增溶和促滲透對(duì)黃芩苷口服吸收影響的比較性研究

宋 濤，安中原，徐碧儀

（1.廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東 廣州 510663；2.惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 惠州 516025；3.廣東眾生藥業(yè)股份有限公司，廣東 東莞 523326）

?實(shí)驗(yàn)研究?

增溶和促滲透對(duì)黃芩苷口服吸收影響的比較性研究

宋 濤1，安中原2，徐碧儀3

（1.廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東 廣州 510663；2.惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 惠州 516025；3.廣東眾生藥業(yè)股份有限公司，廣東 東莞 523326）

目的 比較增加溶解度和生物膜滲透性對(duì)促進(jìn)黃芩苷（Baicalin，BA）口服吸收的影響。方法 通過(guò)平衡溶解度和油水分配系數(shù)（Log P）實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)BA的溶解性和脂溶性，制備BA的卡必醇溶液（BA-Solution）、BA與癸酸鈉（C10）的水混懸液（BA-C10）以及BA的水混懸液（BA-Suspension），進(jìn)行SD大鼠灌胃，定時(shí)眼眶取血，HPLC測(cè)定血漿中BA的含量，繪制藥時(shí)曲線(xiàn)并直接獲得BA的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果 BA在卡必醇的平衡溶解度（25.02 mg/mL）顯著高于純水（0.55 mg/mL）、乙醇（1.31 mg/mL）、甘油（0.54 mg/mL）和吐溫-80（0.55 mg/mL）。在pH 1.2～8.0范圍內(nèi)，BA的Log P較低（-0.48～-1.43），而C10和油酸鈉可以顯著提高BA的Log P，且C10的促滲透作用（-0.19～-0.57）優(yōu)于油酸鈉（-0.22～-1.09）。藥動(dòng)學(xué)研究表明，口服各BA制劑后藥時(shí)曲線(xiàn)均出現(xiàn)了雙峰現(xiàn)象，相比于BA-Suspension組的藥峰濃度（Cmax1=2.30 μg/mL；Cmax2=0.89 μg/mL），BA-Solution組（Cmax1=4.19 μg/mL；Cmax2=1.76 μg/mL）和BA-C10組（Cmax1=3.10 μg/mL；Cmax2=1.44 μg/mL）都可以顯著提高BA的口服吸收，使BA的相對(duì)生物利用度分別提高至154.79%和191.80%。結(jié)論 增加溶解度和滲透性都可以促進(jìn)BA的口服吸收，但增溶對(duì)BA口服生利用度的提高程度要優(yōu)于促滲透。

黃芩苷；口服吸收；溶解度；滲透性

1 前 言

黃芩苷（Baicalin，BA）是中藥黃芩的主要活性成分，具有多方面的藥理活性，如抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化、清除氧自由基、調(diào)節(jié)血脂、降血壓以及抗動(dòng)脈粥樣硬化等[1-2]。盡管BA的藥理活性較多，但由于其水溶性和滲透性都較差，導(dǎo)致其口服生物利用度很低[3]，影響了其潛在藥理作用的臨床應(yīng)用。鑒于此，目前已有大量關(guān)于提高BA口服生物利用度的研究報(bào)道，如制備前體藥物[4]和微粒給藥系統(tǒng)[5]等，但是，大多數(shù)報(bào)道并未從體內(nèi)外系統(tǒng)闡述溶解性和滲透性對(duì)BA口服吸收屏障的貢獻(xiàn)。因此，本文通過(guò)BA的平衡溶解度、油水分配系數(shù)和藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)，從體內(nèi)外系統(tǒng)評(píng)價(jià)溶解性和滲透性對(duì)BA口服吸收的影響，并比較增溶和促滲透對(duì)提高BA口服生物利用度的貢獻(xiàn)大小。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試劑與儀器：BA對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度為95.2%，批號(hào)：110715-200815）；BA原料藥（臨沂愛(ài)康藥業(yè)有限公司，純度為91.0%，批號(hào)：AKHQ1206）；吐溫-80（上海申宇醫(yī)藥化工有限公司）；卡必醇（廣州東業(yè)化工科技有限公司）；C10（東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；C18（東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；乙腈、乙醇、甘油、正辛醇等其他試劑均為分析純。2010A高效液相色譜儀（日本島津）；KQ3200D E型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UV-1800紫外分光光度計(jì)（日本島津）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司）；XW-80A旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠(chǎng)）；Sartorius CP225D電子天平（德國(guó)賽多利斯）；精密pH劑（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

2.1.2 動(dòng)物：健康雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（粵）2012-0125。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，可自由飲水。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件[6]：色譜柱為Diamonsil C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-含0.1%三乙胺的0.2%磷酸溶液（3:8）；柱溫為30℃；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；進(jìn)樣體積為20 μL。

