莆田南日島泥東風(fēng)螺的形態(tài)、DNA條形碼和同工酶初步分析

王朋云

(莆田市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，福建 莆田 351100)

莆田南日島泥東風(fēng)螺的形態(tài)、DNA條形碼和同工酶初步分析

王朋云

(莆田市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，福建 莆田 351100)

為了解莆田南日島泥東風(fēng)螺(Babylonialutosa)種質(zhì)情況，采集泥東風(fēng)螺養(yǎng)殖群體，對(duì)其樣本的殼高(H)、殼寬(B)、體重(W)數(shù)量性狀進(jìn)行測量、推導(dǎo)關(guān)系式，以線粒體16S rRNA與COI、核18S rRNA與18S-28S rRNA基因?yàn)榘行蛄羞M(jìn)行擴(kuò)增和測序，結(jié)合同源序列與同屬的其他7種東風(fēng)螺或蛾螺總科(Buccinoidea)相關(guān)序列比對(duì)計(jì)算，以蠑螺屬(Turbo)中華蠑螺(T.chinensis)作外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并提取樣本個(gè)體的酯酶(EST)、蘋果酸酶(ME)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)和異檸檬酸脫氫酶(IDH)進(jìn)行同工酶多態(tài)性分析。結(jié)果表明，南日島泥東風(fēng)螺(B.lutosa)個(gè)體之間殼面斑塊不規(guī)則、螺殼形態(tài)差異不明顯；系統(tǒng)發(fā)育樹顯示在東風(fēng)螺屬內(nèi)泥東風(fēng)螺和臺(tái)灣東風(fēng)螺(B.formosae)優(yōu)先聚支、親緣關(guān)系最近；個(gè)體間EST、SOD和IDH電泳觀察到酶位點(diǎn)表達(dá)多態(tài)性，ME、LDH和MDH檢測未發(fā)現(xiàn)酶帶數(shù)多態(tài)性，僅存在酶活性表達(dá)差異。

泥東風(fēng)螺；形態(tài)；DNA條形碼；同工酶

泥東風(fēng)螺(Babylonialutosa)隸屬于腹足綱(Gastropoda)新進(jìn)腹足超目(Caenogastropoda)高腹足總目(Hypsogastropoda)新腹足目(Neogastropoda)蛾螺總科(Buccinoidea)蛾螺科(Buccinidae)東風(fēng)螺屬(Babylonia)，其肉質(zhì)營養(yǎng)豐富、鮮脆爽口、風(fēng)味獨(dú)特，食用價(jià)值較高，是中國東南沿海優(yōu)質(zhì)的經(jīng)濟(jì)貝類之一，因而在莆田地區(qū)泥東風(fēng)螺(B.lutosa)的規(guī)?；B(yǎng)殖熱潮持續(xù)上升。目前，國內(nèi)對(duì)泥東風(fēng)螺的研究多集中在育苗[1-2]、生長特性[3-5]、重金屬毒性試驗(yàn)[6]、消化酶活性[7]、核型[8]、底播測產(chǎn)[9]和增殖放流[10-11]等方面，而關(guān)于序列多態(tài)[12]和同工酶方面的報(bào)道相對(duì)較少。東風(fēng)螺屬的幾個(gè)種，其在外殼顏色、花紋等形態(tài)特征方面極為相似，且易受棲息環(huán)境影響而變化，僅憑經(jīng)驗(yàn)觀察其外部形態(tài)進(jìn)行種質(zhì)資源多樣性調(diào)研是十分困難的，易產(chǎn)生分歧，阻礙了親本選育和養(yǎng)殖、標(biāo)準(zhǔn)制定工作的順利開展。DNA分子標(biāo)記、同工酶生化標(biāo)記分析物種遺傳特征，是分類和遺傳多樣性研究中除傳統(tǒng)形態(tài)標(biāo)記外最常用的輔助方法，二者結(jié)合形態(tài)特征應(yīng)用可有效協(xié)助提高樣本種質(zhì)資源分析的準(zhǔn)確性。

作者通過測量來自南日島泥東風(fēng)螺的3個(gè)貝殼形態(tài)特征，克隆其4條基因條形碼與蛾螺總科內(nèi)部分相關(guān)序列片段的多態(tài)性、堿基組成特性或系統(tǒng)親緣關(guān)系進(jìn)行比較及6種同工酶的初步電泳分析，以期為今后南日島泥東風(fēng)螺種質(zhì)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及地方標(biāo)準(zhǔn)的制定、群體遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性研究等提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用的泥東風(fēng)螺于2014年7—10月分批采自福建省莆田市秀嶼區(qū)南日鎮(zhèn)浮葉村養(yǎng)殖場，每批隨機(jī)取30個(gè)以上色澤鮮亮、活力較好的個(gè)體為樣本，連續(xù)充氣暫養(yǎng)1～2 d，期間只換水不投喂。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)測定

