棘胸蛙(Quasipaaspinosa)對重復(fù)急性冷暴露的生理應(yīng)激與適應(yīng)耐受

頡志剛,王永鵬,王 娜,鄭榮泉,2

1 浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江省野生動物生物技術(shù)與保護(hù)利用重點實驗室，金華 3210042 浙江師范大學(xué)行知學(xué)院， 金華 321004

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)對重復(fù)急性冷暴露的生理應(yīng)激與適應(yīng)耐受

頡志剛1,2,*,王永鵬1,王 娜1,鄭榮泉1,2

1 浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江省野生動物生物技術(shù)與保護(hù)利用重點實驗室，金華 3210042 浙江師范大學(xué)行知學(xué)院， 金華 321004

為探討棘胸蛙(Quasipaaspinosa)這一溪源性兩棲類對環(huán)境溫度極端變化做出的生理響應(yīng)與適應(yīng)機(jī)制,測定了該物種在反復(fù)遭受急性冷暴露(4 ℃, 12 h)過程中其非特異性免疫反應(yīng)、氧化還原狀態(tài)以及熱休克蛋白70(Hsp70)mRNA 表達(dá)的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：棘胸蛙在初次冷暴露過程中外周血細(xì)胞吞噬活性(第4小時 和第 12小時；P<0.05)、脾巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)強(qiáng)度(第4小時 和第12小時；P<0.05)以及胃溶菌酶活力受到顯著抑制(第12小時；P<0.05)；當(dāng)蛙返回到 22 ℃ 環(huán)境 12 h 后3種免疫指標(biāo)均恢復(fù)到初始和對照組水平(P>0.05)。經(jīng)過連續(xù) 7 d 冷暴露后,除溶菌酶外,血細(xì)胞吞噬活性和脾巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)強(qiáng)度均能恢復(fù)到初始和對照組水平(P>0.05)。另外,冷暴露增加了肝臟和腎臟內(nèi)丙二醛(MDA)的含量,但腎臟內(nèi) MDA 含量升高的幅度要明顯大于肝臟；肝臟 SOD 活力和 GSH 含量也表現(xiàn)出急性和適應(yīng)性升高,而腎臟僅 SOD 活力有所升高,暗示在低溫脅迫狀態(tài)下棘胸蛙肝臟氧自由基清除能力要強(qiáng)于腎臟。HSP70 作為應(yīng)激保護(hù)蛋白,當(dāng)機(jī)體遭受冷暴露后肝臟 Hsp70 mRNA 表達(dá)量始終未呈現(xiàn)出應(yīng)激性升高,反而受到顯著抑制(P<0.05)。綜上所述,棘胸蛙在經(jīng)歷多次急性冷脅迫后體內(nèi)部分非特異性免疫功能以及肝臟氧化防御系統(tǒng)可以產(chǎn)生不同程度的適應(yīng)性改變。

棘胸蛙；冷暴露；免疫；氧化防御；熱休克蛋白70

氣候異?？赡苁菍?dǎo)致全球兩棲動物種群衰退和物種滅絕的重要因素之一[1-2]。如非季節(jié)性極端低溫天氣的頻繁出現(xiàn)或季節(jié)交替期出現(xiàn)的寒流都可能嚴(yán)重干擾兩棲動物的生理內(nèi)穩(wěn)態(tài)[1,3],從而增加感染疾病的風(fēng)險,最終可能成為導(dǎo)致種群數(shù)量下降的誘因[2,4]。兩棲類特異性免疫進(jìn)化并不完全,非特異性免疫在特異性免疫被調(diào)動前可快速地為機(jī)體提供免疫保護(hù),尤其在應(yīng)激狀態(tài)下占有主導(dǎo)地位[5-6]。溫度依賴性是兩棲類免疫反應(yīng)的主要特征[7- 9],低溫一方面可以直接降低免疫細(xì)胞的活力并抑制溶菌酶等胞外酶的分泌和活性,另一方面可通過激活丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA)引起糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid, GC)分泌的增加[10-11],而 GC 可以抑制巨噬細(xì)胞對病原的吞噬與加工,阻礙淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化,減少血液循環(huán)中淋巴細(xì)胞數(shù)量[12]。

在脅迫狀態(tài)下氧自由基或活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的大量積累可導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷[13-14]。ROS 可改變包括免疫細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞膜上磷脂雙分子層中飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸比例,并破壞膜內(nèi)蛋白的生物活性造成細(xì)胞變性、腫脹乃至死亡[14]。體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶類和谷胱甘肽(GSH)等非酶抗氧化物質(zhì)可清除多余的 ROS,以維持機(jī)體的氧化-抗氧化的內(nèi)穩(wěn)態(tài)(Oxidant-antioxidant Homeostasis, OAH)[15]。

