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    西妥昔單抗聯(lián)合鉑類化療對人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤COX-2及MMP-7的影響*

    2017-08-28 16:38:51龔永謙程愛蘭劉潔
    中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志 2017年11期
    關鍵詞:西妥瘤體鱗癌

    龔永謙,程愛蘭,劉潔

    (1.南華大學附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉科,湖南 衡陽 421001;2.南華大學醫(yī)學院 病理學教研室,湖南 衡陽 421001)

    西妥昔單抗聯(lián)合鉑類化療對人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤COX-2及MMP-7的影響*

    龔永謙1,程愛蘭2,劉潔1

    (1.南華大學附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉科,湖南 衡陽 421001;2.南華大學醫(yī)學院 病理學教研室,湖南 衡陽 421001)

    目的 探討西妥昔單抗聯(lián)合鉑類化療對人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤環(huán)氧化酶-2(COX-2)及基質金屬蛋白酶-7(MMP-7)的影響。方法 選擇BALB/c裸鼠24只為研究對象,均復制人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤模型,隨機分為西妥昔單抗組、順鉑組、西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組及對照組,各6只。對照組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.2 ml,西妥昔單抗組腹腔注射1 036 μg/ml西妥昔單抗注射液,順鉑組腹腔注射3μg/ml順鉑注射液,西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組腹腔注射1 036 μg/ml西妥昔單抗注射液和3 μg/ml順鉑注射液,連續(xù)4周后,脫頸處理裸鼠。比較瘤體生長情況、COX-2與MMP-7表達及信使核糖核酸(mRNA)表達。結果 西妥昔單抗組、順鉑組、西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組瘤體體積及瘤重均低于對照組(P<0.05),西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組瘤體體積、瘤重低于西妥昔單抗組與順鉑組,抑瘤率高于西妥昔單抗組及順鉑組(P<0.05);西妥昔單抗組、順鉑組、西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7及mRNA表達均低于對照組(P<0.05),西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7表達及mRNA表達低于西妥昔單抗組、順鉑組(P<0.05)。結論西妥昔單抗聯(lián)合鉑類化療有助于抑制喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤增殖生長,可能與抑制腫瘤組織COX-2與MMP-7表達有關。

    西妥昔單抗;順鉑;喉癌;環(huán)氧化酶-2;基質金屬蛋白酶-7

    喉癌是頭頸部惡性腫瘤之一,占全身腫瘤的2%左右[1],且有逐年增高的趨勢,手術是治療的主要方式。順鉑作為輔助治療手段可有效保全喉結構與功能,但也存在嚴重胃腸道反應、骨髓抑制等毒副作用。西妥昔單抗是臨床治療頭頸部腫瘤的靶向藥物之一,可抑制血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶的生成,誘導腫瘤細胞凋亡,且不增加惡心、嘔吐及骨髓抑制等并發(fā)癥[2-3]。兩組聯(lián)合應用于喉癌的文獻報道較少,本文通過復制人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤模型的方法,探討西妥昔單抗聯(lián)合順鉑化療對人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)及基質金屬蛋白酶 -7(matrix metalloprteinases-7,MMP-7)表達的影響,旨在分析其可能作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    BALB/c裸鼠24只。雌性;4~6周齡;體重15~30 g,平均(22.45±3.12)g;購于湖南省疾病控制中心實驗動物中心(許可證號SCXK20161015)。飼養(yǎng)條件:室溫(25.01±0.56)℃,相對濕度50%~60%,常規(guī)飼養(yǎng)1周后進行實驗。本研究經本院動物倫理委員會批準。

    1.2 細胞株與藥物試劑

    人喉鱗癌Hep-2細胞(中南大學湘雅醫(yī)學院動物實驗中心提供),西妥昔單抗(德國莫克公司,注冊證號 S2011009、規(guī)格 100 mg/20 ml、批號 151210),順鉑注射液(江蘇省連云港恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,國藥準字 H20050962、規(guī)格 100 ml),COX-2 多克隆抗體(美國Santa Cruz公司),MMP-7多克隆抗體(購自北京晶美生物工程有限公司),鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(streptavidin-perosidase,SP)試劑盒(購自北京中杉金橋生物技術有限公司),二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒(購自福建省福州邁新生物技術開發(fā)有限公司),Trizol試劑盒(購自美國Sigma公司),Taq DNA聚合酶、逆轉錄酶AMV(購自美國Progmega公司)。