用過濾海水輕柔地清洗泥東風(fēng)螺外殼的附著物，吸水紙拭干后置于白瓷盤內(nèi)，測量其殼高(H)、殼寬(B)和個(gè)體鮮重(W)，測量工具為游標(biāo)卡尺(精確度0.02 mm)、電子天平(精準(zhǔn)度0.000 1 g)，每個(gè)指標(biāo)的測量個(gè)數(shù)在30枚以上。測量的數(shù)據(jù)以Excel軟件進(jìn)行整理，計(jì)算平均值、分析群體樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差并求出各性狀之間的關(guān)系式。

1.2.2 DNA條形碼

樣本經(jīng)滅菌海水清洗后，立即解剖取新鮮腹足肌肌肉組織，采用TIANGEN海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取基因組DNA。選用NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的無脊椎動(dòng)物、近緣種類的16S rRNA、COI和18S-28S rRNA基因通用或特異引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用Thermo Scientific Dream Taq Green PCR Master Mix(2×)，PCR反應(yīng)體系為20 μL，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性6 min；95℃變性1 min，50～60℃退火1 min，72℃延伸1～3 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳、SYBR Green I染色后紫外燈下分別切取目的條帶，采用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)回收，克隆后送交生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行多輪雙向測序。測序結(jié)果采用NCBI blastn在線程序分析核酸序列同源性，Clustal X package對(duì)位分析多序列，中華蠑螺(Turbochinensis)為外群，MEGA 4.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Kimura 2-parameter 計(jì)算遺傳距離(bootstrap值重復(fù)1 000次)。

表1 用于泥東風(fēng)螺16S rRNA、COI、18S rRNA和18S-28S rRNA基因擴(kuò)增的引物

1.2.3 同工酶電泳

泥東風(fēng)螺樣本經(jīng)雙蒸水清洗后，立即解剖，稱取0.5 g新鮮腹足肌肌肉組織，加入3倍體積、4℃預(yù)冷的PBS液冰浴剪碎，并充分冰浴勻漿，4℃冰箱中抽提1.0 h，離心(4℃、14 000 r/min、15 min)2次至上清液澄清，取上清液分裝，置4℃保存?zhèn)溆?。?yīng)用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳方法對(duì)泥東風(fēng)螺肌肉組織中的EST、ME、SOD、LDH、MDH和IDH同工酶進(jìn)行分析，根據(jù)目的蛋白分子量選擇合適的分離膠(pH 8.8，8.2%)和濃縮膠(pH 6.8，3.6%)，制膠凝固2 h，將新稀釋的1×Tris-Gly電泳緩沖液倒入電泳槽，10 μL上清液與等體積甘油加樣緩沖液混勻注入凝膠孔道，移入4℃冰箱內(nèi)，設(shè)置參數(shù)(90 V、40 mA、4～8 h)進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后膠板浸入新配制的染液[13]，按不同酶染規(guī)程要求(溫度、避光等)振蕩染色至條帶清晰，經(jīng)雙蒸水輕柔沖洗干凈、7%～10%冰醋酸脫色后采集圖像信息。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)測定

泥東風(fēng)螺樣本主要為2齡貝33枚，個(gè)體之間殼面紅褐色斑塊不規(guī)則(圖1)，另含1.8齡貝3枚、2.3齡貝3枚，群體樣本總數(shù)共計(jì)39枚。經(jīng)測量計(jì)算，所采南日島泥東風(fēng)螺群體樣本的殼高(H)為2.00～5.25 cm，平均為(3.65±0.51)cm；殼寬(B)為1.22～2.86 cm，平均為(2.18±0.28)cm；體重(W)為2.08～22.17 g，平均為(8.66±3.36)g；殼高為殼寬的1.57～1.84倍，平均為(1.67±0.06)倍。殼高、殼寬關(guān)系式為B=0.678 2H0.901 4(R2=0.950 2)，體重、殼高關(guān)系式為W=0.600 5e0.713 7H(R2=0.959 3)，體重、殼寬關(guān)系式為W=0.448 0e1.330 8B(R2=0.972 6)，關(guān)系式R2值顯示群體樣品個(gè)體間螺殼形態(tài)存在的差異程度較不明顯，殼高(H)、殼寬(B)和體重(W)3個(gè)表型性狀兩兩間的相關(guān)性均較高。

