• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    N-鈣黏蛋白抗體對毛霉菌絲感染人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞組織因子和血管性血友病因子表達(dá)水平的影響*

    2017-08-30 17:05:28徐升強(qiáng)劉少平王永濤王月芹蘇斌濤胡志敏
    微循環(huán)學(xué)雜志 2017年3期
    關(guān)鍵詞:毛霉共培養(yǎng)菌絲

    何 偉 徐升強(qiáng) 劉少平 王永濤 王月芹 蘇斌濤 胡志敏,#

    N-鈣黏蛋白抗體對毛霉菌絲感染人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞組織因子和血管性血友病因子表達(dá)水平的影響*

    何 偉1徐升強(qiáng)2劉少平3王永濤2王月芹2蘇斌濤2胡志敏2,#

    目的:觀察毛霉菌絲對人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HPMVEC)分泌凝血因子的影響及N-鈣黏蛋白抗體的干預(yù)作用。方法:取增殖期HPMVEC,分為毛霉菌絲感染模型組(毛霉菌絲組,用1×104CFU毛霉菌絲與HPMVEC在37℃、5% CO2飽和濕度下共培養(yǎng)12h)、人N-鈣黏蛋白單克隆抗體干預(yù)組[N-鈣黏蛋白抗體組,在HPMVEC與毛霉菌絲共培養(yǎng)前,先用該抗體(1mg/ml)與HPMVEC室溫作用1h,之后按毛霉菌絲組操作]和空白對照組(用無菌去離子水代替毛霉菌絲懸液,且不行N-鈣黏蛋白抗體作用,按毛霉菌絲組方法平行實驗)。分別于0h、1h、2h、6h、12h收集各組培養(yǎng)上清液,采用ELISA檢測其組織因子(TF)和血管性血友病因子(vWF)水平。結(jié)果:組內(nèi)比較,毛霉菌絲組TF和vWF水平隨培養(yǎng)時間增加而升高(均P<0.05或P<0.01);組間比較,毛霉菌絲組各時相TF和vWF水平均較空白對照組升高(P<0.05或P<0.01),而N-鈣黏蛋白抗體組各時相TF和vWF水平均較毛霉菌絲組顯著降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論:毛霉菌絲感染HPMVEC所致TF、vWF水平升高可被N-鈣黏蛋白單克隆抗體有效下調(diào),或可用于防治由毛霉菌絲感染引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血栓形成。

    N-鈣黏蛋白;不規(guī)則毛霉;人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞;組織因子;血管性血友病因子

    人體免疫功能損傷、介入性臨床診療、大劑量糖皮質(zhì)激素及廣譜抗生素的應(yīng)用等,使毛霉菌感染發(fā)病率呈上升趨勢[1-5],也是造成較多疾病療效差、病死率高的原因之一[1,2]。毛霉菌絲黏附血管內(nèi)皮細(xì)胞,引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷并促進(jìn)血栓形成,是毛霉菌絲血管侵襲性損害的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1-3]。N-鈣黏蛋白(N-Cadherin)作為內(nèi)皮細(xì)胞膜糖蛋白,能介導(dǎo)白色念珠菌黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞并被內(nèi)皮細(xì)胞吞噬[6,7],引起一系列包括凝血功能紊亂等病理變化。下調(diào)或拮抗N-鈣黏蛋白的介導(dǎo)作用可以阻止或減少由真菌菌絲感染引起的凝血功能增強(qiáng)和血栓形成[6,8]。本文采用N-鈣黏蛋白單克隆抗體預(yù)處理人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cell,HPMVEC)后,檢測毛霉菌絲與HPMVEC共培養(yǎng)12h內(nèi)不同時相培養(yǎng)上清中組織因子(Tissue Factor,TF)和血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)水平變化,為N-鈣黏蛋白單克隆抗體干預(yù)治療毛霉菌感染提供實驗依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 主要材料與試劑

