• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    西妥昔單抗聯(lián)合鉑類化療對人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤COX-2及MMP-7的影響*

    2017-08-28 16:38:51龔永謙程愛蘭劉潔
    中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志 2017年11期
    關鍵詞:西妥瘤體鱗癌

    龔永謙,程愛蘭,劉潔

    (1.南華大學附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉科,湖南 衡陽 421001;2.南華大學醫(yī)學院 病理學教研室,湖南 衡陽 421001)

    西妥昔單抗聯(lián)合鉑類化療對人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤COX-2及MMP-7的影響*

    龔永謙1,程愛蘭2,劉潔1

    (1.南華大學附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉科,湖南 衡陽 421001;2.南華大學醫(yī)學院 病理學教研室,湖南 衡陽 421001)

    目的 探討西妥昔單抗聯(lián)合鉑類化療對人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤環(huán)氧化酶-2(COX-2)及基質金屬蛋白酶-7(MMP-7)的影響。方法 選擇BALB/c裸鼠24只為研究對象,均復制人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤模型,隨機分為西妥昔單抗組、順鉑組、西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組及對照組,各6只。對照組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.2 ml,西妥昔單抗組腹腔注射1 036 μg/ml西妥昔單抗注射液,順鉑組腹腔注射3μg/ml順鉑注射液,西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組腹腔注射1 036 μg/ml西妥昔單抗注射液和3 μg/ml順鉑注射液,連續(xù)4周后,脫頸處理裸鼠。比較瘤體生長情況、COX-2與MMP-7表達及信使核糖核酸(mRNA)表達。結果 西妥昔單抗組、順鉑組、西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組瘤體體積及瘤重均低于對照組(P<0.05),西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組瘤體體積、瘤重低于西妥昔單抗組與順鉑組,抑瘤率高于西妥昔單抗組及順鉑組(P<0.05);西妥昔單抗組、順鉑組、西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7及mRNA表達均低于對照組(P<0.05),西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7表達及mRNA表達低于西妥昔單抗組、順鉑組(P<0.05)。結論西妥昔單抗聯(lián)合鉑類化療有助于抑制喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤增殖生長,可能與抑制腫瘤組織COX-2與MMP-7表達有關。

    西妥昔單抗;順鉑;喉癌;環(huán)氧化酶-2;基質金屬蛋白酶-7

    喉癌是頭頸部惡性腫瘤之一,占全身腫瘤的2%左右[1],且有逐年增高的趨勢,手術是治療的主要方式。順鉑作為輔助治療手段可有效保全喉結構與功能,但也存在嚴重胃腸道反應、骨髓抑制等毒副作用。西妥昔單抗是臨床治療頭頸部腫瘤的靶向藥物之一,可抑制血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶的生成,誘導腫瘤細胞凋亡,且不增加惡心、嘔吐及骨髓抑制等并發(fā)癥[2-3]。兩組聯(lián)合應用于喉癌的文獻報道較少,本文通過復制人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤模型的方法,探討西妥昔單抗聯(lián)合順鉑化療對人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)及基質金屬蛋白酶 -7(matrix metalloprteinases-7,MMP-7)表達的影響,旨在分析其可能作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    BALB/c裸鼠24只。雌性;4~6周齡;體重15~30 g,平均(22.45±3.12)g;購于湖南省疾病控制中心實驗動物中心(許可證號SCXK20161015)。飼養(yǎng)條件:室溫(25.01±0.56)℃,相對濕度50%~60%,常規(guī)飼養(yǎng)1周后進行實驗。本研究經本院動物倫理委員會批準。

    1.2 細胞株與藥物試劑

    人喉鱗癌Hep-2細胞(中南大學湘雅醫(yī)學院動物實驗中心提供),西妥昔單抗(德國莫克公司,注冊證號 S2011009、規(guī)格 100 mg/20 ml、批號 151210),順鉑注射液(江蘇省連云港恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,國藥準字 H20050962、規(guī)格 100 ml),COX-2 多克隆抗體(美國Santa Cruz公司),MMP-7多克隆抗體(購自北京晶美生物工程有限公司),鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(streptavidin-perosidase,SP)試劑盒(購自北京中杉金橋生物技術有限公司),二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒(購自福建省福州邁新生物技術開發(fā)有限公司),Trizol試劑盒(購自美國Sigma公司),Taq DNA聚合酶、逆轉錄酶AMV(購自美國Progmega公司)。