2.2 DNA條形碼

依據(jù)DL2000 Plus DNA Marker電泳分子量判別泥東風(fēng)螺樣品的16S rRNA、COI、18S rRNA和18S-28S rRNA基因疑似目的條帶，目標(biāo)基因序列經(jīng)雙向測序、拼接、去除引物后，分子量分別為510 bp(16S rRNA)、658 bp(COI)、1 787 bp(18S rRNA)和2 570 bp/2 576 bp(18S-28S rRNA)，提交GenBank數(shù)據(jù)庫獲得登錄號(hào)KM411961(16S rRNA)、KM411963(COI)、KX185514(18S rRNA)和KX656904/KX656905(18S-28S rRNA)。核酸序列同源性在線比對(duì)表明，KM411961與數(shù)據(jù)庫中其余4條泥東風(fēng)螺相關(guān)序列相似性在99.6%以上，種內(nèi)距離(0.003 2±0.004 1)，其中保守位點(diǎn)506個(gè)，變異位點(diǎn)4個(gè)，占總數(shù)0.8%，沒有簡約信息位點(diǎn)，自裔位點(diǎn)4個(gè)，A、T、C、G、(A+T)堿基平均含量分別為35.3%、29.6%、15.1%、20.0%、64.9%，(A+T)含量明顯高于(G+C)，沒有插入和缺失位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換突變的核苷酸位點(diǎn)2個(gè)，方式為C-T、T-C各1個(gè)，顛換突變的核苷酸位點(diǎn)2個(gè)，方式為A-T、T-A各1個(gè)，轉(zhuǎn)換與顛換比為1.0；KM411963和另3條同源序列相似性大于97.8%，種內(nèi)距離為(0.005 4±0.002 9)，其中保守位點(diǎn)652個(gè)，變異位點(diǎn)6個(gè)(0.9%)，簡約信息位點(diǎn)3個(gè)，自裔位點(diǎn)3個(gè)，A、T、C、G、(A+T)堿基平均含量分別為24.5%、38.2%、18.4%、18.9%、62.7%，AT含量偏倚明顯，編碼氨基酸的3個(gè)密碼子Pos #1、Pos #2和Pos #3中，堿基T的含量均為最高，依次為Pos #1(42.4%)>Pos #2(42.0%)>Pos #3(30.2%)，Pos #3中A、T、C、G的比例分別為21.5%、30.2%、20.9%、27.4%，插入位點(diǎn)1個(gè)(12堿基小片段)，沒有缺失位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換突變的核苷酸位點(diǎn)6個(gè)，轉(zhuǎn)換方式以A-G為主3個(gè)，其余C-T、T-C、G-A各1個(gè)，沒有顛換突變的核苷酸位點(diǎn)；KX185514與庫中的1條種內(nèi)序列相似性達(dá)100.0%，種內(nèi)距離為0.000 0，其中保守位點(diǎn)1 787個(gè)，沒有變異位點(diǎn)、簡約信息位點(diǎn)及自裔位點(diǎn)，A、T、C、G、(A+T)堿基平均含量分別為24.3%、25.0%、23.2%、27.5%、49.3%，(A+T)含量稍低于(G+C)，堿基組成偏向性不明顯，沒有插入和缺失位點(diǎn)、轉(zhuǎn)換和顛換突變的核苷酸位點(diǎn)；KX656904/KX656905暫未檢索到有種內(nèi)同源序列公布，二者相似性為99.7%，種內(nèi)距離0.001 6，其中保守位點(diǎn)2 566個(gè)，變異位點(diǎn)4個(gè)(0.2%)，沒有簡約信息位點(diǎn)、自裔位點(diǎn)，A、T、C、G、A+T堿基平均含量分別為20.2%、20.8%、28.0%、31.1%、41.0%，(A+T)含量明顯低于(G+C)，插入位點(diǎn)2個(gè)(3堿基小片段)，沒有缺失位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換突變的核苷酸位點(diǎn)1個(gè)，方式為C-T，顛換突變的核苷酸位點(diǎn)3個(gè)，方式為C-G，轉(zhuǎn)換與顛換比為0.3。序列同源性分析表明南日島泥東風(fēng)螺與數(shù)據(jù)庫樣本間存在不同程度的遺傳變異，由大到小依次為COI>16S rRNA>18S-28S rRNA>18S rRNA。

以中華蠑螺的相應(yīng)序列為外群，同GenBank中檢索到的東風(fēng)螺屬(Babylonia)或蛾螺總科(Buccinoidea)相關(guān)序列(均無內(nèi)含子)進(jìn)行對(duì)位排序、去除兩端部分堿基、計(jì)算遺傳距離值，構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。東風(fēng)螺屬16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹明顯分為兩個(gè)簇群，即KM411961(莆田南日島)與泥東風(fēng)螺序列AB044255(東中國海)、HQ424447(海南臨高)、HQ833937(福州福清)和KF897830(廣西北海)先聚類成一支，再同臺(tái)灣東風(fēng)螺(B.formosae)序列DQ314762聚集、節(jié)點(diǎn)支持率100%，而后與日本東風(fēng)螺(B.japonica)序列LC155101形成一個(gè)簇群；南洋象牙鳳螺(B.lani)序列HQ424448則與方斑東風(fēng)螺(B.areolata)的7條序列組成系統(tǒng)樹的另一個(gè)亞簇。表明泥東風(fēng)螺與臺(tái)灣東風(fēng)螺的親緣關(guān)系最近，種間距離(0.003 6±0.003 5)(略大于泥東風(fēng)螺不同地理標(biāo)本間的種內(nèi)距離)，同日本東風(fēng)螺(B.japonica)、方斑東風(fēng)螺(B.areolata)、南洋象牙鳳螺(B.lani)次之，種間距離依次為(0.057 2±0.003 8)、(0.072 6±0.003 7)、(0.074 9±0.003 9)，與外群中華蠑螺種間距離為(0.268 8±0.004 8)；而南洋象牙鳳螺和方斑東風(fēng)螺具有較近的親緣關(guān)系，種間距離為(0.002 5±0.000 9)；屬內(nèi)5種東風(fēng)螺的遺傳距離即臺(tái)灣東風(fēng)螺DQ314762與泥東風(fēng)螺KM411961、KF897830、AB044255、HQ424447及南洋象牙鳳螺HQ424448同方斑東風(fēng)螺DQ314761、JN052947、HQ416443、JN052946、JN052948最小為0.002 0，泥東風(fēng)螺HQ833937和南洋象牙鳳螺HQ424448最大為0.081 9，與外群中華蠑螺的遺傳距離在0.253 3～0.278 0之間(圖2)。

