī)備皮并消毒、鋪巾，在兔右膝行內(nèi)側(cè)切口，依次切開皮膚、皮下、筋膜，暴露右膝關(guān)節(jié)腔，切除前交叉韌帶及內(nèi)側(cè)半月板并進(jìn)行前抽屜實驗確保膝關(guān)節(jié)的前交叉韌帶已完全斷裂，逐層縫合。各組兔術(shù)后予以肌注青霉素鈉20萬U/kg，連用4 d；分籠飼養(yǎng)并每日驅(qū)趕兔活動約1 h/d。由于氨基葡萄糖治療膝OA的效果肯定，本實驗中作為陽性藥物對照[13]。模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)參考Mankin評分標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)后給藥劑量主要根據(jù)《藥理實驗方法學(xué)》中的人和動物體表面積折算的等效劑量比率表來折算[14]。金鐵鎖組和氨基葡萄糖組分別于制模當(dāng)日灌胃給予12.8 mg/(kg·d)的金鐵鎖及氨基葡萄糖，空白及模型組灌服等量生理鹽水，總量均為10 mL，1次/d。

1.5 兔及兔膝關(guān)節(jié)軟骨肉眼觀察 分別于術(shù)后4、6、8周觀察兔的精神狀態(tài)、飲食情況、體質(zhì)量變化及膝關(guān)節(jié)腫脹程度等。

1.6 兔膝關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)觀察 將實驗動物處死后取右膝股骨內(nèi)側(cè)髁及脛骨平臺內(nèi)側(cè)的負(fù)重區(qū)關(guān)節(jié)軟骨，生理鹽水沖洗干凈，肉眼觀察后分別放于液氮(-196 ℃)及10%甲醛固定，待測。10%甲醛固定脛骨平臺標(biāo)本3 d，隨后繼續(xù)用EDTA脫鈣液脫鈣25 d。常規(guī)脫水、剝離脛骨平臺內(nèi)側(cè)負(fù)重區(qū)的關(guān)節(jié)軟骨、石蠟包埋、行5 μm厚度切片，二甲苯梯度濃度脫蠟，乙醇梯度濃度水化。HE染色：蘇木精染色5 min，鹽酸酒精分化20 s，伊紅染色4 min；番紅染色：番紅染色3 min，二甲苯梯度透明，中性樹膠封片，鏡檢。

1.7 兔膝關(guān)節(jié)軟骨IL-1β、MMP-3、TIMP-1 mRNA檢測 取材同1.6。IL-1β、MMP-3、TIMP-1 mRNA檢測采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法：①總RNA提?。阂旱h(huán)境下剝離及研磨股骨內(nèi)側(cè)髁負(fù)重區(qū)關(guān)節(jié)軟骨，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，提取的mRNA稀釋50倍之后用ND1000型核酸蛋白測量儀檢測OD260和OD280。保證OD260/OD280值在1.8～2.0。②cDNA的合成：5×Prime Script Buffer(for Real Time)4 μL，Prime Script RT Enzyme Mix I 1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，Random 6 mers 1 μL，Total RNA 6 μL，Rnase Free ddH2O 7 μL；總反應(yīng)體系20 μL，在37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃、Forever的條件下嚴(yán)格按照說明書操作逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。③基因擴(kuò)增：以cDNA作為擴(kuò)增的模板進(jìn)行RT-PCR檢測，體系：Rnase Free ddH2O 6.4 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10.0 μL，cDNA 2.0 μL，上、下游引物(Sangon Biotech合成，詳見表1)各0.8 μL，總體積20.0 μL；擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s，1循環(huán)；95 ℃變性10 s，40個循環(huán)；退火延伸60 ℃、30 s，40個循環(huán)；溶解55～95 ℃，5 s。用2-ΔΔCt法(Ct為熒光達(dá)到閾值時所需PCR的循環(huán)數(shù))分析IL-1β、MMP-3、TIMP-1 mRNA相對表達(dá)量。