熱休克蛋白(Heat shock protein, HSPs)是機(jī)體受到脅迫時表達(dá)的一類重要的保護(hù)性蛋白, 在調(diào)節(jié)免疫功能和抗感染方面發(fā)揮著重要作用[16-19]。氧化脅迫可以通過激活熱休克轉(zhuǎn)錄因子(Heat Shock Transcription Factor, HSF)來增加 HSPs 的合成[20],而 HSPs 可以促使 SOD 等抗氧化物的合成和釋放[21]。

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)隸屬于蛙科、棘蛙屬,主要分布在我國南方和越南山區(qū)(海拔在500—1000m)的溪流生境,具有較高的科研價值和經(jīng)濟(jì)價值。在養(yǎng)殖實踐中,該物種對環(huán)境溫度和潔凈度的要求非?？量?尤其在季節(jié)交替期比其他常見養(yǎng)殖蛙類更易患病。本研究的目的是了解這一溪源性蛙類在遭受低溫脅迫后機(jī)體的免疫功能和氧化防御會做出如何響應(yīng),以及在遭受多次脅迫后是否會表現(xiàn)出適應(yīng)耐受。這對探討兩棲動物環(huán)境適應(yīng)策略及種群波動機(jī)制具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 動物與馴化

棘胸蛙于 2010 年 10 月 12 日采自浙江省開化縣山區(qū)(118°01′—118°37′N,28°54′—29°30′E ),將采集的個體馴養(yǎng)于水族箱(90 cm×40 cm×40 cm,15 只/箱)內(nèi)馴化兩周,提供充足的水陸環(huán)境和遮蔽物。馴化期間控制水溫(22±1)℃和光周期(12 L∶12 D),每日以黃粉蟲(Tenebriomolitor)活體作為餌料投食1次,隔日用經(jīng)曝氣脫氯的自來水換水1/3。

1.2 低溫脅迫處理與取樣

選擇 80 只蛙(體重(75.77±1.66) g,性別1∶1)作為實驗動物。將蛙隨機(jī)分為兩組,38 只動物仍飼養(yǎng)于馴化環(huán)境((22±1) ℃,12—13 只蛙/箱)作為對照組；為保障樣本量將 42 只動物用于冷暴露,將蛙隨機(jī)置入低溫恒溫((4±0.5) ℃)培養(yǎng)箱(MIR- 253, SANYO, Japan)內(nèi),每臺培養(yǎng)箱配有3個玻璃槽(30 cm×20 cm×15 cm,保持1 cm 水位,14 只蛙/槽,外罩尼龍防逃網(wǎng)),每天冷暴露 12 h 后,再將其轉(zhuǎn)入馴化環(huán)境 12 h,并反復(fù)處理 7 d。在冷暴露當(dāng)天的第 0、4、12、24小時及第7天 的第12小時和 24小時分別取6只動物,對照組同期取樣。蛙經(jīng)毀髓后斷頭取血(用EDTA- 2Na抗凝),解剖后在冰上操作取脾臟立即用于巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)的測定,肝臟、腎臟和胃保存于 -80 ℃ 用于后續(xù)分析。

1.3 免疫學(xué)指標(biāo)測定

1.3.1 外周血吞噬活性

采用熒光標(biāo)記法測定全血吞噬能力,參考 Miliukiené 等[22]方法進(jìn)行：在 100 μL 抗凝全血加入 50 μL 經(jīng)熒光素 FITC 標(biāo)記的酵母(Saccaromycescerevisiae)懸液(1×108個/mL),于 25 ℃ 孵育 60 min,利用熒光分光光度計(RF- 5301PC, SHIMADZU, Japan)測定熒光強(qiáng)度,吸收光波長 480 nm,發(fā)射光波長 520 nm。

1.3.2 脾巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)

采用氮藍(lán)四唑(Bitroblue tetrazolium, NBT)還原法測定脾臟巨噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā),參照 Couso 等[23]的方法。

1.3.3 胃溶菌酶活力

采用比濁法測定胃溶菌酶活力,以溶壁微球菌(Micrcoccuslysoleikticus)為底物,詳見Shugar[24]建立的方法。

1.4 氧化還原狀態(tài)指標(biāo)測定

肝臟和腎臟的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(Malonaldehyde, MDA)、GSH 含量以及 SOD 活力用試劑盒(南京建成生物技術(shù)研究所)測定。