同樣，所構(gòu)建的東風(fēng)螺屬COI系統(tǒng)樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)包含一大、一小兩個(gè)分支，KM411963(莆田南日島)首先與泥東風(fēng)螺同源序列JN053010(海南)聚集，獲得支持率97%，再與HQ424447(海南臨高)、KF897830(廣西北海)聚簇，最后與另相聚支的臺(tái)灣東風(fēng)螺序列DQ314764和日本東風(fēng)螺序列AF373888組成系統(tǒng)樹大分支的一個(gè)支系；大分支內(nèi)的另一姊妹亞簇則由方斑東風(fēng)螺的8條序列聯(lián)合南洋象牙鳳螺序列HQ424448及波部東風(fēng)螺(B.habei)序列AY819773構(gòu)成，支持率尚可；小分支為深溝東風(fēng)螺(B.spirata)的8條序列與錫蘭東風(fēng)螺(B.zeylanica)序列JX573172形成，節(jié)點(diǎn)支持率為100%。系統(tǒng)樹的聚類結(jié)果與前者較一致，顯示東風(fēng)螺屬內(nèi)泥東風(fēng)螺和臺(tái)灣東風(fēng)螺、日本東風(fēng)螺親緣關(guān)系相近，種間距離分別為(0.010 2±0.002 7)、(0.013 8±0.002 7)，與南洋象牙鳳螺、方斑東風(fēng)螺也有一定的聯(lián)系，種間距離分別為(0.121 2±0.004 6)、(0.130 5±0.001 3)，但同深溝東風(fēng)螺、波部東風(fēng)螺、錫蘭東風(fēng)螺親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，種間距離分別為(0.157 3±0.004 9)、(0.164 9±0.004 9)、(0.181 2±0.001 2)；另外，方斑東風(fēng)螺與南洋象牙鳳螺、波部東風(fēng)螺有較近的系統(tǒng)關(guān)系，種間距離分別為(0.044 0±0.000 7)、(0.148 5±0.002 1)，而錫蘭東風(fēng)螺和深溝東風(fēng)螺地理進(jìn)化親緣相近，種間距離為(0.079 1±0.003 8)；屬內(nèi)8種東風(fēng)螺遺傳距離最小的為臺(tái)灣東風(fēng)螺DQ314764與日本東風(fēng)螺AF373888的0.003 5，最大的為錫蘭東風(fēng)螺JX573172和波部東風(fēng)螺AY819773的0.236 8，與外群中華蠑螺遺傳距離在0.259 7～0.312 7之間(圖3)。

蛾螺科18S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果顯示KX185514(莆田南日島)與泥東風(fēng)螺序列HQ834022(福州福清)、方斑東風(fēng)螺序列HQ834021及EU236272聚成一簇，節(jié)點(diǎn)支持率100%，再與Euthria屬序列聚集，聯(lián)合Japelion、Volutharpa、香螺屬(Neptunea)序列形成的復(fù)合簇，先后同Crassicantharus屬、甲蟲螺屬(Cantharus)和Phos屬、Siphonalia及蛾螺屬(Buccinum)水泡蛾螺(B.pemphigus)序列匯集。東風(fēng)螺屬內(nèi)種間距離為(0.000 0±0.000 0)，與Euthria屬的遺傳距離最小，為(0.006 8±0.000 0)，同Volutharpa、香螺屬、Japelion、甲蟲螺屬、Phos、Crassicantharus、蛾螺屬、Siphonalia屬的遺傳距離漸增，依次為(0.006 8±0.000 0)、(0.009 1±0.001 2)、(0.009 6±0.000 0)、(0.011 9±0.000 0)、(0.012 5±0.000 0)、(0.013 7±0.000 0)、(0.014 1±0.001 5)、(0.018 1±0.001 6)，同外群中華蠑螺遺傳距離為(0.140 0±0.000 0)；而Volutharpa屬與Euthria、香螺屬最小的遺傳距離亦為0.006 8，為(0.006 8±0.001 4)；蛾螺科內(nèi)最小的遺傳距離為蛾螺屬、Siphonalia兩屬的(0.005 5±0.002 3)，最大為Crassicantharus、Siphonalia兩屬的(0.025 6±0.001 7)，同外群中華蠑螺的遺傳距離在0.139 2～0.146 3之間(圖4)。