表1 RT-PCR目的基因引物的序列及產(chǎn)物的長度

1.8 兔血漿IL-1β、MMP-3、TIMP-1蛋白檢測 分別在制模4、6、8周分別取兔耳緣靜脈取血(2 mL)，并裝于乙二胺四乙酸二鉀(EDTAK2)抗凝管，將抗凝管上下顛倒混勻3次，靜置后在離心機(jī)上以3 000 r/min離心20 min，分離血漿后裝在Eppendorf中，-80 ℃保存，待測。IL-1β、MMP-3、TIMP-1蛋白檢測采用ELISA法：在相應(yīng)反應(yīng)板孔內(nèi)加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)液和100 μL血漿；充分混勻30 s，蓋好反應(yīng)板孔，在37 ℃環(huán)境下溫育約60 min。洗板：甩盡反應(yīng)板內(nèi)液體，反應(yīng)板反復(fù)用洗滌液洗滌，反復(fù)拍打，重復(fù)5次。每孔加入100 μL 1×Biotin，輕輕搖勻30 s，封住反應(yīng)板孔，37 ℃溫育60 min；再次洗板。每孔加入100 μL 1×HRP，輕輕混勻30 s，封住板孔，37 ℃溫育60 min；再次洗板。每反應(yīng)孔加入100 μL的TMB顯色液，混勻10 s，在37 ℃的暗處環(huán)境內(nèi)溫育25 min。每反應(yīng)孔內(nèi)加入100 μL的反應(yīng)終止液，混勻30 s，在30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測吸光度值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)作為橫坐標(biāo)，用OD值作為縱坐標(biāo)，計算相應(yīng)檢測指標(biāo)蛋白濃度。

2 結(jié)果

2.1 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨肉眼觀及病理學(xué)變化 ①肉眼觀：空白組兔活動自如，毛發(fā)光亮，右膝關(guān)節(jié)無腫大；制模4、6、8周前后體質(zhì)量無明顯增減，關(guān)節(jié)軟骨透明，表面光滑、平整，色澤鮮亮，無骨贅形成。模型組兔制模后4、6、8周的活動逐漸受限，右膝關(guān)節(jié)腫脹程度隨時間的延長而加重；6周時兔體質(zhì)量開始出現(xiàn)明顯減輕，右膝開始明顯腫脹，出現(xiàn)跛行，毛發(fā)暗淡；8周時兔跛行明顯，關(guān)節(jié)軟骨表面可見潰瘍，可見明顯骨贅及部分骨外露。氨基葡萄糖組兔活動隨時間延長而減少，膝關(guān)節(jié)腫脹程度隨時間增加而加重；制模6周時，體質(zhì)量開始減輕，右膝開始腫脹，出現(xiàn)跛行，毛發(fā)暗淡；制模8周時，跛行較前加重，關(guān)節(jié)軟骨局部可見輕度潰瘍，可見少量骨贅。金鐵鎖組制模后4周時，兔活動、關(guān)節(jié)腫脹情況與模型組比較，均無明顯差別，體質(zhì)量未見明顯增減，關(guān)節(jié)軟骨表面稍粗糙，有小的裂隙，無明顯骨贅形成，色澤暗淡；制模后6、8周時，兔活動較之前明顯減少，關(guān)節(jié)腫脹情況較之前加重，但均比模型組明顯改善，體質(zhì)量減輕不明顯，可見跛行。②病理學(xué)：制模后空白組兔關(guān)節(jié)軟骨透明，表面結(jié)構(gòu)規(guī)則、正常；細(xì)胞數(shù)量正常，基質(zhì)染色正常，潮線完整。模型組兔制模后4周時關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，可見較多不規(guī)則裂隙形成，細(xì)胞數(shù)量彌漫性增多，基質(zhì)染色輕度減少，潮線完整；6周時關(guān)節(jié)軟骨表面較粗糙、不規(guī)則，可見局部關(guān)節(jié)軟骨血管翳形成，軟骨細(xì)胞出現(xiàn)大量簇集樣細(xì)胞團(tuán)，基質(zhì)染色輕中度失染，局部潮線不完整；8周時關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙、極不規(guī)則，可見裂隙深達(dá)關(guān)節(jié)軟骨的鈣化層；軟骨細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，基質(zhì)中度或重度失染，潮線不完整。氨基葡萄糖組制模后4周關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，結(jié)構(gòu)欠規(guī)則，可見不規(guī)則裂隙形成，軟骨細(xì)胞的數(shù)量彌漫性增多，基質(zhì)染色輕度減少，潮線完整；6周時關(guān)節(jié)軟骨表面較粗糙，可見部分軟骨血管翳形成，細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)簇集樣細(xì)胞團(tuán)，基質(zhì)染色輕中度失染，局部潮線不完整；8周時關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙、結(jié)構(gòu)不規(guī)則，可見較多軟骨血管翳形成，甚至裂隙深達(dá)關(guān)節(jié)軟骨的放射層，軟骨細(xì)胞的數(shù)量輕中度減少，基質(zhì)中度或重度失染，潮線不完整。金鐵鎖組兔制模4周時關(guān)節(jié)軟骨表面稍粗糙，局部可見少量不規(guī)則裂隙形成，細(xì)胞的數(shù)量正常，基質(zhì)染色輕度減少，潮線完整；6周時關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙、不規(guī)則，可見較多不規(guī)則裂隙，細(xì)胞數(shù)量彌漫性增多，基質(zhì)染色輕中度失染，局部潮線不完整；8周時關(guān)節(jié)軟骨表面較粗糙、不規(guī)則，可見部分關(guān)節(jié)軟骨血管翳形成，甚至裂隙深達(dá)關(guān)節(jié)軟骨的過渡層，細(xì)胞的數(shù)量輕度減少，基質(zhì)中度或重度失染，潮線不完整。