    1.3 主要儀器

    超凈工作臺(江蘇省蘇州凈化設備有限公司SWCJ-1F型),低溫冰箱(日本 Sayyo公司MD-330),輪轉式切片機(上海江文信息技術有限公司),光學相差顯微鏡(日本Olympus公司CKX41型),Qwin standard 2.8病理圖像分析系統(tǒng)(德國Leica公司)。

    1.4 復制模型與分組

    將復蘇后Hep-2細胞置于含10%小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基細胞液中,放至37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng),細胞貼壁生長后取對數生長期細胞磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌,配成 108/ml單細胞懸液,于裸鼠右側背部皮下注射100 μl,2周后觀察皮下腫瘤結節(jié)情況,當腫瘤直徑>5 mm時提示模型復制成功。將模型復制成功的24只喉鱗癌模型裸鼠隨機分為西妥昔單抗組、順鉑組、西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組及對照組,每組各6只。

    1.5 藥物干預

    參照喬建兵等[4]的實驗方法實施藥物干預方案。對照組:腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.2 ml,連續(xù)4周;西妥昔單抗組:腹腔注射1 036 μg/ml西妥昔單抗注射液,連續(xù)4周;順鉑組:腹腔注射3μg/ml順鉑注射液,連續(xù)4周;西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組:腹腔注射1 036 μg/ml西妥昔單抗注射液和3 μg/ml順鉑注射液,連續(xù)4周。

    1.6 瘤體體積與瘤體重量

    4周末脫頸處理裸鼠,分離移植瘤,用游標卡尺測量瘤體長徑、短徑,計算瘤體體積,同時稱重,計算抑瘤率。將裸鼠腫瘤組織分為2部分:①用于免疫組織化學檢測腫瘤組織COX-2、MMP-7蛋白表達;②用于檢測瘤組織COX-2、MMP-7信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)表達。抑瘤率=(對照組瘤體重量-實驗組瘤體重量)/對照組瘤體重量×100%。

    1.7 腫瘤組織COX-2、MMP-7蛋白表達

    參照試劑盒說明書,采用SP法檢測腫瘤組織COX-2、MMP-7表達,用PBS代替一抗作陰性對照,用腫瘤組織作陽性對照。判斷標準:COX-2陽性細胞為細胞質可見棕黃色顆粒彌漫性分布,MMP-7陽性細胞為細胞質可見棕黃色顆粒染色。選擇染色良好區(qū)域,采用圖像分析軟件進行定量分析。

    1.8 腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達

    參照覃綱等[5]的方法檢測腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達,采用逆轉錄-聚合酶鏈反應法(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),用Trizol法提取腫瘤組織總RNA完成逆轉錄,采用PCR反應提取終產物電泳后,使用凝膠分析系統(tǒng)分析目的基因及β-actin積分吸光值,再用Biod-rad軟件分析mRNA表達水平。

    1.9 統(tǒng)計學方法

    數據分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件,計量資料用均數±標準差(±s)表示,比較做方差分析,兩組比較用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 4組瘤體體積與瘤體重量變化情況

    4周后,4組裸鼠重量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);實驗組:西妥昔單抗組、順鉑組及西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組瘤體體積及瘤重低于對照組(t=6.173、6.466、8.272、2.509、3.057 和 5.347,P=0.010、0.009、0.004、0.032、0.021 和 0.013),且西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組<順鉑組<西妥昔單抗組<對照組,差異有統(tǒng)計學意義(F=6.324和3.456,P=0.010和0.026)實驗組抑瘤率比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=4.324,P=0.018),西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組抑瘤率高于西妥昔單抗組與順鉑(t=8.984和 6.109,P=0.002和0.010),順鉑組抑瘤率高于西妥昔單抗組(t=2.781,P=0.028)。見表 1。

    2.2 腫瘤組織COX-2、MMP-7表達

    4周后,實驗組:西妥昔單抗組、順鉑組及西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7蛋白表達均低于對照組 (t=7.356、8.262、10.705、8.259 、9.450 和 12.076,P=0.006、0.004、0.000、0.004、0.000 和0.000);西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7表達低于西妥昔單抗組、順鉑組(t=7.051、7.211、5.921 和 5.579,P=0.008、0.007、0.012和0.014)。見表2。

    表1 4組裸鼠重量、瘤體體積、瘤重及抑瘤率比較 (n=6,±s)