    1.3 主要儀器

    超凈工作臺(江蘇省蘇州凈化設備有限公司SWCJ-1F型),低溫冰箱(日本 Sayyo公司MD-330),輪轉式切片機(上海江文信息技術有限公司),光學相差顯微鏡(日本Olympus公司CKX41型),Qwin standard 2.8病理圖像分析系統(tǒng)(德國Leica公司)。

    1.4 復制模型與分組

    將復蘇后Hep-2細胞置于含10%小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基細胞液中,放至37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng),細胞貼壁生長后取對數生長期細胞磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌,配成 108/ml單細胞懸液,于裸鼠右側背部皮下注射100 μl,2周后觀察皮下腫瘤結節(jié)情況,當腫瘤直徑>5 mm時提示模型復制成功。將模型復制成功的24只喉鱗癌模型裸鼠隨機分為西妥昔單抗組、順鉑組、西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組及對照組,每組各6只。

    1.5 藥物干預

    參照喬建兵等[4]的實驗方法實施藥物干預方案。對照組:腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.2 ml,連續(xù)4周;西妥昔單抗組:腹腔注射1 036 μg/ml西妥昔單抗注射液,連續(xù)4周;順鉑組:腹腔注射3μg/ml順鉑注射液,連續(xù)4周;西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組:腹腔注射1 036 μg/ml西妥昔單抗注射液和3 μg/ml順鉑注射液,連續(xù)4周。

    1.6 瘤體體積與瘤體重量

    4周末脫頸處理裸鼠,分離移植瘤,用游標卡尺測量瘤體長徑、短徑,計算瘤體體積,同時稱重,計算抑瘤率。將裸鼠腫瘤組織分為2部分:①用于免疫組織化學檢測腫瘤組織COX-2、MMP-7蛋白表達;②用于檢測瘤組織COX-2、MMP-7信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)表達。抑瘤率=(對照組瘤體重量-實驗組瘤體重量)/對照組瘤體重量×100%。

    1.7 腫瘤組織COX-2、MMP-7蛋白表達

    參照試劑盒說明書,采用SP法檢測腫瘤組織COX-2、MMP-7表達,用PBS代替一抗作陰性對照,用腫瘤組織作陽性對照。判斷標準:COX-2陽性細胞為細胞質可見棕黃色顆粒彌漫性分布,MMP-7陽性細胞為細胞質可見棕黃色顆粒染色。選擇染色良好區(qū)域,采用圖像分析軟件進行定量分析。

    1.8 腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達

    參照覃綱等[5]的方法檢測腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達,采用逆轉錄-聚合酶鏈反應法(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),用Trizol法提取腫瘤組織總RNA完成逆轉錄,采用PCR反應提取終產物電泳后,使用凝膠分析系統(tǒng)分析目的基因及β-actin積分吸光值,再用Biod-rad軟件分析mRNA表達水平。

    1.9 統(tǒng)計學方法

    數據分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件,計量資料用均數±標準差(±s)表示,比較做方差分析,兩組比較用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 4組瘤體體積與瘤體重量變化情況

    4周后,4組裸鼠重量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);實驗組:西妥昔單抗組、順鉑組及西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組瘤體體積及瘤重低于對照組(t=6.173、6.466、8.272、2.509、3.057 和 5.347,P=0.010、0.009、0.004、0.032、0.021 和 0.013),且西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組<順鉑組<西妥昔單抗組<對照組,差異有統(tǒng)計學意義(F=6.324和3.456,P=0.010和0.026)實驗組抑瘤率比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=4.324,P=0.018),西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組抑瘤率高于西妥昔單抗組與順鉑(t=8.984和 6.109,P=0.002和0.010),順鉑組抑瘤率高于西妥昔單抗組(t=2.781,P=0.028)。見表 1。