2.2 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨IL-1β、MMP-3、TIMP-1 mRNA比較 結(jié)果見表2。

表2 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨IL-1β、MMP-3、TIMP-1 mRNA表達(dá)量比較

與同組4周比較，*P<0.05；與同組6周比較，□P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與金鐵鎖組比較，○P<0.05；與空白組比較，☆P<0.05。

2.3 各組兔血漿IL-1β、MMP-3、TIMP-1蛋白比較 結(jié)果見表3。

表3 各組兔膝血漿IL-1β、MMP-3、TIMP-1蛋白水平比較

注：與同組4周比較，*P<0.05；與同組6周比較，△P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與金鐵鎖組比較，○P<0.05；與空白組比較，□P<0.05。

3 討論

OA已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織視為危害人類健康的“三大殺手”之一，給社會和家庭及個人帶來了巨大的傷害。OA好發(fā)于中老年人，多表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形等，癥狀較輕者可口服藥物及關(guān)節(jié)腔注射玻璃酸鈉，嚴(yán)重者只能行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)[15]。成功構(gòu)建膝OA動物模型是研究OA藥物治療、發(fā)病機(jī)制等的前提條件?，F(xiàn)有OA動物模型主要包括自發(fā)性和誘發(fā)性動物模型，最常用手術(shù)制模方法為改良Hulth法[16]，主要是通過切斷膝關(guān)節(jié)的前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)半月板以引起膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)及應(yīng)力改變等，進(jìn)一步構(gòu)建膝OA的動物模型。

目前OA發(fā)病機(jī)制不明確，其中一種觀點(diǎn)考慮為細(xì)胞因子所致。在OA形成過程中，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及滑膜等均可產(chǎn)生大量細(xì)胞因子破壞關(guān)節(jié)軟骨。IL-1β是由多種細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，主要參與細(xì)胞的免疫應(yīng)答和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能等[17]。IL-1β是OA發(fā)病過程中的重要炎癥因子之一，可通過一系列級聯(lián)反應(yīng)引起關(guān)節(jié)的破壞和炎癥反應(yīng)等，主要通過改變軟骨細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)與功能，調(diào)節(jié)蛋白水解酶的合成與分泌，加速膠原蛋白及聚蛋白多糖的降解，進(jìn)而誘發(fā)OA[18]。OA的發(fā)生、發(fā)展與諸多細(xì)胞信號通路也存在著密切的關(guān)系，其中MAPK信號通路是一組能被不同的細(xì)胞外刺激(如細(xì)胞因子、細(xì)胞應(yīng)激)激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶[19]。MAPK級聯(lián)激活是多種細(xì)胞信號通路的中心，在沒有受到信號刺激的細(xì)胞中，MAPK處于靜止?fàn)顟B(tài)；然而當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子(如IL-1β)等刺激時，MAPK接收MAPK激酶(MKK)和MAPK激酶激酶(MKKK)的活化信號而被激活，表現(xiàn)為逐級磷酸化的過程[20]。而MAPK細(xì)胞信號通路中的P38途徑也是導(dǎo)致OA發(fā)生的重要因素之一。研究[21]表明IL-β可通過激活P38信號通路進(jìn)一步誘導(dǎo)MMP-13的表達(dá)，降解關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)最后誘發(fā)OA。因此，研究阻斷P38信號通路的方法是防止OA軟骨退變的重要方向。MMP是一種具有鋅與鈣依賴性并在結(jié)構(gòu)上擁有高度同源性的內(nèi)肽酶家族，主要參與細(xì)胞外基質(zhì)膠原、蛋白多糖等成分的降解[22]。Jacques等[23]發(fā)現(xiàn)MMP-1、MMP-3、MMP-13等與OA病情的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。MMP-3對關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中的蛋白多糖具有高度的裂解活性，并可加速Ⅱ型膠原的降解，還能激活MMP-1、MMP-9等與OA相關(guān)的炎癥分子，引起一系列的級聯(lián)效應(yīng)，從而加速OA的病程進(jìn)展[24，25]。TIMP-1是MMP-3的特異性抑制劑，與MMP-3結(jié)合成1∶1的復(fù)合物，抑制MMP-3的活性及血管增殖，正常情況下兩者保持平衡[26]；如果失去相對平衡則關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中蛋白分解酶的活性增高，則引起關(guān)節(jié)軟骨的破壞，從而引發(fā)OA[27]。因此，通過調(diào)節(jié)MMP-3與TIMP-1之間平衡也是防治OA的重要研究方向之一。