    HPMVEC由武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心提供;不規(guī)則毛霉菌株由湖北省感染性皮膚病研究中心臨床分離[4]。N-鈣黏蛋白單克隆抗體(批號:ab76011)購自美國Abcam公司;沙堡弱培養(yǎng)基(批號:SAP-160120D)購自廣州迪景微生物科技有限公司;ELISA試劑盒(批號:HM11905、HM10062)和青霉素-鏈霉素雙抗(批號:J130071)購自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司;胎牛血清(批號:13011-8611)購自杭州四季青公司;改良杜氏伊格爾高糖培養(yǎng)基(DMEM,批號:11816005)購自美國Gibco公司;AccumaxTM細(xì)胞解離液(批號:6V2916A)購自上海信裕生物公司;毛霉菌絲DNA提取試劑盒(批號:077K6133)購自美國Sigma公司。完全培養(yǎng)基(青霉素100U/ml、鏈霉素10μg/ml雙抗及滅活10%胎牛血清加至含L-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基配制而成)。

    1.2 HPMVEC擴(kuò)增培養(yǎng)

    自液氮罐中取出HPMVEC置37℃水浴箱中復(fù)蘇后,接種于25ml完全培養(yǎng)基,37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng),隔天傳代1次。取第3代HPMVEC,用3ml AccumaxTM細(xì)胞解離液處理5min,加入5ml完全培養(yǎng)基中和后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×105CFV/ml作為實驗細(xì)胞懸液。取24孔培養(yǎng)板,每孔加入完全培養(yǎng)基800μl,再加入200μl HPMVEC懸液混勻,使成終濃度為1×104CFV/孔,繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁生長80%,呈多角形或長梭形時(圖1)棄去培養(yǎng)基,PBS洗3次備用。

    圖1 HPMVEC貼壁生長,呈多角形或長梭形(×400)

    1.3 毛霉菌絲的制備與鑒定

    取毛霉菌株接種于沙堡弱培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)7天后用細(xì)胞刮匙輕輕刮取菌落表面,用滅菌PBS沖洗,5000rpm離心10min收集毛霉菌絲,按照毛霉菌絲DNA提取試劑盒說明書提取毛霉菌絲DNA,將擴(kuò)增內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)產(chǎn)物送北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司純化及測序,經(jīng)NCBI核苷酸序列比對檢索,其與基因庫中不規(guī)則毛霉菌(CBS 103.93)株序列同源性為98%。遂用無血清DMEM將此毛霉菌絲稀釋至1×105CFU/ml,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 實驗分組及處理

    毛霉菌絲組:取上述制備好的HPMVEC,加入1×105CFU/ml的毛霉菌絲懸液100μl,再加入100μl完全培養(yǎng)基于24孔板,混勻后菌絲終濃度為1×104CFU/孔,置37℃、5% CO2、飽和濕度共培養(yǎng)(平行設(shè)置3孔),每隔1h觀察菌絲生長狀態(tài)及HPMVEC形態(tài)。N-鈣黏蛋白抗體組:HPMVEC與毛霉菌絲共培養(yǎng)前,以1∶100的抗人N-鈣黏蛋白單克隆抗體(1mg/ml)與HPMVEC室溫作用1h,吸出抗體,PBS洗3次,之后操作同毛霉菌絲組。空白對照組:用無菌去離子水代替毛霉菌絲懸液且不使用N-鈣黏蛋白抗體孵育,余按毛霉菌絲組方法平行操作。

    1.5 TF和vWF水平檢測方法

    分別收集各組共培養(yǎng)0h、1h、2h、6h、12h上清液,-80℃存儲批檢。采用ELISA嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。測量所有樣本光密度(OD)值,并以完全培養(yǎng)液作為空白對照。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