1.5 肝臟 Hsp70 基因表達(dá)半定量分析

肝臟總 RNA 提取方法參照總 RNA 提取試劑盒說明書(寶生物工程有限公司),反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈 cDNA (RT 試劑盒,寶生物工程有限公司)。根據(jù) GeneBank 中黑線倉鼠(CricetulusBarabensis)、牛(Bostaurus)、非洲爪蟾(Xenopusleavis)、歐非肋突螈(Pleurodeleswaltl)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)、中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis) HSP70 cDNA 序列設(shè)計簡并引物(上游引物 5′-GCAMCYAAAGGAGTCGYAGT- 3′,下游引物 5′-TYTCGTGKATCTGAGMTTTG- 3′)進(jìn)行片段克隆,根據(jù)測序獲得的片段序列設(shè)計上游引物 5′-GACCTCGGCACTACCTACTC- 3′,下游引物 5′-GTCAAAGTCTTCTCCACCCA- 3′；根據(jù)非洲爪蟾、灰樹蛙(Hylaversicolor)、日本樹蛙(Buergeriajaponica)的 β-actin 序列設(shè)計上游引物 5′-TGGAGAAGATCTGGCATCAC- 3′,下游引物 5′-TCATGAGGTAGTCTGTCAGG- 3′,PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s,56 ℃ 退火 30 s,72 ℃ 30 s,共 30 循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物電泳并測定 HSP70 和 β-actin 積分光密度比值。

1.6 數(shù)理統(tǒng)計與分析

采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。對免疫、抗氧化和 Hsp70mRNA 表達(dá)等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行 Kolmogorov-Smirnov 正態(tài)分布檢驗,符合正態(tài)分布進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA),組內(nèi)差異利用最小差異法(Least Significant Difference, LSD)檢驗；同一取樣期對照組和處理組間差異采用獨立樣本t檢驗(Independent-sample T-test)分析；數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±S E)表示,顯著水平均為 0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫指標(biāo)

冷暴露(4 h 和 12 h)顯著抑制了棘胸蛙外周血細(xì)胞吞噬活性(P<0.05)(圖1)和脾巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)強(qiáng)度(P<0.05)(圖1),而胃溶菌酶活力在冷暴露 12 h 后才出現(xiàn)顯著下降(P<0.05),并明顯低于對照組(P<0.05)(圖1)。當(dāng)返回到 22 ℃ 環(huán)境后 12 h,3種免疫指標(biāo)均恢復(fù)到初始和對照組水平(P>0.05)。經(jīng)過 7 d 的反復(fù)冷暴露,外周血細(xì)胞吞噬活性和脾巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)強(qiáng)度均回升到了初始和對照組水平(P>0.05),但胃溶菌酶活力無法恢復(fù)到初始和對照組水平(P<0.05)。

圖1 冷暴露和恢復(fù)對棘胸蛙外周血吞噬活性、脾臟呼吸爆發(fā)強(qiáng)度及胃溶菌酶活力的影響Fig.1 The effect of cold exposure and recovery on peripheral blood phagocytic activity, splenic respiratory burst and gastric lysozyme activity in the giant spiny frog (Q. spinosa)數(shù)據(jù)以Mean±S E表示(n=5—6)；* 表示同一時間對照組與處理組間差異顯著(P<0.05)；不同英文字母表示處理組內(nèi)不同處理時間差異顯著(P<0.05)

2.2 氧化還原狀態(tài)指標(biāo)

經(jīng)過 4 h 的冷暴露后,棘胸蛙肝組織內(nèi) MDA 含量顯著升高(P<0.05),但 12 h 后 MDA 含量則降至初始和對照組水平(P>0.05)(圖2)。肝臟 SOD 活力和 GSH 含量隨冷暴露時間的延長而逐漸升高(圖2),并顯著高于對照組(P<0.05)；當(dāng)轉(zhuǎn)入 22 ℃ 環(huán)境后 12 h,SOD 活力仍保持較高活力,但 GSH 含量則恢復(fù)到初始和對照組水平(P>0.05)。經(jīng)過反復(fù)冷暴露后的第7天,雖然肝臟 SOD 活力和 GSH 含量一直保持較高水平,但是在冷暴露第12小時 肝組織內(nèi) MDA 含量仍高于對照組(P<0.05),隨后在 22 ℃ 環(huán)境下 12 h 后又恢復(fù)至初始和對照組水平(P>0.05)。