蛾螺科內(nèi)選取28S rRNA基因序列多于1條的屬進(jìn)行分子進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果呈現(xiàn)出多個(gè)分支，KX656904/KX656905(莆田南日島)處于進(jìn)化樹的外支。遺傳距離計(jì)算結(jié)果顯示東風(fēng)螺屬與其余各屬序列遺傳距離從小到大分別為Eosipho屬(0.049 1±0.000 0)、Manaria屬(0.049 6±0.000 8)、Cancellopollia屬(0.052 0±0.000 0)、香螺屬(0.0530±0.0008)、Lirabuccinum屬(0.058 3±0.000 0)、蛾螺屬(0.062 3±0.000 8)、Belomitra屬(0.065 5±0.002 2)、Colubraria屬(0.065 6±0.007 0)、Crassicantharus屬(0.070 7±0.000 0)，同外群中華蠑螺遺傳距離(0.347 6±0.001 4)；而Eosipho屬與Manaria、Lirabuccinum屬遺傳距離較小，分別為(0.010 6±0.000 8)、(0.024 8±0.000 0)；蛾螺科內(nèi)最小遺傳距離為Eosipho、Manaria兩屬的(0.010 6±0.000 8)，最大為東風(fēng)螺、Crassicantharus兩屬的(0.070 7±0.000 0)，同外群中華蠑螺的遺傳距離在0.338 8～0.353 6之間(圖5)。

蛾螺總科ITS1全序列檢索到蛾螺科東風(fēng)螺屬的6條、細(xì)帶螺科(Fasciolariidae)赤旋螺屬(Pleuroploca)四角赤旋螺(P.filamentosa)的1條、核螺科(Columbellidae)麥螺屬(Euplica)花麥螺(E.scripta)的1條、織紋螺科(Nassariidae)織紋螺屬(Nassarius)的若干條，構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示KX656904/KX656905(莆田南日島)聚支后同方斑東風(fēng)螺的6條序列組成的簇群匯集，再與麥螺屬、赤旋螺屬的序列集合；進(jìn)化樹的另一簇群由織紋螺屬的9種織紋螺序列聚成。泥東風(fēng)螺種內(nèi)距離為0.003 2，與方斑東風(fēng)螺種間距離為(0.016 4±0.002 3)，與麥螺屬、赤旋螺屬種間距離分別為(0.362 5±0.003 5)、(0.410 2±0.000 7)，與織紋螺屬種間距離為(0.473 2±0.008 8)，與外群中華蠑螺種間距離為(1.047 1±0.006 9)；而方斑東風(fēng)螺種內(nèi)距離為(0.003 4±0.002 2)，同外群中華蠑螺種間距離為(1.069 3±0.006 1)；屬內(nèi)2種東風(fēng)螺的遺傳距離即泥東風(fēng)螺KX656905和方斑東風(fēng)螺EF117975、EF490206最小，為0.012 7，泥東風(fēng)螺KX656904和方斑東風(fēng)螺EF490207、EF490208、EF490209、EF490210最大，為0.019 1，與外群中華蠑螺的遺傳距離在1.041 1～1.073 4之間(圖6)。

蛾螺總科ITS2全序列現(xiàn)時(shí)只公布了蛾螺科蛾螺屬日本海峨螺(B.striatissimum)的3條、細(xì)帶螺科(Fasciolariidae)細(xì)帶螺屬(Fasciolaria)的1條，分析序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹顯示KX656904/KX656905(莆田南日島)聚支后并入蛾螺屬、細(xì)帶螺屬序列組成分支的外側(cè)。泥東風(fēng)螺種內(nèi)遺傳距離為0.000 0，與F.lignaria種間遺傳距離為(0.172 5±0.000 0)，與蛾螺屬種間遺傳距離為(0.198 7±0.000 0)，與外群中華蠑螺種間遺傳距離為(0.398 5±0.005 3)；而蛾螺屬、細(xì)帶螺屬序列種間遺傳距離為(0.117 6±0.000 0)，同外群中華蠑螺種間遺傳距離分別為(0.376 5±0.004 8)、(0.390 2±0.006 4)(圖7)。

2.3 同工酶電泳

酶譜(僅示例30枚樣本中的01～15號(hào)個(gè)體)顯示南日島泥東風(fēng)螺個(gè)體間腹足肌組織中各同工酶酶帶的遷移速率、組成分布在某種程度上較一致，表明相關(guān)基因在群體內(nèi)的表達(dá)和調(diào)控具有部分穩(wěn)定性。酯酶(EST)為正染色，呈現(xiàn)出相似的約7～8條酶帶，酶位點(diǎn)活性表達(dá)強(qiáng)弱不同，甚至個(gè)別缺失，群體內(nèi)個(gè)體間多態(tài)性可見差異明顯；蘋果酸酶(ME)為正染色，僅觀察到1條酶帶，但表達(dá)極其微弱，不易辨別；超氧化物歧化酶(SOD)為負(fù)染色，多數(shù)個(gè)體檢測到2條酶帶，少數(shù)(09、12號(hào)個(gè)體)檢測到3條酶帶，個(gè)體間表達(dá)差異較明顯；乳酸脫氫酶(LDH)為正染色，呈現(xiàn)出2條表達(dá)很弱的酶帶；蘋果酸脫氫酶(MDH)為正染色，觀察到2條較弱的酶帶，其中向正極泳動(dòng)稍快的表達(dá)相對(duì)更弱；異檸檬酸脫氫酶(IDH)為正染色，大部分個(gè)體檢測到2條酶帶，小部分為3條，群體內(nèi)個(gè)體酶位點(diǎn)表達(dá)具有一定的差異性(圖8)。