    2 結(jié) 果

    2.1 毛霉菌絲與HPMVEC共培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)的變化

    毛霉菌絲與HPMVEC共培養(yǎng)1h后即可黏附于細(xì)胞表面,至第12h,可見HPMVEC腫脹變形,部分細(xì)胞壞死,見圖2。

    圖2 毛霉菌絲與HPMVEC共培養(yǎng)對細(xì)胞形態(tài)的變化

    2.2 各組TF水平比較

    組內(nèi)比較:空白對照組各時相TF水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),毛霉菌絲組和N-鈣黏蛋白抗體組差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),且均隨共培養(yǎng)時間增加而升高(P<0.01)。毛霉菌絲組TF水平從培養(yǎng)1h到12h漸次顯著升高(t=3.49、36.32、16.34、20.96,P均<0.01)。N-鈣黏蛋白抗體組1h與0h差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),從2h到12h亦漸次升高(t=30.24、11.80、17.05, 均P<0.01))。組間比較:共培養(yǎng)0h的各組TF水平差異未見統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),1h-12h各組TF水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。毛霉菌絲組各時相TF水平明顯高于空白對照組(t=3.74、39.81、67.79、130.02,P均<0.05或P<0.01)。N-鈣黏蛋白抗體組各時相TF水平均較毛霉菌絲組顯著降低(t=-3.02、-10.56、-15.93、-30.52,P<0.05或P<0.01)。見表1。

    表1 各組不同時相TF水平比較均=3,ng/L)

    注:組內(nèi):與0h比較,1)P<0.01;與1h比較,2)P<0.01;與2h比較,3)P<0.01;與6h比較,4)P<0.01;組間:與空白對照組比較,5)P<0.05,6)P<0.01;與毛霉菌絲組比較,7)P<0.05,8)P<0.01。

    2.3 各組vWF水平比較

    組內(nèi)比較:空白對照組各時相vWF水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),毛霉菌絲組和N-鈣黏蛋白抗體組差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),且均隨共培養(yǎng)時間增加而升高(P<0.01)。毛霉菌絲組vWF水平從培養(yǎng)1h到12h漸次顯著升高(t=3.04、8.85、22.32、17.47,P<0.05或P<0.01)。N-鈣黏蛋白抗體組1h與0h差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),從2h到12h亦漸次升高(t=3.24、17.80、17.25,P<0.05或P<0.01)。組間比較:共培養(yǎng)0h的各組vWF水平差異未見統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),1h-12h各組vWF水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。毛霉菌絲組各時相vWF水平明顯高于空白對照組(t= 3.06、10.55、47.52、43.35,P<0.05或P<0.01)。N-鈣黏蛋白抗體組各時相vWF水平均較毛霉菌絲組顯著降低(t=-3.16、-8.91、-15.25、-19.59,P均<0.05)。見表2。

    表1 各組不同時相vWF水平比較均=3,ng/L)

    注:組內(nèi):與0h比較,1)P<0.01;與1h比較,2)P<0.01;與2h比較,3)P<0.01;與6h比較,4)P<0.01;組間:與空白對照組比較,5)P<0.05,6)P<0.01;與毛霉菌絲組比較,7)P<0.05,8)P<0.01。

    3 討 論

    正常生理條件下,血管內(nèi)皮細(xì)胞具有抗血栓和促血栓形成雙重功能,以抗血栓形成為主。毛霉菌絲能黏附并損傷人血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能[8],如使凝血介質(zhì)釋放增加等。TF釋放增加能激活內(nèi)源性凝血因子X和Ⅻ,促進(jìn)凝血酶原復(fù)合物的形成,并通過一系列酶促反應(yīng)啟動外源性凝血系統(tǒng),導(dǎo)致血液凝固或血栓形成[9]。vWF主要介導(dǎo)血小板與血管內(nèi)皮下膠原纖維黏附,亦可促進(jìn)血栓形成。本資料證實,HPMVEC與毛霉菌絲共培養(yǎng)1h,毛霉菌絲即黏附于HPMVEC,致細(xì)胞間隙增大及培養(yǎng)上清中TF、vWF水平顯著升高,繼續(xù)培養(yǎng)至12h,HPMVEC損傷加重,出現(xiàn)細(xì)胞腫脹壞死;培養(yǎng)上清中TF、vWF水平也隨培養(yǎng)時間延長而明顯升高。表明毛霉菌感染可引起機(jī)體凝血功能異常增加,是血栓形成的危險因素。