    2.2 腫瘤組織COX-2、MMP-7表達

    4周后,實驗組:西妥昔單抗組、順鉑組及西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7蛋白表達均低于對照組 (t=7.356、8.262、10.705、8.259 、9.450 和 12.076,P=0.006、0.004、0.000、0.004、0.000 和0.000);西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7表達低于西妥昔單抗組、順鉑組(t=7.051、7.211、5.921 和 5.579,P=0.008、0.007、0.012和0.014)。見表2。

    表1 4組裸鼠重量、瘤體體積、瘤重及抑瘤率比較 (n=6,±s)

    表1 4組裸鼠重量、瘤體體積、瘤重及抑瘤率比較 (n=6,±s)

    注:1)與對照組比較,P <0.05;2)與西妥昔單抗組比較,P <0.05;3)與順鉑組比較,P <0.05

    組別抑瘤率/%對照組 24.35±2.02 1 102.36±202.34 0.84±0.18 -西妥昔單抗組 24.12±1.65 568.12±63.211) 0.60±0.151) 28.57±3.12順鉑組 24.03±1.57 545.20±60.161) 0.57±0.121) 34.52±4.212)西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組F值P值裸鼠重量/g 瘤體體積/mm3瘤重/g23.28±1.721.1020.086 402.15±45.361)2)3)6.3240.010 0.41±0.081)2)3)3.4560.026 51.19±5.322)3)4.3210.018

    2.3 腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達

    4周后,實驗組:西妥昔單抗組、順鉑組及西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA 表達低于對照組(t=2.135、3.530、3.342、4.725、5.468 和 6.715,P=0.032、0.024、0.023、0.016、0.012 和0.010);西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達低于西妥昔單抗組、順鉑組(t=4.201和5.085,P=0.019和0.013);順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達低于西妥昔單抗組(t=2.939和 3.424,P=0.030和 0.026)。見表 3。

    表2 4組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7表達比較(n=6,±s)

    表2 4組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7表達比較(n=6,±s)

    注:1)與對照組比較,P <0.05;2)與西妥昔單抗組比較,P <0.05;3)西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組與順鉑組比較,P<0.05

    組別MMP-7對照組 138.69±22.14 136.45±18.21西妥昔單抗組 67.36±8.421) 70.02±7.521)順鉑組 60.25±7.121) 62.12±6.541)西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組F值P值COX-240.08±4.351)2)3)6.3250.009 43.02±5.251)2)3)8.6540.002

    表3 4組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達比較(n=6,±s)

    表3 4組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達比較(n=6,±s)

    注:1)與對照組比較,P <0.05;2)與西妥昔單抗組比較,P <0.05;3)與順鉑組比較,P <0.05

    組別MMP-7 mRNA對照組 0.56±0.14 0.74±0.18西妥昔單抗組 0.41±0.101) 0.45±0.091)順鉑組 0.34±0.081) 0.36±0.081)西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組F值P值COX-2 mRNA0.22±0.061)2)3)4.0230.026 0.20±0.081)2)3)5.1230.01

    3 討論

    隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術的不斷發(fā)展以及腫瘤綜合治療手段的不斷進步,在治療喉鱗癌時,要求在不斷提高生存率的前提下,通過治療方式的改變,盡可能保留殘留喉結構與功能[6],提高患者生存質量。靶向治療以其選擇性地作用于腫瘤組織細胞、減少對正常組織細胞的損害,越來越受到關注。

    西妥昔單抗為抗EGFE人/鼠嵌合單克隆抗體,可競爭性結合于表皮生長因子受體,抑制癌細胞增殖[7-8];也可通過上調Bax表達與抑制Bcl-2表達誘導腫瘤細胞凋亡;通過下調基質金屬蛋白表達抑制腫瘤細胞侵襲與轉移[9]。也有學者研究報道,腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細胞增殖失控、細胞凋亡受限密切相關,西妥昔單抗可誘導Hep-2細胞株阻滯于S期,造成DNA損傷不能進行有絲分裂,從而阻止腫瘤細胞增殖失控[10-11]。本研究中,西妥昔單抗組腫瘤體積、瘤重低于對照組,且西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組腫瘤體積、瘤重均低于西妥單抗組、順鉑組,說明西妥昔單抗對腫瘤細胞的增殖、凋亡有積極的促進作用。