    表1 4組裸鼠重量、瘤體體積、瘤重及抑瘤率比較 (n=6,±s)

    注:1)與對照組比較,P <0.05;2)與西妥昔單抗組比較,P <0.05;3)與順鉑組比較,P <0.05

    組別抑瘤率/%對照組 24.35±2.02 1 102.36±202.34 0.84±0.18 -西妥昔單抗組 24.12±1.65 568.12±63.211) 0.60±0.151) 28.57±3.12順鉑組 24.03±1.57 545.20±60.161) 0.57±0.121) 34.52±4.212)西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組F值P值裸鼠重量/g 瘤體體積/mm3瘤重/g23.28±1.721.1020.086 402.15±45.361)2)3)6.3240.010 0.41±0.081)2)3)3.4560.026 51.19±5.322)3)4.3210.018

    2.3 腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達

    4周后,實驗組:西妥昔單抗組、順鉑組及西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA 表達低于對照組(t=2.135、3.530、3.342、4.725、5.468 和 6.715,P=0.032、0.024、0.023、0.016、0.012 和0.010);西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達低于西妥昔單抗組、順鉑組(t=4.201和5.085,P=0.019和0.013);順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達低于西妥昔單抗組(t=2.939和 3.424,P=0.030和 0.026)。見表 3。

    表2 4組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7表達比較(n=6,±s)

    表2 4組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7表達比較(n=6,±s)

    注:1)與對照組比較,P <0.05;2)與西妥昔單抗組比較,P <0.05;3)西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組與順鉑組比較,P<0.05

    組別MMP-7對照組 138.69±22.14 136.45±18.21西妥昔單抗組 67.36±8.421) 70.02±7.521)順鉑組 60.25±7.121) 62.12±6.541)西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組F值P值COX-240.08±4.351)2)3)6.3250.009 43.02±5.251)2)3)8.6540.002

    表3 4組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達比較(n=6,±s)

    表3 4組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達比較(n=6,±s)

    注:1)與對照組比較,P <0.05;2)與西妥昔單抗組比較,P <0.05;3)與順鉑組比較,P <0.05

    組別MMP-7 mRNA對照組 0.56±0.14 0.74±0.18西妥昔單抗組 0.41±0.101) 0.45±0.091)順鉑組 0.34±0.081) 0.36±0.081)西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組F值P值COX-2 mRNA0.22±0.061)2)3)4.0230.026 0.20±0.081)2)3)5.1230.01

    3 討論

    隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術的不斷發(fā)展以及腫瘤綜合治療手段的不斷進步,在治療喉鱗癌時,要求在不斷提高生存率的前提下,通過治療方式的改變,盡可能保留殘留喉結構與功能[6],提高患者生存質量。靶向治療以其選擇性地作用于腫瘤組織細胞、減少對正常組織細胞的損害,越來越受到關注。

    西妥昔單抗為抗EGFE人/鼠嵌合單克隆抗體,可競爭性結合于表皮生長因子受體,抑制癌細胞增殖[7-8];也可通過上調Bax表達與抑制Bcl-2表達誘導腫瘤細胞凋亡;通過下調基質金屬蛋白表達抑制腫瘤細胞侵襲與轉移[9]。也有學者研究報道,腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細胞增殖失控、細胞凋亡受限密切相關,西妥昔單抗可誘導Hep-2細胞株阻滯于S期,造成DNA損傷不能進行有絲分裂,從而阻止腫瘤細胞增殖失控[10-11]。本研究中,西妥昔單抗組腫瘤體積、瘤重低于對照組,且西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組腫瘤體積、瘤重均低于西妥單抗組、順鉑組,說明西妥昔單抗對腫瘤細胞的增殖、凋亡有積極的促進作用。

    COX-2是花生四烯酸合成前列腺素限速酶,在組織中表達與細胞因子、炎癥反應相關,可通過上調血管生長因子的表達促進腫瘤細胞局部浸潤和遠處轉移[12];MMP-7由腫瘤細胞分泌,可通過降解細胞外基質加速腫瘤細胞侵入周圍組織,為腫瘤新生血管生長提供通道[13]。相關研究表明,COX-2、MMP-7在喉鱗癌細胞組織中均呈異常高表達狀態(tài)[14-15]。本實驗結果發(fā)現(xiàn),西妥昔單抗組COX-2、MMP-7表達及mRNA表達低于對照組,西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7表達及mRNA表達低于西妥昔單抗組、順鉑組,王文慧等[16]、CHUN等[17]也有類似的文獻報道。