    毛霉菌絲侵入血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致凝血功能增強(qiáng)及至血栓形成的機(jī)制目前尚不明確,有研究[10,11]認(rèn)為可能與內(nèi)皮細(xì)胞膜表面蛋白受體對毛霉菌絲的結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān);而N-鈣黏蛋白在此起到重要作用,因其表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面,可調(diào)節(jié)鈣介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附,參與細(xì)胞間的識別和信號傳導(dǎo)機(jī)制。因此,下調(diào)或拮抗N-鈣黏蛋白的介導(dǎo)作用既可驗證其病理機(jī)制,更能減少或阻止毛霉菌感染引起的凝血功能增強(qiáng)或血栓形成。故本研究采用人N-鈣黏蛋白單克隆抗體先行HPMVEC封閉處理后再與毛霉菌絲共培養(yǎng),結(jié)果顯示培養(yǎng)上清TF、vWF水平比未先行處理的毛霉菌絲組顯著降低,進(jìn)一步說明N-鈣黏蛋白參與了毛霉菌絲的致病過程,采用N-鈣黏蛋白單克隆抗體可抑制毛霉菌絲的病理效應(yīng)。

    綜上,毛霉菌絲感染HPMVEC可促進(jìn)其血栓介質(zhì)的分泌和釋放,是血栓形成的危險因素;N-鈣黏蛋白單克隆抗體通過拮抗N-鈣黏蛋白,可有效下調(diào)TF、vWF表達(dá)水平,從而起到保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、防治血栓形成的作用。

    本文第一作者簡介:

    何 偉(1977-),男,漢族,碩士,主管藥師,主要從事臨床藥學(xué)工作

    1 Mengji AK,Yaga US, Gollamudi N, et al. Mucormycosis in a surgical defect masquerading as osteomyelitis: a case report and review of literature[J]. Pan Afr Med J,2016,23(16):1-10.

    2 Ibrahim AS, Spellberg B, Walsh TJ, et al. Pathogenesis of Mucormycosis[J].Clin Infect Dis,2012,54(Suppl 1):S16-S22.

    3 Wang Q, Liu B, Yan Y. Disseminated mucormycosis(DM) after pneumonectomy: a case report[J]. BMC Infect Dis,2016,16(1):337.

    4 胡志敏,王 玥,周飛紅,等.原發(fā)性皮膚毛霉病一例[J].中華皮膚科雜志,2010,43(4):259-262.

    5 Phan QT, Eng DK, Mostowy S, et al. Role of endothelial cell septin 7 in the endocytosis of candida albicans[J]. MBio,2013,4(6):e513-e542.

    6 Bain JM, Louw J, Lewis LE, et al. Candida albicans hypha formation and mannan masking of beta-glucan inhibit macrophage phagosome maturation[J]. MBio,2014,5(6):e1 874.

    7 Ziaee A, Zia M, Bayat M, et al. Molecular Identification of mucor and lichtheimia species in pure cultures of zygomycetes[J]. Jundishapur J Microbiol,2016,9(4):e35 237.

    8 Bellanger A, Tatara AM, Shirazi F, et al. Statin concentrations below the minimum inhibitory concentration attenuate the virulence of rhizopus oryzae[J]. J Infect Dis,2016,214(1):114-121.

    9 Grosser M, Magdolen V, Baretton G, et al. Gene expression analysis of HUVEC in response to TF-binding[J]. Thromb Res,2011,127(3):259-263.

    10 Khan OF, Sefton MV. Endothelialized biomaterials for tissue engineering applications in vivo[J]. Trends in Biotechnol,2011,29(8):379-387.

    11 Qin Y, Zhang L, Xu Z, et al. Innate immune cell response upon Candida albicans infection[J]. Virulence,2016,7(5):512-526.

    Effect of N-cadherin Antibody on TF and vWF Expression by HPMVEC Infected with Mucor Irregularis

    HE Wei1, XU Sheng-qiang2, LIU Shaoping3, WANG Yong-tao2, WANG Yue-qin2, SU Bin-tao2, HU Zhi-min2,#

    1Department of Pharmacy;2Department of Laboratory Medicine,Wuhan No.1 Hospital,Wuhan 430022,China;3Center of Medicine Science Research, Zhongnan Hospital of Wuhan University,Wuhan 430071, China;#