2.2.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)：分別取空白血漿、BA對(duì)照品和含藥血漿，根據(jù)HPLC色譜條件，進(jìn)樣檢測(cè)，考察血漿內(nèi)源性物質(zhì)是否會(huì)干擾BA的檢測(cè)。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：精密稱(chēng)取適量BA對(duì)照品，用蒸餾水溶解，分別配制系列濃度的BA溶液，取20 μL BA對(duì)照液，加入80 μL的空白血漿中，配制濃度分別為0.05、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0和20.0 μg/mL的含藥標(biāo)準(zhǔn)液，按血漿樣品的方法操作后進(jìn)樣，以峰面積對(duì)血漿藥物濃度進(jìn)行加權(quán)線(xiàn)性回歸計(jì)算。

2.2.4 精密度試驗(yàn)：用空白血漿配制低、中、高濃度分別1.0、2.5和20.0 μg/mL的BA對(duì)照液，一式3份，日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；分別于1、2、3天內(nèi)進(jìn)樣，計(jì)算日間精密度。

2.2.5 回收率試驗(yàn)：用空白血漿配制低、中、高濃度分別1.0、2.5和20.0 μg/mL的BA對(duì)照液（n=3），樣品處理后進(jìn)樣，記錄峰面積，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算藥物濃度，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)液濃度的比較，計(jì)算回收率。

2.3 平衡溶解度的測(cè)定

分別取過(guò)量BA溶解于純水、乙醇、甘油、吐溫-80和卡必醇中，于37℃水浴中以100 rpm的速度振蕩48 h，靜置。3500 rpm離心15 min，取上清液，稀釋?zhuān)米贤膺M(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)平行3份進(jìn)行[7]。

2.4 油水分配系數(shù)的測(cè)定

分別取各自BA磷酸鹽緩沖溶液飽和的正辛醇溶液2 mL，加入pH值為1.2、4.5、6.8、7.2和8.0的磷酸鹽緩沖溶液（已分別被正辛醇溶液飽和）2 mL作為水相，放入恒溫振蕩器中，于37℃振搖48 h平衡，以3000 rpm離心30 min，取上層正辛醇與下層水溶液，稀釋?zhuān)贤鉁y(cè)定，每組樣品平行3份。計(jì)算油水分配系數(shù)P＝（C油）/（C水）。同法，將等量的C10和C18與BA置于試管中振蕩，測(cè)定BA的油水分配系數(shù)。

2.5 大鼠藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.5.1 給藥方案：分別配制BA的水混懸劑（BA-Suspension），BA的卡必醇溶液（BA-Solution）和等量BA與C10的水混懸液（BA-C10）。取SD大鼠3組，每組6只，以BA劑量為80 mg/kg，分別口服BA-Suspension，BA-Solution和BAC10，并于給藥前和給藥后0.17，0.5，1.0，2.0，3.0，6.0，9.0，12.0和24.0 h眼眶取血，置于離心管中（加肝素抗凝），每次取血300 μL。

2.5.2 樣品制備：將血液于3500 rpm離心15 min，精密取上清血漿100 μL，加入200 μL的乙腈沉淀蛋白，渦旋振蕩2 min后，3500 rpm離心15 min，取上清液分別過(guò)0.22μm濾膜，進(jìn)樣測(cè)定BA含量。

2.6 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品的血藥濃度，列表并作藥時(shí)曲線(xiàn)圖，直接從圖中獲得Cmax和Tmax，用梯形法計(jì)算AUC，以BA-Suspension為對(duì)照組，計(jì)算其他兩組制劑的相對(duì)生物利用度Fr，并用單因素方差分析對(duì)各組所得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行組間比較。

3 結(jié) 果

3.1 BA的含量測(cè)定

專(zhuān)屬性試驗(yàn)表明，BA的保留時(shí)間為7.629 min（圖1），空白血漿不干擾BA的測(cè)定。以BA濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到BA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為A=2153.9C+857.64，R2=0.9998，最低定量限為0.05 μg/mL，表明BA在0.05～20 μg/mL的濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積的線(xiàn)性良好，此外，BA的精密度和回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 BA的HPLC圖譜

表1 精密度和回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

3.2 平衡溶解度

BA在各溶媒的平衡溶解度見(jiàn)表2，其在卡必醇的溶解度最大，高達(dá)25.02 mg/mL，而在純水（0.55 mg/mL）、乙醇（1.31 mg/mL）、甘油（0.54 mg/mL）和吐溫-80（0.55 mg/mL）的溶解度相對(duì)較小。

表2 BA在各溶媒的平衡溶解度

3.3 油水分配系數(shù)

