天津株(TJM-F92)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫后病毒血癥和抗體消長(zhǎng)規(guī)律的試驗(yàn)報(bào)告

楊本勇 ， 曹 東 ， 顧貴波 ， 趙曉彤 ， 趙鳳菊 ， 于學(xué)武 ， 關(guān) 淼 ，李樹(shù)博 ， 王克才 ， 李井春 ， 魏 澍

(遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院 ， 遼寧沈陽(yáng)110164)

天津株(TJM-F92)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫后病毒血癥和抗體消長(zhǎng)規(guī)律的試驗(yàn)報(bào)告

楊本勇 ， 曹 東 ， 顧貴波 ， 趙曉彤 ， 趙鳳菊 ， 于學(xué)武 ， 關(guān) 淼 ，李樹(shù)博 ， 王克才 ， 李井春 ， 魏 澍

(遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院 ， 遼寧沈陽(yáng)110164)

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(HP-PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株引起的一種急性高致死性疫病。發(fā)病主要特征為懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、木乃伊胎等，母豬流產(chǎn)率可達(dá)30%以上；仔豬出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸道癥狀，感染率可達(dá)100%，死亡率在50%以上[2-3]。目前我國(guó)使用的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗均為活疫苗，據(jù)報(bào)道活疫苗免疫后可在動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制并持續(xù)存在。為摸清高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫后在豬體內(nèi)的存在時(shí)間，我們進(jìn)行了本試驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)豬 在某豬場(chǎng)選擇28～30日齡、未進(jìn)行高致病性豬繁殖與呼吸綜合征免疫的長(zhǎng)白仔豬15頭，經(jīng)熒光RT-PCR檢測(cè)，豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、2型圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病病毒均為陰性，實(shí)驗(yàn)豬編號(hào)為A1-A15。

1.1.2 疫苗 天津株(TJM-F92株)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗，政府招標(biāo)采購(gòu)。

1.1.3 RT-PCR試劑 鑒別檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)高致病性強(qiáng)毒和致弱TJM-F92株疫苗毒的RT-PCR引物，由華威特生物科技有限公司提供，擴(kuò)增片段位于NSP2基因；dNTP、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、ExTaq聚合酶等，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.4 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測(cè)試劑盒 購(gòu)自北京天之泰生物科技有限公司，法國(guó)LSI公司生產(chǎn)。

1.1.5 核酸提取試劑 核酸提取試劑盒(磁珠法)，購(gòu)自西安天隆生物科技有限公司。

1.1.6 試驗(yàn)器材 eppendorf微量移液器，PCR儀，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)，西安天隆生物科技有限公司NP968核酸提取儀，伯樂(lè)iMark酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 免疫注射 按疫苗說(shuō)明書(shū)提供的免疫劑量和注射部位對(duì)試驗(yàn)豬進(jìn)行免疫注射。

1.2.2 采血 試驗(yàn)豬在免疫前采血1次；免疫后每隔1周采血1次，連續(xù)采10周；以后每隔2周采血1次，連續(xù)采4次。無(wú)菌分離血清，進(jìn)行高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗毒(TJM-F92株)核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)。

1.2.3 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(TJM-F92株)核酸檢測(cè) 用RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3.1 核酸提取 在96孔核酸提取板的第1列孔及第7列孔中分別加入200 μL血清，10 μL Proteinase K，4 μL Acryl Carrier，然后將板放入核酸提取儀中，按說(shuō)明書(shū)程序進(jìn)行自動(dòng)化提取。

1.2.3.2 反轉(zhuǎn)錄 樣品RNA 5 μL，反轉(zhuǎn)錄引物 1 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，5×Buffer 4 μL，M-MLV 1 μL，RNA酶抑制劑1 μL，DEPC水5 μL。混勻，42 ℃水浴1小時(shí)，70 ℃水浴15分鐘后冰上冷卻，得到cDNA溶液用于PCR擴(kuò)增。

1.2.3.3 PCR擴(kuò)增 cDNA 2 μL，10×Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ExTaq聚合酶0.5 μL，雙蒸水13 μL。混勻后將薄壁PCR管放入PCR儀中，按如下程序擴(kuò)增：首先95 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃ 30 s,56 ℃ 60 s,72 ℃ 45 s,35個(gè)循環(huán)。最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用濃度為1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓 100 V,電泳20 min。電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)觀察。若擴(kuò)增出約644 bp的特異性條帶，則高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗毒(TJM-F92株)核酸陽(yáng)性。