    Objective: To investigate the effect of mucor hypha on human pulmonary microvascular endothelial cell (HPMVEC) and the intervention of N-cadherin antibody. Method: The proliferative phase of HPMVEC, divided into mucor infection model group (mucor hypha group, 1×104CFU mucor hypha and HPMVEC co-culture at 37℃,5% CO2and saturated humidity for 12h ),N-cadherin monoclonal antibody intervention group (N-cadherin antibody group, HPMVEC and 1mg/ml N-cadherin antibody co-culture at room temperature for 1h, before the infection of mucor hypha, then followed by mucor hypha group operation) and blank control group (sterile deionized water instead of mucor hypha,and the absence of the N-cadherin antibody, then followed the mucor hypha group method of parallel experiment. The supernatant of each group was collected at 0h, 1h, 2h, 6h and 12h, and the levels of TF and vWF were detected by ELISA. Results: Comparison with groups, the levels of TF and vWF secreted in the supernatants of the mucor hypha group were significantly increased as time-dependent(P<0.05 orP<0.01). Comparison between groups, the levels of TF and vWF secreted in the supernatants of the mucor hypha group were sig-nificantly higher than the blank control group at each time point(P<0.05 orP<0.01), and after incubated with N-cadherin monoclonal antibody, the levels of TF and vWF released in the supernatants were significantly lower than the untreated mucor hypha group at each time point(P<0.05 orP<0.01).Conclusion: The increased level of TF and vWF induced by mucor hypha infected with HPMVEC, which can be effectively down-regulated by N- cadherin monoclonal antibody,it suggested the N-cadherin monoclonal antibody can be used to prevent the injury and thrombosis of vascular endothelial cells caused by infection of mucor hypha.

    N-cadherin; Mucor Irregularis; HPMVEC; TF; vWF

    湖北省衛(wèi)計委科研項目(WJ2015MB239);武漢市衛(wèi)計委科研項目(WX14D02,WZ16D07)

    湖北省武漢市第一醫(yī)院,武漢 430022;1藥學(xué)部;2檢驗科;3武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心;#