BA的油水分配系數(shù)很低，在測(cè)定的pH范圍內(nèi)，其Log P值隨著pH的增加而逐漸減?。◤?0.48～-1.43），然而，C10和C18可以不同程度地增加BA的Log P值，而且同樣具有pH依賴(lài)性，但是，在pH 1.2～8.0內(nèi)，BA-C10的Log P值（從-0.19～-0.57）要大于BA-C18（從-0.22～-1.09）。見(jiàn)表3。

表3 BA在不同pH中的Log P

3.4 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果

各組BA制劑在體內(nèi)的血藥濃度值測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2，各組主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4。由圖2和表4可知，BA在體內(nèi)的藥時(shí)曲線(xiàn)呈雙峰現(xiàn)象，BA-Suspension的Cmax（Cmax1=2.30 μg/mL；Cmax2=0.89 μg/mL）分別為出現(xiàn)于0.53和7.50 h。然而與BA-Suspension相比，BA-Solution組的Cmax顯著增加，達(dá)峰時(shí)間提前，吸收增加（Fr=191.80%），其Cmax1和Cmax2分別提高至4.19和1.76 μg/mL，對(duì)應(yīng)的Tmax1和Tmax2分別提前至0.28和5.50 h。在BA-C10組，BA的吸收較BA-Suspension顯著增加，相對(duì)生物利用度為154.79%，藥峰值分別為3.10和1.44 μg/mL，相對(duì)于BA-Suspension的達(dá)峰時(shí)間有延長(zhǎng)趨勢(shì)，但并不顯著。

圖2 大鼠給藥不同制劑后BA在血漿的藥時(shí)曲線(xiàn)

表4 主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

4 討 論

本文通過(guò)BA體外的理化性質(zhì)研究，表明BA的溶解性和滲透性都很差，這與同類(lèi)文獻(xiàn)報(bào)道一致[7-8]；其次，通過(guò)選用對(duì)BA具有較高溶解度的卡必醇（25.02 mg/mL）和較強(qiáng)促滲透性能的C10分別作為增溶劑和滲透促進(jìn)劑，進(jìn)一步進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)兩者都可以顯著提高BA的口服生物利用度，但BA-Solution（Fr=191.80%）組的促吸收程度顯著優(yōu)于BA-C10組（Fr=154.79%），說(shuō)明增加溶解度對(duì)提高BA口服吸收的效果要優(yōu)于促滲透（P＜0.05）。

據(jù)報(bào)道，BA屬于BCS Ⅳ類(lèi)藥物[9]，提示其口服吸收的提高，要同時(shí)考慮增加溶解性和滲透性，但是比較這兩方面促吸收的貢獻(xiàn)要考慮到增溶劑和滲透促進(jìn)劑的輔料差異對(duì)BA吸收的影響。劉昌順等[6]制備了BA的磷脂復(fù)合物以及復(fù)合物的自微乳給藥系統(tǒng)，都可以顯著提高BA的口服生物利用度，且復(fù)合物自微乳的促吸收效果（Fr=484.1%）優(yōu)于磷脂復(fù)合物（246.3%），然而B(niǎo)A自微乳的促吸收作用比復(fù)合物自微乳更高（Fr=594.6%）。通過(guò)與本研究的比較，我們發(fā)現(xiàn)：①盡管促滲透為主的BA磷脂復(fù)合物的作用優(yōu)于本文的C10[10]，但C10與BA同樣可以形成復(fù)合物和提高BA跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的能力[11]；②以增溶為主的自微乳促吸收效果優(yōu)于本文的卡必醇[12]，但卡必醇仍表現(xiàn)出對(duì)BA較好的促吸收作用。因此，盡管兩個(gè)研究之間存在促吸收輔料和實(shí)驗(yàn)條件的差異，但兩者的結(jié)果基本吻合。通過(guò)與同類(lèi)文獻(xiàn)的比較，進(jìn)一步證明了增加溶解度對(duì)提高BA口服吸收的貢獻(xiàn)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于促滲透。

盡管增加溶解度和生物膜滲透性都可以提高BA的口服吸收，但為了驗(yàn)證同時(shí)增溶和促吸收是否可以大幅度提高BA的生物利用度，我們制備了BA和C10的卡必醇制劑，但是C10的加入會(huì)使BA沉淀析出，這可能是C10與卡必醇分子之間的互相作用抑制了BA在體系中的溶解有關(guān)[11]，導(dǎo)致該制劑無(wú)法滿(mǎn)足藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)要求，該研究在今后的工作中會(huì)作進(jìn)一步探索。

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本文編輯：李新剛

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ISSN.2095-8242.2017.033.6353.03