3 討論

3.1 形態(tài)測定

通過研究樣本個(gè)體的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)分類是生物分類學(xué)的經(jīng)典方法，腹足綱的分類鑒定主要是依據(jù)貝殼的形狀、殼色、有無生長線[14]、齒舌結(jié)構(gòu)等形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)特征，各形態(tài)指標(biāo)之間有著部分直接或間接的相關(guān)性。觀察發(fā)現(xiàn)，南日島泥東風(fēng)螺樣本個(gè)體螺殼呈長卵形、右旋，縫合線明顯，白色殼面外被有一層黃褐色的殼皮，臍孔小且明顯、不深，厴棕褐色、角質(zhì)，生長線明顯。形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)特征易于收集、測定和保存記錄，能夠直觀、全面而系統(tǒng)地反映出樣本特征，在物種的研究中有著不可替代的地位。利用光學(xué)顯微鏡研究發(fā)現(xiàn)，蛾螺科中東風(fēng)螺屬泥東風(fēng)螺、方斑東風(fēng)螺、臺(tái)灣東風(fēng)螺和深溝東風(fēng)螺與其它屬種類的齒舌形態(tài)在中央齒小齒的大小和數(shù)目、中央齒基板的性狀以及側(cè)齒小齒的數(shù)目上互相體現(xiàn)出明顯的區(qū)別[15]，泥東風(fēng)螺和方斑東風(fēng)螺的齒舌因具有種特異性而存在差異[16]。螺殼的外部形態(tài)特征是目前東風(fēng)螺屬種類鑒定的主要依據(jù)，泥東風(fēng)螺與營固著生活的海產(chǎn)動(dòng)物牡蠣等相比，較少受外源影響如個(gè)體間擠壓而使貝殼產(chǎn)生形變[17-18]，同時(shí)養(yǎng)殖群體相比野生種類，受敵害生物、餌料、底質(zhì)和水溫等生境條件的影響[19-20]較小，因而貝殼外形較穩(wěn)定一致，形態(tài)標(biāo)記個(gè)體差異小，易于觀察測量、記錄和分析，因此南日島泥東風(fēng)螺樣本的殼高、殼寬與體重3個(gè)表型性狀間的相關(guān)性、關(guān)系式R2值與莆田牡蠣的貝殼形態(tài)測定數(shù)據(jù)[18]相比更高、更加可靠，結(jié)果亦顯示在觀測指標(biāo)范圍內(nèi)，南日島泥東風(fēng)螺養(yǎng)殖群體個(gè)體間貝殼的形態(tài)較一致，除外表面的顏色斑塊色澤、形狀無規(guī)律外，其他變化差異不明顯，個(gè)體的鮮總體重(W)優(yōu)先與螺殼的殼寬(B)呈一定的相關(guān)性，其次是螺殼的殼高(H)；所抽取的樣本暫未觀察到花紋具有特異統(tǒng)一的現(xiàn)象，不容易測量計(jì)數(shù)，顏色斑塊的不同變化可能是受個(gè)體自身特性或環(huán)境的影響。

注：A：酯酶(EST)；B：蘋果酸酶(ME)；C：超氧化物歧化酶(SOD)；D：乳酸脫氫酶(LDH)；E：蘋果酸脫氫酶(MDH)；F：異檸檬酸脫氫酶(IDH)。

Notes：A.Esterase(EST)；B.Malic enzyme(ME)；C.Superoxide dismutase(SOD)；D.Lactate dehydrogenase(LDH)；E.Malic dehydrogenase(MDH)；F.Isocitrate dehydrogenase(IDH).