    ,E-mail:mycohu@163.com

    本文2017-02-16收到,2017-05-30修回

    R363.2

    A

    1005-1740(2017)03-0026-05

    猜你喜歡
    毛霉共培養(yǎng)菌絲
    曲霉豆豉和毛霉豆豉理化指標(biāo)和風(fēng)味物質(zhì)差異分析
    羊肚菌母種培養(yǎng)基配方的優(yōu)化研究
    中國被毛孢三種菌絲形態(tài)的超顯微特征觀察
    BMSCs-SCs共培養(yǎng)體系聯(lián)合異種神經(jīng)支架修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的研究
    紫錐菊不定根懸浮共培養(yǎng)中咖啡酸衍生物積累研究
    甘露醇對低溫下草菇菌絲的保護(hù)效應(yīng)研究
    宜賓豆腐乳毛霉分離及應(yīng)用
    新型抗菌肽菌絲霉素純化工藝研究
    廣東飼料(2016年5期)2016-12-01 03:43:21
    角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系的建立
    米黑毛霉產(chǎn)凝乳酶固體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化
    亚洲伊人久久精品综合| 热99久久久久精品小说推荐| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产男女超爽视频在线观看| 超碰97精品在线观看| av网站在线播放免费| av线在线观看网站| 男女国产视频网站| 捣出白浆h1v1| 亚洲精品日本国产第一区| 久久九九热精品免费| 免费高清在线观看日韩| 国产av精品麻豆| 欧美精品高潮呻吟av久久| 日韩制服骚丝袜av| 久久鲁丝午夜福利片| 欧美精品高潮呻吟av久久| 又大又爽又粗| 国产亚洲欧美精品永久| 国产成人一区二区在线| 精品福利观看| 国产男女内射视频| 亚洲av日韩在线播放| 丝袜喷水一区| 2021少妇久久久久久久久久久| 最新的欧美精品一区二区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 男女边摸边吃奶| 亚洲国产精品国产精品| 国产1区2区3区精品| 日本色播在线视频| 一二三四社区在线视频社区8| 日本欧美国产在线视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产成人av激情在线播放| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 夫妻午夜视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 女性被躁到高潮视频| xxx大片免费视频| 国产成人精品无人区| 青春草视频在线免费观看| 在线 av 中文字幕| 啦啦啦在线观看免费高清www| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| www.999成人在线观看| 搡老乐熟女国产| 午夜免费男女啪啪视频观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| av在线app专区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 三上悠亚av全集在线观看| 操美女的视频在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 性少妇av在线| 性色av乱码一区二区三区2| 一区二区日韩欧美中文字幕| 97人妻天天添夜夜摸| 777米奇影视久久| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲av美国av| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 一级片免费观看大全| 18禁观看日本| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | av天堂在线播放| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 色网站视频免费| 亚洲国产精品999| 国产精品久久久久久精品古装| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲av综合色区一区| a级毛片黄视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 成人手机av| 久久国产精品影院| 不卡av一区二区三区| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲国产精品999| 亚洲国产成人一精品久久久| 又黄又粗又硬又大视频| 久久影院123| 大码成人一级视频| 免费看十八禁软件| 黄色一级大片看看| 国产一区有黄有色的免费视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 日本vs欧美在线观看视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 黄色视频不卡| 精品亚洲成国产av| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 成人亚洲精品一区在线观看| 国产又爽黄色视频| 在线观看www视频免费| 国产在视频线精品| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲av成人精品一二三区| 伊人亚洲综合成人网| 在线天堂中文资源库| 免费少妇av软件| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美人与性动交α欧美软件| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲免费av在线视频| 18在线观看网站| 国产熟女欧美一区二区| 人妻一区二区av| 久久久国产欧美日韩av| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 一级毛片我不卡| 丰满迷人的少妇在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲七黄色美女视频| 免费看不卡的av| 欧美精品高潮呻吟av久久| 9热在线视频观看99| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 精品一区二区三卡| 丝袜脚勾引网站| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 一区二区三区精品91| 国产成人精品无人区| 五月开心婷婷网| 人妻 亚洲 视频| 男女午夜视频在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产成人精品久久二区二区免费| 9色porny在线观看| 男女边摸边吃奶| 99re6热这里在线精品视频| 成年av动漫网址| 欧美日韩精品网址| 午夜免费鲁丝| 国产亚洲欧美精品永久| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲人成77777在线视频| 91精品三级在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 在线观看免费高清a一片| 99国产综合亚洲精品| 精品人妻1区二区| 一级黄片播放器| 老司机深夜福利视频在线观看 | 久久中文字幕一级| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 婷婷色av中文字幕| 91麻豆av在线| 精品国产一区二区久久| 久久性视频一级片| 欧美精品一区二区大全| 女人久久www免费人成看片| 午夜免费男女啪啪视频观看| 人妻 亚洲 视频| 午夜福利免费观看在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲一区二区三区欧美精品| 天堂中文最新版在线下载| 国产在线免费精品| 久久久国产精品麻豆| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产免费现黄频在线看| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲第一青青草原| 成人亚洲欧美一区二区av| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 伊人亚洲综合成人网| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 久久久欧美国产精品| 