腎臟組織 MDA 含量升高的幅度要明顯大于肝臟(圖2),且處理組在第1天 和第7天 的各個時間點的 MDA 含量均顯著高于初始和對照組水平(P<0.05)(圖2)。與肝臟類似,腎臟 SOD 活力隨冷暴露時間逐漸升高,當(dāng)轉(zhuǎn)入 22 ℃ 環(huán)境后 12 h 活力最高(P<0.05)；經(jīng)過反復(fù)冷暴露后,在低溫下第12小時 略有升高(P<0.05),但返回到 22 ℃ 后 12 h 又降至初始和對照組水平(P>0.05)(圖2)。但腎臟 GSH 含量在各個階段與對照組間均無統(tǒng)計差異(P>0.05)(圖2)。

圖2 冷暴露和恢復(fù)對棘胸蛙組織MDA含量、SOD活力及GSH含量的影響Fig.2 The effect of cold exposure and recovery on tissue MDA content, SOD activity and GSH content of the giant spiny frog (Q. spinosa)

2.3 肝臟 Hsp70 mRNA 表達(dá)

肝臟 Hsp70 mRNA 表達(dá)量在低溫下受到了顯著抑制(P<0.05),轉(zhuǎn)入 22 ℃ 環(huán)境下 12 h 后表達(dá)量雖有所增加(P>0.05),但未能恢復(fù)到初始水平(P<0.05)。經(jīng)過反復(fù)冷暴露后, Hsp70 mRNA 表達(dá)依然受到顯著抑制(P<0.05)(圖3)。

圖3 冷暴露和恢復(fù)對棘胸蛙肝臟Hsp70mRNA相對表達(dá)量的影響Fig.3 The effect of cold exposure and recovery on relative Hsp70 mRNA expression in liver of the giant spiny frog (Q. spinosa)

3 討論

3.1 免疫功能

蛙類血液和免疫器官內(nèi)含有大量的吞噬細(xì)胞。嗜中性粒細(xì)胞是外周血中最主要的吞噬性白細(xì)胞,而巨噬細(xì)胞是脾臟內(nèi)最主要的吞噬細(xì)胞,該細(xì)胞會消耗大量氧氣并產(chǎn)生 ROS 來消滅吞入胞內(nèi)的病原生物,這一過程稱為呼吸爆發(fā),其反應(yīng)強(qiáng)度可反映出機(jī)體的免疫狀態(tài)。這些吞噬細(xì)胞的吞噬活性一方面表現(xiàn)出溫度依賴性,另一方面在低溫馴化下可能產(chǎn)生適應(yīng)性改變。林蛙(Ranatemporaria)外周血吞噬活性隨環(huán)境溫度的下降而降低,當(dāng)溫度降至 5 ℃ 時白細(xì)胞的數(shù)量顯著減少[25]。豹蛙(Ranapipiens)在 2 ℃ 低溫下6h后外周血細(xì)胞吞噬活性和脾巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)強(qiáng)度均顯著下降[26]?；⒓y蛙(Hoplobatrachusrugulosus)經(jīng)急性低溫(2 ℃, 6 h)處理后其外周血細(xì)胞吞噬活性和脾巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)強(qiáng)度也均受到顯著抑制[27]。上述結(jié)果與本研究相一致,而且棘胸蛙在 22 ℃ 環(huán)境下恢復(fù) 12 h 后外周血細(xì)胞吞噬活性和脾巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)強(qiáng)均恢復(fù)到對照組水平,但胞外酶溶菌酶活力無法得到恢復(fù),同樣說明這些細(xì)胞免疫的溫度依賴性。低溫導(dǎo)致的免疫抑制可能是由于溫度改變了免疫細(xì)胞膜的流動性和穩(wěn)定性以及 ROS 的產(chǎn)生,從而影響到吞噬功能的發(fā)揮；還可能是因為低溫通過激活 HPA 引起促腎上腺激素(ACTH)升高,進(jìn)而促進(jìn) GC(如魚類為皮質(zhì)醇,而兩棲類為皮質(zhì)酮)的大量分泌[10-11],而 GC 是體內(nèi)重要的免疫抑制劑。如將鯉魚(Cyprinuscarpio)從 20 ℃ 迅速移至 12 ℃ 水環(huán)境 2 h 后血清皮質(zhì)酮含量明顯增加[5]。又如在金頭鯛(Sparusaurata)白細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入皮質(zhì)醇可以明顯抑制其呼吸爆發(fā)和吞噬活性[12]。然而,魚類和兩棲類等變溫脊椎動物吞噬細(xì)胞的免疫功能在長期低溫馴化條件下會得到恢復(fù)甚至強(qiáng)化。如林蛙在持續(xù)低溫(5 ℃)下白細(xì)胞可以更迅速地達(dá)到活性峰值[25]。本研究發(fā)現(xiàn)棘胸蛙血液和脾臟內(nèi)吞噬細(xì)胞經(jīng)過連續(xù) 7 d 的反復(fù)冷暴露同樣可以恢復(fù)到初始和對照組水平。類似地,法國火蠑螈(Salamandrasalamandra)和蟾蜍(Bufobufo)在經(jīng)低溫(5 ℃)馴化后其巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞作用要比暖馴化個體更加有效[28]。對魚類的研究也有較多類似的報道[29-30]。值得注意的是,虹鱒[31]和紅大馬哈魚(Oncorhynchusnerka)[33]在低溫下加強(qiáng)了吞噬細(xì)胞活性,但免疫細(xì)胞的總量并未發(fā)生顯著變化,只是頭腎中具有免疫活性的細(xì)胞進(jìn)入體液循環(huán),從而增加了吞噬細(xì)胞的數(shù)量和總吞噬活力。然而,豹蛙經(jīng)低溫馴化后其血液內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞的比例升高,鏡檢發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞多為單葉核或雙葉核,從而推測這些嗜中性粒細(xì)胞是在低溫適應(yīng)中新近形成的[26]。因此,變溫脊椎動物吞噬細(xì)胞的低溫適應(yīng)機(jī)制可能存在較大的物種差異,值得深入研究。