3.2 DNA條形碼

基因和生境共同影響著貝殼的形態(tài)特征，利用DNA或RNA條形碼序列的擴(kuò)增測定、同工酶電泳分析、染色體核型和計(jì)數(shù)等分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合形態(tài)參數(shù)，可以更加有效、準(zhǔn)確地了解分析種質(zhì)資源、群體的遺傳多樣性和系統(tǒng)學(xué)分類關(guān)系等情況，借助于形態(tài)分析和DNA分子標(biāo)記技術(shù)，解決了莆田牡蠣的常見養(yǎng)殖種類究竟是僧帽牡蠣(Saccostreacucullata)、褶牡蠣(Crassostreaplicatula)還是葡萄牙牡蠣(C.angulata)的爭議[18，20]。線粒體基因已廣泛應(yīng)用于海洋生物特別是無脊椎動(dòng)物的分子鑒定[21]、群體遺傳分化[22]、親緣關(guān)系[23-24]和系統(tǒng)發(fā)育研究[25-26]，而質(zhì)體、核基因則更多被引入輔助探討植物的鑒定[27-29]，如藻類的種類[30-31]和進(jìn)化關(guān)系[32-33]，是非常有效的分子標(biāo)記。依實(shí)驗(yàn)16S rRNA、COI、18S rRNA、28S rRNA、ITS1和ITS2基因序列的數(shù)據(jù)庫資料豐富程度、堿基組成、種內(nèi)/種間遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果，表明線粒體基因片段COI是研究東風(fēng)螺屬內(nèi)種類序列遺傳多態(tài)性的理想DNA條形碼。南日島泥東風(fēng)螺樣本的16S rRNA、COI序列堿基組成(A+T)含量分別為64.9%、62.7%，都明顯高于(G+C)，堿基組成偏向性符合線粒體(蛋白編碼)基因的堿基組成特點(diǎn)；18S rRNA堿基(A+T)含量為49.3%，幾乎不存在偏倚性；18S-28S rRNA堿基(A+T)含量41.0%，略低于(G+C)含量，這些結(jié)果與其他腹足綱螺類基因堿基組成相似。樣本的18S-28S rRNA產(chǎn)物多次直接雙向測序時(shí)發(fā)現(xiàn)，每輪通用/特異引物反應(yīng)經(jīng)過ITS區(qū)，極易出現(xiàn)雙峰干擾或失敗，結(jié)果無法成功比對(duì)，必需經(jīng)過連接轉(zhuǎn)化處理后才能順利進(jìn)行，ITS區(qū)很有可能因兩端進(jìn)化較快，存在復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，不利于測序引物的錨定結(jié)合；且克隆后測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)了2個(gè)插入突變的核苷酸位點(diǎn)，推測這2個(gè)突變位點(diǎn)很可能與樣本個(gè)體的遺傳特質(zhì)或測序相關(guān)。通過對(duì)東風(fēng)螺屬8個(gè)種的16S rRNA、COI條形碼系統(tǒng)學(xué)分析可以看出，屬內(nèi)的泥東風(fēng)螺與臺(tái)灣東風(fēng)螺、日本東風(fēng)螺這2個(gè)種聚到一起成為一支，bootstrap值較高，推斷是屬里較為親近的種，與其它種的親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)，特別是泥東風(fēng)螺同臺(tái)灣東風(fēng)螺的遺傳距離和序列差異度更小，說明分類地位與系統(tǒng)學(xué)進(jìn)化關(guān)系最近。而基于COI基因序列重建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，東風(fēng)螺屬的8個(gè)種形成兩個(gè)明顯的大亞群，采集自中國沿岸或東中國海的泥東風(fēng)螺、臺(tái)灣東風(fēng)螺、日本東風(fēng)螺、南洋象牙鳳螺、方斑東風(fēng)螺和波部東風(fēng)螺聚為一個(gè)大亞群，組成另一個(gè)大亞群的是采捕自印度洋海區(qū)的深溝東風(fēng)螺和錫蘭東風(fēng)螺，表明分布于不同大洋海域的樣本，由于地理隔離難以產(chǎn)生有效的基因交流，同時(shí)，空間距離鄰近的樣本親緣關(guān)系也有一定的相關(guān)性。

3.3 同工酶電泳

同工酶電泳用于群體遺傳學(xué)研究能夠有效檢測出樣本居群特異條帶的多寡，度量群體結(jié)構(gòu)的遺傳變異，成功應(yīng)用于葡萄牙牡蠣[18]、紫貽貝(Mytilusedulis)[34]和毛蚶(Scapharcasubcrenata)[35]等海洋貝類，發(fā)現(xiàn)在紫貽貝體內(nèi)的鰓、消化腺、外套膜、足和閉殼肌5種組織中SOD、三磷酸腺苷酶(ATPase)、MDH及ME存在著一定的特異性表達(dá)差異；而毛蚶的消化腺和外套膜2種組織中EST、LDH、乙醇脫氫酶(ADH)、MDH、ME、谷氨酸脫氫酶(GDH)、淀粉酶(AMY)、SOD同磷酸葡萄糖變位酶(PGM)圖譜表明江蘇海州灣、浙江象山港與遼寧遼東灣3個(gè)海區(qū)各群體雜合子缺失現(xiàn)象普遍存在。分析南日島泥東風(fēng)螺養(yǎng)殖群體內(nèi)不同個(gè)體間的生化遺傳特征，腹足肌肌肉組織中的EST、ME、SOD、LDH、MDH和IDH的酶譜結(jié)果只有SOD為負(fù)染色；而EST的酶譜表型條帶相對(duì)數(shù)量較多和復(fù)雜，條帶顯色深淺不一；ME、LDH和MDH染色方案多次調(diào)整仍得不到清晰的酶帶，可能在腹足肌肌肉組織中活性表達(dá)不強(qiáng)，或者還未找準(zhǔn)最適宜的顯色方法。6種同工酶初步染色的結(jié)果即活性有無、酶帶表達(dá)強(qiáng)弱、清晰度大小和多態(tài)性揭示，后續(xù)可選其中的EST與SOD繼續(xù)優(yōu)化和方法改進(jìn)，記錄遷移率、基因位點(diǎn)和等位基因等，并進(jìn)行同工酶的基因型頻率、等位基因頻率等評(píng)估居群的遺傳變異參數(shù)的計(jì)算，用于研究南日島泥東風(fēng)螺養(yǎng)殖個(gè)體不同組織中同工酶有無存在一定的組織特異性，以及群體內(nèi)的不同基因型和遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)。樣本同工酶的多態(tài)性比例不高，說明該養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)簡單，可能是繁殖親本的遺傳背景貧乏、親本個(gè)體數(shù)量少、基因交換機(jī)會(huì)小或多次同地相近親本交配，無法為子代提供豐富的遺傳多樣性。為了避免樣本不同個(gè)體間解剖或抽提等操作過程中的相互污染和防止干擾降低多態(tài)性，可備多套工具循環(huán)，每枚個(gè)體用畢需及時(shí)清潔消毒，尤其是在樣本包含個(gè)體數(shù)較多時(shí)，清潔消毒更為重要。