    COX-2是花生四烯酸合成前列腺素限速酶,在組織中表達與細胞因子、炎癥反應相關,可通過上調血管生長因子的表達促進腫瘤細胞局部浸潤和遠處轉移[12];MMP-7由腫瘤細胞分泌,可通過降解細胞外基質加速腫瘤細胞侵入周圍組織,為腫瘤新生血管生長提供通道[13]。相關研究表明,COX-2、MMP-7在喉鱗癌細胞組織中均呈異常高表達狀態(tài)[14-15]。本實驗結果發(fā)現(xiàn),西妥昔單抗組COX-2、MMP-7表達及mRNA表達低于對照組,西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7表達及mRNA表達低于西妥昔單抗組、順鉑組,王文慧等[16]、CHUN等[17]也有類似的文獻報道。

    綜上所述,本研究結果表明,西妥昔單抗聯(lián)合鉑類化療有助于抑制人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤增殖生長,可能與抑制細胞組織COX-2及MMP-7表達有關。本研究的局限性在于未對西妥昔單抗不同用藥劑量進行比較,且缺乏對其可能作用機制的深入分析,有待今后作進一步的研究。

    [1]李黎,高樹峰,張少容,等.伊洛馬司對人喉癌Hep-2細胞增殖及凋亡的影響[J].實用醫(yī)學雜志,2013,29(19):3116-3119.

    [2]FERNANDEZ-MATEOS J,SEIJAS-TAMAYO R,MAEIA R,et al.Epidermal growth factor receptor (EGFR)pathway polymorphisms as predictive markers of cetuximab toxicity in locally advanced head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC)in a Spanish population[J].Oral Oncology,2016(63):38-43.

    [3]BUGLIONE M,MADDALO M,CORVO R,et al.Subgroup analysis according to human papillomavirus status and tumor site of a randomized phaseⅡtrial comparing cetuximab and cisplatin combined with radiation therapy for locally advanced head and neck cancer[J].International Journal of Radiation Oncology Biology Physics,2017,97(3):462-472.

    [4]喬建兵,陳文萍,王琳,等.西妥昔單抗聯(lián)合順鉑對荷食管鱗癌裸鼠移植瘤的抑制作用[J].中華腫瘤防治雜志,2015,22(12):907-910.

    [5]覃綱,劉文軍,梁灼萍,等.尼美舒利對人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤CD44MMP-7表達的影響[J].腫瘤防治雜志,2011,38(5):490.

    [6]MESIA R,GARCIA-SAENZ J A,KLOZANO A,et al.Could the addition of cetuximab to conventional radiation therapy improve organ preservation in those patients with locally advanced larynx cancer who respond to induction chemotherapy? An organ preservation spanish head and neck cancercooperative group phase 2 study[J].International Journal of Radiation Oncology Biology Physics,2017,97(3):473-480.

    [7]WICHMANN G,CEDRA S,SCHLEGEL D,et al.Cilengitide and cetuximab reduce cytokine production and colony formation of head and neck squamous cell carcinoma cell ex vivo[J].Anticancer Research,2017,37(2):521-527.

    [8]陳永東,王遠東,李曉寧.西妥昔單抗聯(lián)合化療在中晚期食管癌術后輔助治療中的應用效果觀察[J].實用醫(yī)學雜志,2014,30(17):2862-2863.

    [9]NOWSHEEN S,BONNER J A,LOBUGLIO A F,et al.Cetuximab augments cytotoxicity with poly(adp-ribose)polymerase inhibition in head and neck cancer[J].PloS One,2011,6(8):e24148.

    [10]於子衛(wèi),董頻,龐正.西妥昔單抗聯(lián)合術后同步放化療治療晚期復發(fā)性頭頸癌的初步觀察[J].山東大學耳鼻喉眼學報,2010,24(6):44-46.

    [11]AFTER F,HAMIDI H,FEJZO M S,et al.Dacomitinib,an irreversible pan-ErbB inhibitor significantly abrogates growth in head and neck cancer models that exhibit low response to cetuximab[J].PLoS One,2013,8(2):e56122.