90打野战视频偷拍视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 母亲3免费完整高清在线观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲av日韩在线播放| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一级,二级,三级黄色视频| 最新的欧美精品一区二区| 两性夫妻黄色片| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 黑人猛操日本美女一级片| 欧美另类一区| 国产免费一区二区三区四区乱码| a级毛片黄视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 欧美 日韩 精品 国产| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 大码成人一级视频| 老鸭窝网址在线观看| 国产一区二区三区av在线| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 少妇人妻久久综合中文| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产高清国产精品国产三级| 午夜福利影视在线免费观看| 在线观看免费高清a一片| 日日爽夜夜爽网站| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 啦啦啦啦在线视频资源| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产不卡av网站在线观看| 一个人免费看片子| 国产淫语在线视频| 久久久欧美国产精品| 亚洲中文av在线| 日韩av在线免费看完整版不卡| 中国美女看黄片| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 久久99热这里只频精品6学生| 国产精品久久久久久精品电影小说| 嫩草影视91久久| 精品国产一区二区三区四区第35| av在线老鸭窝| 久久久欧美国产精品| 国产精品一区二区在线观看99| 18在线观看网站| 精品一品国产午夜福利视频| 99国产精品一区二区三区| 欧美性长视频在线观看| 老司机在亚洲福利影院| 十八禁高潮呻吟视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲人成77777在线视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 婷婷丁香在线五月| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 中文字幕亚洲精品专区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久久国产欧美日韩av| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 久久久久精品国产欧美久久久 | 首页视频小说图片口味搜索 | 亚洲精品国产区一区二| 婷婷色综合www| 一区二区三区乱码不卡18| 丰满少妇做爰视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 18禁观看日本| 亚洲av在线观看美女高潮| 日韩av在线免费看完整版不卡| 黄片小视频在线播放| 人体艺术视频欧美日本| 青草久久国产| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲精品久久午夜乱码| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 美女福利国产在线| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 成人亚洲欧美一区二区av| 日韩人妻精品一区2区三区| 成人国语在线视频| 一级片'在线观看视频| 色播在线永久视频| 黄色 视频免费看| 国产午夜精品一二区理论片| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 一级片'在线观看视频| 9色porny在线观看| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲精品国产区一区二| 国产欧美日韩一区二区三 | 久久精品国产a三级三级三级| 蜜桃在线观看..| 久久久久久久久久久久大奶| 一本色道久久久久久精品综合| av在线播放精品| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久久欧美国产精品| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲av综合色区一区| 制服诱惑二区| 亚洲欧美激情在线| 欧美人与善性xxx| 国产精品一区二区在线不卡| www.精华液| 精品高清国产在线一区| 国产亚洲一区二区精品| 一区福利在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 久久久久久久大尺度免费视频| 一区福利在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 精品国产国语对白av| 午夜免费成人在线视频| 国产男女超爽视频在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲成人免费av在线播放| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产一区二区三区av在线| 国产人伦9x9x在线观看| 国产视频一区二区在线看| 久久久欧美国产精品| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产老妇伦熟女老妇高清| 少妇精品久久久久久久| 国产男女超爽视频在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 晚上一个人看的免费电影| www.av在线官网国产| 国产极品粉嫩免费观看在线| 男男h啪啪无遮挡| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 色94色欧美一区二区| 免费在线观看黄色视频的| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 在线观看一区二区三区激情| 精品国产乱码久久久久久男人| 在线av久久热| 午夜福利视频精品| 国产片特级美女逼逼视频| 国产日韩欧美在线精品| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产色视频综合| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 亚洲欧美一区二区三区国产| 赤兔流量卡办理| 久久九九热精品免费| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲欧洲日产国产| 久热爱精品视频在线9| 1024香蕉在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产免费视频播放在线视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 成年人免费黄色播放视频| 免费在线观看黄色视频的| 免费在线观看日本一区| 亚洲成人免费电影在线观看 | 精品久久蜜臀av无| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 国产精品一区二区精品视频观看| 考比视频在线观看| 成年人黄色毛片网站| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| av欧美777| 国产亚洲精品久久久久5区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 一级黄色大片毛片| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 婷婷色av中文字幕| 五月开心婷婷网| 亚洲av成人精品一二三区| 在线观看免费高清a一片| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲国产欧美一区二区综合| 日韩av免费高清视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 高清视频免费观看一区二区| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产成人免费无遮挡视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲九九香蕉| 亚洲免费av在线视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲国产精品999| 