致謝：實(shí)驗(yàn)先后得到中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室茅云翔教授、國家海洋局第三海洋研究所海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陳建明研究員和福建省水產(chǎn)研究所福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室曾志南研究員的幫助與支持，謹(jǐn)致謝忱。

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A preliminary analysis on the morphology，DNA barcoding and isozyme of theBabylonialutosafrom Nanri Island in Putian

WANG Pengyun

(Fisheries and Aquaculture Technology Extension Station of Putian，Putian 351100，China)

Babylonialutosaaquaculture scale has been expanded rapidly with the important economic value and increasing demand in recent years.It becomes more and more necessary to research and understand some information about identification，molecular markers，genetic relationship，genetic polymorphism and construction of phylogenetic tree of shellfish germplasm resources in Putian.The morphological characteristics and key measurable character indicators such as body height(H)，body width(B)and body weight(W)of 39 individuals at different stages cultivated in outdoor breeding pond from Nanri Island were observed and measured in order to derive the calculation formula between these traits.The mitochondria 16S rRNA，COI as well as nuclear 18S rRNA，18S-28S rRNA were amplificated by means of PCR and sequenced as a target gene sequence，respectively.TakingTurbochinensisas an outgroup，the Neighbor-Joining phylogenetic trees involved in the other seven species ofBabyloniaor related homologous sequences of Buccinoidea were reconstructed based on the analysis and comparison of sequence similarities and genetic distances of 16S rRNA，COI，18S rRNA，28S rRNA，ITS1 and ITS2 genes.Also，the enzymatic activities and polymorphism of six isozymes including Esterase(EST)，Malic enzyme(ME)，Superoxide dismutase(SOD)，Lactate dehydrogenase(LDH)，Malic dehydrogenase(MDH)and Isocitrate dehydrogenase(IDH)extracted from the foot muscle tissue were analyzed by using polyacrylamide gel electrophoresis.The results showed that there was no significant difference among the individual shapes of theB.lutosashells except for obviously irregular pattern.The average of body height(H)，body width(B)，body weight(W)and ratio of body height(H)to body width(B)were arranged in turn as(3.65±0.51)cm，(2.18±0.28)cm，(8.66±3.36)g and(1.67±0.06)times,respectively.While the relationship between body height and body width，body weight and body height，body weight and body width growth equations could be successively described by the power function B=0.678 2H0.901 4(R2=0.950 2)，exponential function W=0.600 5e0.713 7H(R2=0.959 3)and W=0.448 0e1.330 8B(R2=0.972 6),respectively.Topology of COI phylogenetic tree suggested thatB.lutosaandB.formosaeclustered together first in the genusBabylonia.AndB.lutosaexisted in the closest phylogenetic relationship withB.formosaesimultaneously.Meanwhile，the genetic distances betweenB.lutosaandB.japonica，B.lani，B.areolata，B.spirata，B.habeiandB.zeylanicaincreased gradually.All the six isozymes were found expressing in the foot tissue.EST，SOD and IDH were detected with locus polymorphism among individuals.ME，LDH and MDH showed no site polymorphism in the number of enzyme bands and merely the presence of enzyme activity difference were examined.The study will provide a valuable reference for further research ofB.lutosa.

Babylonialutosa；morphology；DNA barcoding；isozymes

2017-05-04

福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)[閩海洋高新(2014)05號(hào)]；福建省漁業(yè)推廣項(xiàng)目(FJYYTG2012-07)；莆田市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012N09).

王朋云(1982-)，男，青島人，工程師，碩士，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖及病害防治研究.Tel：0594-2690245.E-mail：foxgpy@126.com

S917.4

A

1006-5601(2017)04-0249-15

王朋云.莆田南日島泥東風(fēng)螺的形態(tài)、DNA條形碼和同工酶初步分析[J].漁業(yè)研究，2017，39(4)：249-263.