金鐵鎖，別名獨(dú)定子、百步穿楊等，《滇南本草》最先記錄。研究[28]表明,金鐵鎖具有很高的藥用和經(jīng)濟(jì)價值；三萜、三萜皂苷、環(huán)肽等為中藥金鐵鎖的主要化學(xué)成分，此外還有氨基酸和有機(jī)酸等[29]。金鐵鎖入藥的主要部位為地下根，氣體微弱，味辛、麻，有刺喉感。金鐵鎖具有止痛、散瘀和消癰排膿等療效[30]。近年來，隨著各項研究的逐步深入，苗藥金鐵鎖作為一種傳統(tǒng)的民間藥物被逐漸重視。目前，對金鐵鎖的研究主要集中在化學(xué)成分、植物特性等方面，而其對OA及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等作用的相關(guān)研究較少。本課題的切入點(diǎn)主要是針對目前OA無明確的療效藥物入手，再者中醫(yī)藥逐漸被重視，據(jù)此進(jìn)行的深入研究。

與空白組比較，模型組膝關(guān)節(jié)肉眼觀及病理學(xué)變化明顯，且隨制模時間變化而變化；與模型組比較，氨基葡萄糖組、金鐵鎖組上述情況好轉(zhuǎn)，金鐵鎖組治療效果更佳。與空白組比較，模型組IL-1β、MMP-3、TIMP-1 mRNA及蛋白表達(dá)升高；與模型組比較，氨基葡萄糖組、金鐵鎖組IL-1β、MMP-3 mRNA及蛋白表達(dá)降低，TIMP-1表達(dá)升高；與氨基葡萄糖組比較，金鐵鎖組IL-1β、MMP-3 mRNA及蛋白表達(dá)降低，TIMP-1表達(dá)升高。提示金鐵鎖對兔膝OA有治療作用，其機(jī)制可能與下調(diào)IL-1β、MMP-3表達(dá)及上調(diào)TIMP-1表達(dá)有關(guān)。

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《山東醫(yī)藥》關(guān)于摘要與關(guān)鍵詞的說明

論著需附中、英文摘要(包括目的、方法、結(jié)果、結(jié)論四部分)。中文摘要300～500字，英文摘要400～500個實詞。英文摘要尚應(yīng)包括文題、作者姓名(漢語拼音)。論著、基礎(chǔ)研究、臨床研究、綜述與講座需標(biāo)引關(guān)鍵詞2～5個，盡量使用美國國立醫(yī)學(xué)圖書館編輯的最新版《Index Medicus》中醫(yī)學(xué)主題詞表(MeSH)所列的詞。英文關(guān)鍵詞中的縮寫詞應(yīng)按MeSH還原為全稱。

貴州省中醫(yī)藥管理局資助項目(QYZZ-2016-029)。

劉毅(E-mail: 13308529536@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.31.010

R684.3

A

1002-266X(2017)31-0036-05

2017-07-02)