欧美日韩福利视频一区二区| 热re99久久国产66热| 亚洲国产精品国产精品| 国产成人精品久久久久久| 国产高清国产精品国产三级| 欧美亚洲日本最大视频资源| 成人亚洲精品一区在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 美女国产高潮福利片在线看| 乱人伦中国视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 精品人妻一区二区三区麻豆| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产亚洲一区二区精品| 国产欧美亚洲国产| 爱豆传媒免费全集在线观看| 精品福利观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲精品日本国产第一区| 999久久久国产精品视频| 丝袜喷水一区| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产高清国产精品国产三级| 999精品在线视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲男人天堂网一区| 性少妇av在线| 9热在线视频观看99| 尾随美女入室| 操出白浆在线播放| 超碰成人久久| 99国产精品免费福利视频| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 青春草视频在线免费观看| 亚洲天堂av无毛| 欧美性长视频在线观看| 黄片小视频在线播放| 亚洲av成人精品一二三区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国精品久久久久久国模美| avwww免费| 中文字幕人妻熟女乱码| 日韩免费高清中文字幕av| 国产xxxxx性猛交| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 操出白浆在线播放| 国精品久久久久久国模美| 建设人人有责人人尽责人人享有的| h视频一区二区三区| 亚洲黑人精品在线| 99热国产这里只有精品6| 久久青草综合色| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产欧美日韩一区二区三 | 国产一区二区 视频在线| 成年人午夜在线观看视频| 91成人精品电影| 五月开心婷婷网| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产精品欧美亚洲77777| 高清欧美精品videossex| 亚洲av在线观看美女高潮| av有码第一页| av福利片在线| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲少妇的诱惑av| 美女高潮到喷水免费观看| 69精品国产乱码久久久| 欧美久久黑人一区二区| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲第一av免费看| 免费高清在线观看日韩| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 午夜免费男女啪啪视频观看| 少妇人妻久久综合中文| 欧美成人午夜精品| 欧美日韩综合久久久久久| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲少妇的诱惑av| 国产黄频视频在线观看| 女性被躁到高潮视频| 美女高潮到喷水免费观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久久久久久大尺度免费视频| 精品福利永久在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 精品免费久久久久久久清纯 | 日日夜夜操网爽| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 9热在线视频观看99| 色94色欧美一区二区| 免费av中文字幕在线| 99久久人妻综合| 国产一区二区三区av在线| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产免费现黄频在线看| 制服人妻中文乱码| 美女午夜性视频免费| 少妇人妻 视频| 9热在线视频观看99| 黑丝袜美女国产一区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产淫语在线视频| 日韩制服骚丝袜av| 一边摸一边做爽爽视频免费| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产一区二区 视频在线| 久久狼人影院| e午夜精品久久久久久久| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 99久久综合免费| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美中文综合在线视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美精品一区二区免费开放| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 看十八女毛片水多多多| 9色porny在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 久久国产精品影院| 中文字幕人妻丝袜制服| av国产精品久久久久影院| 国产欧美日韩一区二区三 | 人成视频在线观看免费观看| 亚洲成人手机| 99国产精品免费福利视频| 亚洲欧洲日产国产| 国产在线观看jvid| 日韩制服骚丝袜av| 免费在线观看影片大全网站 | 欧美精品av麻豆av| 美女午夜性视频免费| 日韩制服骚丝袜av| 黄色 视频免费看| 一级,二级,三级黄色视频| 成年人午夜在线观看视频| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲色图综合在线观看| 宅男免费午夜| √禁漫天堂资源中文www| 极品少妇高潮喷水抽搐| 观看av在线不卡| 久久久久久免费高清国产稀缺| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产精品熟女久久久久浪| 国产精品一区二区在线观看99| 国产99久久九九免费精品| a级片在线免费高清观看视频| 大片电影免费在线观看免费| 在线观看人妻少妇| 人人妻人人澡人人看| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 欧美精品啪啪一区二区三区 | 欧美精品高潮呻吟av久久| 又大又黄又爽视频免费| 激情视频va一区二区三区| 国产黄色免费在线视频| 9热在线视频观看99| 国产免费福利视频在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 黄色一级大片看看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲精品一二三| 久久ye,这里只有精品| 久久毛片免费看一区二区三区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲精品乱久久久久久| 国产日韩欧美亚洲二区| 女警被强在线播放| 午夜精品国产一区二区电影| 日本av免费视频播放| 国产亚洲av高清不卡| 男的添女的下面高潮视频| 老司机亚洲免费影院| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产在视频线精品| 国产男女超爽视频在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲av片天天在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 欧美中文综合在线视频| 久久亚洲精品不卡| 亚洲综合色网址| 十八禁高潮呻吟视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲伊人色综图| 精品久久久久久电影网| 乱人伦中国视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲成人免费电影在线观看 | 97人妻天天添夜夜摸| 一级片免费观看大全| 黄色视频在线播放观看不卡| av网站免费在线观看视频| 99国产精品一区二区三区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 在现免费观看毛片| 国产成人精品久久久久久| 国产精品久久久久成人av| 99精国产麻豆久久婷婷| netflix在线观看网站| 亚洲第一青青草原| 欧美大码av| 国产av一区二区精品久久| 高清av免费在线| 在线观看一区二区三区激情| 久久久久国产一级毛片高清牌| 日本欧美视频一区|