1.2.4 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測(cè) 按試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟和要求操作。阻斷率(IRPC)大于20%為抗體陽(yáng)性，阻斷率越大，抗體水平越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 TJM-F92株疫苗核酸檢測(cè)結(jié)果(表1)由表1可知，免疫前疫苗毒核酸均為陰性。在免疫后1周時(shí)有4頭豬疫苗毒核酸為陽(yáng)性，陽(yáng)性率27%(4/15)，免疫后2周時(shí)陽(yáng)性率13%(2/15)，在免疫后第3周時(shí)陽(yáng)性率最高，為47%(7/15)，此后開(kāi)始下降，至第6周時(shí)只有7%(1/15)。從第7周開(kāi)始再?zèng)]有檢出陽(yáng)性，表明，TJM-F92株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗毒的病毒血癥時(shí)間最長(zhǎng)為6周。

表1 血清中TJM-F92株疫苗毒核酸檢測(cè)結(jié)果

2.2 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表2。從表2可以看出，由于母源抗體的存在，免疫前抗體陽(yáng)性率達(dá)到87%，免疫后抗體陽(yáng)性率開(kāi)始下降，至免疫后第2周時(shí)下降至33%，隨后開(kāi)始緩慢上升，至免疫后第3周時(shí)上至47%，第4周時(shí)升至53%，到免疫后第5周時(shí)突然上升至100%，并一致持續(xù)到第12周，隨后開(kāi)始稍有下降?？贵w平均阻斷率在免疫前也處在較高水平，達(dá)到72%，免疫后開(kāi)始下降，至免疫后第2周時(shí)降至最低，只有18%，為陰性。此后開(kāi)始慢慢上升，至免疫后第6周時(shí)達(dá)到最高值78%，此后開(kāi)始緩慢下降。

3 討論

3.1 從實(shí)驗(yàn)豬血清中TJM-F92株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗毒存在時(shí)間的變化規(guī)律可以看出，不同豬只病毒血癥的持續(xù)時(shí)間差異較大，有的沒(méi)有出現(xiàn)病毒血癥，有的只存在1周，最長(zhǎng)的可以達(dá)到免疫后第6周。因此TJM-F92株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗免疫后病毒血癥持續(xù)時(shí)間為6周。

3.2 本試驗(yàn)的抗體檢測(cè)結(jié)果表明，疫苗免疫后，豬體內(nèi)的母源抗體會(huì)明顯下降，降到合格臨界值附近，這一低水平的抗體一直持續(xù)至免疫后第4周，從第5周開(kāi)始疫苗免疫產(chǎn)生的抗體水平明顯上升，至第6周時(shí)達(dá)到最高水平，并維持在一個(gè)平臺(tái)到免疫后第16周，本試驗(yàn)的結(jié)果表明，無(wú)論仔豬的母源抗體水平高低，免疫后大約都需要經(jīng)過(guò)4周左右的時(shí)間才能產(chǎn)生較高的抗體水平。因此免疫后的第1周至第4周抗體水平比較低，是比較危險(xiǎn)的時(shí)期[4]。

表2 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測(cè)結(jié)果

3.3 比較實(shí)驗(yàn)豬的病毒血癥陽(yáng)性率與平均抗體水平的變化規(guī)律(見(jiàn)圖1)可以發(fā)現(xiàn)，病毒血癥的嚴(yán)重程度與抗體水平的高低呈負(fù)相關(guān)，即抗體水平低時(shí)，病毒血癥就比較嚴(yán)重，隨著抗體水平的不斷上升，病毒血癥逐漸減弱，當(dāng)抗體維持在較高水平時(shí)，病毒血癥消失[1]。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)，可能是動(dòng)物體內(nèi)疫苗毒同抗體之間“互相斗爭(zhēng)”的結(jié)果，疫苗免疫后刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體，產(chǎn)生的抗體又不斷的將活疫苗毒中和。而隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，抗體水平進(jìn)一步提高，疫苗毒不斷的被中和，以致無(wú)法被檢測(cè)到[3]。

圖1 病毒血癥陽(yáng)性率與平均抗體水平變化曲線

[1] 黃名英,傅安靜,劉平，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染早期體內(nèi)增殖規(guī)律調(diào)查[J].畜牧與獸醫(yī),2013,45(2):50-54.

[2] 李明義,白志娟,王莉娟，等.豬瘟滅活疫苗抗體消長(zhǎng)規(guī)律動(dòng)態(tài)研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2005,27(5):385-388.DOI:10.3969/j.issn.1008-0589.2005.05.017.

[3] 魏園園，顧貴波，申冠男，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗(JXA1-R株)免疫后病毒血癥和抗體消長(zhǎng)規(guī)律[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2016,52(4):44-45.

2016-04-13

遼寧省重大動(dòng)物疫病病原變異與綜合防控技術(shù)研究(2011214001)；高致病性豬藍(lán)耳病綜合防控與免疫凈化技術(shù)推廣[遼財(cái)指農(nóng)(2013)1334號(hào)]

楊本勇(1973- )，男，高級(jí)獸醫(yī)師，本科，從事動(dòng)物疫病防控工作,E-mail：benyong@tom.com

顧貴波，E-mail：guguibo8888@126.com

S852.65+9

B

0529-6005(2017)07-0056-02