3.2 氧化還原狀態(tài)

非應(yīng)激狀態(tài)下棘胸蛙肝臟 MDA 平均含量要高于腎臟,但初次低溫脅迫后肝臟 MDA 含量上升的幅度卻小于腎臟,且在第12小時 降至初始和對照組水平,這說明肝臟比腎臟能更快地緩解氧化壓力,這可能與肝臟 SOD 活力和 GSH 含量升高有關(guān),而腎臟僅 SOD 活力有所升高。與此不同的是,虎紋蛙在低溫(2 ℃)下處理 6 h 后,肝臟和腎臟 MDA 含量并未出現(xiàn)明顯變化,SOD 活力僅在肝臟中有小幅升高,GSH 在肝臟和腎臟中濃度卻同時出現(xiàn)了應(yīng)激性升高[27]。在魚類中,北海鱈(Zoarcesvivparus)在遭受急性低溫脅迫后肝臟 SOD 活性沒有明顯變化,只有 GSH 含量顯著增加[33]。這暗示 GSH 是非酶類抗氧化物質(zhì),其抗氧化作用在低溫下比酶類抗氧化物可能更具優(yōu)勢或更為重要。此外,蛙經(jīng)低溫馴化后轉(zhuǎn)入高溫環(huán)境后,隨著體溫的回升,有氧呼吸代謝逐步加強(qiáng)同樣可以導(dǎo)致氧化壓力的增加。在本研究中,在 22 ℃ 環(huán)境下恢復(fù) 12 h 后肝臟可以有效減少 MDA 含量,但腎臟無法降低 MDA 含量,這可能與腎臟無法增加 SOD 活力和 GSH 含量有關(guān)。Bagnyukova 等[34]測定了經(jīng)長期低溫馴化(5 ℃, 2 個月)后的湖蛙(Ranaridibunda)在溫度迅速回升過程中機(jī)體的氧化壓力,發(fā)現(xiàn)溫度回升(20 ℃, 1 h 和 24 h)雖然對肝臟 MDA 含量無顯著影響,但可導(dǎo)致羰基蛋白(CP)(可反映蛋白氧化損傷程度)含量的增加,而對腎臟 MDA 和 CP 含量則全無顯著影響,說明腎臟的抗氧化能力要強(qiáng)于肝臟,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)湖蛙肝臟 SOD 和谷胱甘肽還原酶(GR)活力在第24小時 均顯著升高,而腎臟過氧化氫酶(CAT)和 GR 活力顯著升高。因此,酶類和非酶類抗氧化物在不同器官內(nèi)對溫度變化的反應(yīng)存在物種差異,這直接反映了魚類和兩棲類等變溫脊椎動物在應(yīng)對溫度極端變化過程中的氧化防御能力。