    綜上所述,本研究結果表明,西妥昔單抗聯(lián)合鉑類化療有助于抑制人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤增殖生長,可能與抑制細胞組織COX-2及MMP-7表達有關。本研究的局限性在于未對西妥昔單抗不同用藥劑量進行比較,且缺乏對其可能作用機制的深入分析,有待今后作進一步的研究。

    [1]李黎,高樹峰,張少容,等.伊洛馬司對人喉癌Hep-2細胞增殖及凋亡的影響[J].實用醫(yī)學雜志,2013,29(19):3116-3119.

    [2]FERNANDEZ-MATEOS J,SEIJAS-TAMAYO R,MAEIA R,et al.Epidermal growth factor receptor (EGFR)pathway polymorphisms as predictive markers of cetuximab toxicity in locally advanced head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC)in a Spanish population[J].Oral Oncology,2016(63):38-43.

    [3]BUGLIONE M,MADDALO M,CORVO R,et al.Subgroup analysis according to human papillomavirus status and tumor site of a randomized phaseⅡtrial comparing cetuximab and cisplatin combined with radiation therapy for locally advanced head and neck cancer[J].International Journal of Radiation Oncology Biology Physics,2017,97(3):462-472.

    [4]喬建兵,陳文萍,王琳,等.西妥昔單抗聯(lián)合順鉑對荷食管鱗癌裸鼠移植瘤的抑制作用[J].中華腫瘤防治雜志,2015,22(12):907-910.

    [5]覃綱,劉文軍,梁灼萍,等.尼美舒利對人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤CD44MMP-7表達的影響[J].腫瘤防治雜志,2011,38(5):490.

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    Impact of Cox-2 and MMP-7 of cetuximab combined with cisplatin on human laryngeal neoplasms Hep 2 cells nude mice transplanted tumor*

    Yong-qian Gong1,Ai-lan Cheng2,Jie Liu1
    (1.Department of Otorhinolaryngology,the First Affiliated Hospital of University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China;2.Department of Pathology,School of Medicine,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

    ObjectiveTo study effects of Cox-2 and MMP-7 of cetuximab combined with cisplatin on human laryngeal neoplasms Hep 2 cells nude mice transplanted tumor and its mechanism.MethodsA total of 24 BALB/c human laryngeal neoplasms Hep 2 cells nude mice were established,and were divided into cetuximab group,cisplatin group,cetuximab combined cisplatin group,blank control group.The control group was treated with intraperitoneal injection 0.9%sodium chloride solution 0.2 ml,the cetuximab group with intraperitoneal injection 1,036 μg/ml cetuximab injection,cisplatin group with intraperitoneal injection 3 μg/ml cisplatin injection,and cetuximab combined with cisplatin group with intraperitoneal injection 1,036 μg/ml cetuximab injection and 3 μg/ml cisplatin injection.After four weeks,tumors growth,tumor tissue Cox-2 and MMP-7 protein expression and mRNA expression were compared.ResultsVolume and weight of tumors in the cetuximabgroup,cisplatin group,cetuximab combined cisplatin group were significantly lower than those in the control group(P<0.05).Volume and weight of tumors in the cetuximab combined cisplatin group were significantly lower than those in cetuximab group,cisplatin group,inhibition rate were significantly higher cetuximab group,cisplatin group(P<0.05).Expression of COX-2,MMP-7 protein and mRNA in cetuximab group,cisplatin group,cetuximab combined cisplatin group were significanlty lower than those in the control group(P<0.05).Expressions of COX-2,MMP-7 protein and mRNA in cetuximab combined cisplatin group were significanlty lower than cetuximab group,cisplatin group (P<0.05).ConclusionsCetuximab combination with cisplatin chemotherapy helps to inhibit laryngeal neoplasms Hep 2 cells nude mice transplanted tumor proliferation and growth.It may related to inhibiting tumor tissue Cox-2 and MMP-7 expression.

    cetuximab;cisplatin;laryngeal neoplasms;Cox-2;MMP-7

    R696.2

    A

    10.3969/j.issn.1005-8982.2017.11.005

    1005-8982(2017)11-0026-05

    2017-02-28

    國家自然科學基金(No:81372894);湖南省教育廳科研項目(No:10C1136)

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