3.3 應(yīng)激蛋白 HSP70

HSP70 是一類最保守、分布最廣泛的熱休克蛋白家族,作為應(yīng)激保護(hù)性蛋白可提高細(xì)胞對氧化損傷的耐受程度,而且在降低炎癥反應(yīng)、協(xié)助抗原遞呈等方面具有重要作用[35]。對雙團(tuán)棘胸蛙(Paayunnanensis)的研究表明,在低溫 15 ℃ 處理 9 h 后肝臟 Hsp70 表達(dá)量顯著增加[36]。然而,在本研究中棘胸蛙肝臟 Hsp70 mRNA 的表達(dá)在低溫下不僅沒有出現(xiàn)應(yīng)激性升高,還受到了強(qiáng)烈抑制。這可能是因為 4 ℃ 低溫已經(jīng)超出了棘胸蛙體內(nèi) Hsp70 mRNA 表達(dá)可以響應(yīng)的溫度范圍,所以推測 HSP70 在此低溫下所發(fā)揮的應(yīng)激保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)作用的溫度范圍有限。

綜上所述,棘胸蛙遭遇首次急性冷暴露后非特異性免疫功能受到明顯的抑制,同時機(jī)體內(nèi)的氧化水平明顯增加,但經(jīng)歷反復(fù)應(yīng)激后外周血細(xì)胞和脾臟吞噬功能產(chǎn)生了適應(yīng)性升高,而且不同器官內(nèi)抗氧化能力也存在不同程度的升高。然而,HSP70 作為應(yīng)激性蛋白,該基因在整個冷暴露過程中不但始終沒有出現(xiàn)高表達(dá),而且被顯著抑制,因此推測 HSP70 在此低溫下無法起到相應(yīng)的應(yīng)激保護(hù)作用。

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Stress response and adaptive tolerance of the giant spiny frog (Quasipaaspinosa) to repeated acute cold exposure

XIE Zhigang1,2,*, WANG Yongpeng1, WANG Na1, ZHENG Rongquan1,2

1ZhejiangProvincialkeyLaboratoryofWildlifeBiotechnologyandProtectiveUtilization,CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China2XingzhiCollege,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China

To explore physiological stress response and adaptive tolerance of a stream-dwelling anuran, the giant spiny frog (Quasipaaspinosa), to extreme changes in environmental temperature, we investigated how repeated acute cold (4℃) exposure affects non-special immune responses, redox state, and heat shock protein 70 (Hsp70) mRNA expression. Acute cold exposure inhibited peripheral blood phagocytic activity (after 4 h or 12 h,P<0.05), respiratory bursts of spleen macrophages (after 4 h or 12 h,P<0.05), and gastric lysozyme activity (after 12 h,P<0.05). All immune responses increased to initial and control levels (P>0.05) after the frogs were moved back to 22℃ for 12h. Both blood phagocytic activity and spleen respiratory bursts recovered to initial and control levels (P>0.05) after 7 days of cold exposure. Acute cold stress increased hepatic and renal lipid peroxidation product malondialdehyde (MDA) content, but the degree of increase in MDA in the kidney was obviously larger than that in the liver. Hepatic superoxide dismutase (SOD) activity and glutathione (GSH) content showed acute and adaptive increases (P<0.05), while only SOD activity increased in the kidney, which suggested that anti-oxidative defense was stronger in the liver than in the kidney in this frog. The expression level of Hsp70 mRNA in liver was not acutely increased, while it was significantly inhibited (P< 0.05). In conclusion, some non-special immune functions and the hepatic oxidative defense system inQ.spinosacan adapt, to varying extents, to repeated acute cold exposure.

Quasipaaspinosa; cold exposure; immunity; antioxidative defense; Hsp70

國家自然科學(xué)基金資助項目(30800129, 31270457)

2016- 03- 29; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2017- 03- 02

10.5846/stxb201603290570

*通訊作者Corresponding author.E-mail: xiezhigang@zjnu.cn

頡志剛,王永鵬,王娜,鄭榮泉.棘胸蛙(Quasipaaspinosa)對重復(fù)急性冷暴露的生理應(yīng)激與適應(yīng)耐受.生態(tài)學(xué)報,2017,37(14):4778- 4785.

Xie Z G, Wang Y P, Wang N, Zheng R Q.Stress response and adaptive tolerance of the giant spiny frog (Quasipaaspinosa) to repeated acute cold exposure.Acta Ecologica Sinica,2017,37(14):4778- 4785.