    [12]王智勇,成偉,梁中敏,等.聲門上型喉癌中環(huán)氧化酶-2的表達及微血管和淋巴管密度的關系[J].中國腫瘤外科雜志,2015,7(1):27-29,32.

    [13]梁晶,賈新鳳,韓福才.肺癌患者外周血中MMP-7mRNA、sMICA、VEGF表達及其與侵襲轉移的關系[J].腫瘤防治雜志,2016,43(6):508-512.

    [14]姚紅,尤易文,黃華.喉鱗狀細胞癌組織中Beclinl、COX-2、MVC的表達及意義[J].山東醫(yī)藥,2014,54(23):47-50.

    [15]AHMED H O A,HAGLUND C,VIRLAINEN S,et al.MMP-7,MMP-8,and MMP-9 in oral and cutaneous squamous cell carcinomas[J].Oral Surgery Oral Medicine Oral Pathology&Oral Radiology,2015,119(4):459-467.

    [16]王文慧,王曉玲.西妥昔單抗聯(lián)合紫杉醇對人鼻咽癌CNE-1細胞活力的影響及其可能的分子機制探討[J].醫(yī)學綜述,2015,21(20):3822-3825.

    [17]CHUN S G,HUGHES R,SUMER B D,et al.A phaseⅠ/Ⅱstudy of nab-paclitaxel,cisplatin,and cetuximab with concurrent radiation therapy for locally advanced squamous cell cancer of the head and neck[J].Cancer Investigation,2017,35(1):23-31.

    Impact of Cox-2 and MMP-7 of cetuximab combined with cisplatin on human laryngeal neoplasms Hep 2 cells nude mice transplanted tumor*

    Yong-qian Gong1,Ai-lan Cheng2,Jie Liu1
    (1.Department of Otorhinolaryngology,the First Affiliated Hospital of University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China;2.Department of Pathology,School of Medicine,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

    ObjectiveTo study effects of Cox-2 and MMP-7 of cetuximab combined with cisplatin on human laryngeal neoplasms Hep 2 cells nude mice transplanted tumor and its mechanism.MethodsA total of 24 BALB/c human laryngeal neoplasms Hep 2 cells nude mice were established,and were divided into cetuximab group,cisplatin group,cetuximab combined cisplatin group,blank control group.The control group was treated with intraperitoneal injection 0.9%sodium chloride solution 0.2 ml,the cetuximab group with intraperitoneal injection 1,036 μg/ml cetuximab injection,cisplatin group with intraperitoneal injection 3 μg/ml cisplatin injection,and cetuximab combined with cisplatin group with intraperitoneal injection 1,036 μg/ml cetuximab injection and 3 μg/ml cisplatin injection.After four weeks,tumors growth,tumor tissue Cox-2 and MMP-7 protein expression and mRNA expression were compared.ResultsVolume and weight of tumors in the cetuximabgroup,cisplatin group,cetuximab combined cisplatin group were significantly lower than those in the control group(P<0.05).Volume and weight of tumors in the cetuximab combined cisplatin group were significantly lower than those in cetuximab group,cisplatin group,inhibition rate were significantly higher cetuximab group,cisplatin group(P<0.05).Expression of COX-2,MMP-7 protein and mRNA in cetuximab group,cisplatin group,cetuximab combined cisplatin group were significanlty lower than those in the control group(P<0.05).Expressions of COX-2,MMP-7 protein and mRNA in cetuximab combined cisplatin group were significanlty lower than cetuximab group,cisplatin group (P<0.05).ConclusionsCetuximab combination with cisplatin chemotherapy helps to inhibit laryngeal neoplasms Hep 2 cells nude mice transplanted tumor proliferation and growth.It may related to inhibiting tumor tissue Cox-2 and MMP-7 expression.

    cetuximab;cisplatin;laryngeal neoplasms;Cox-2;MMP-7

    R696.2

    A

    10.3969/j.issn.1005-8982.2017.11.005

    1005-8982(2017)11-0026-05

    2017-02-28

    國家自然科學基金(No:81372894);湖南省教育廳科研項目(No:10C1136)

    猜你喜歡
    西妥瘤體鱗癌
    腹主動脈瘤腔內修復術后瘤體直徑及體積變化的隨訪研究
    惡性胸膜間皮瘤、肺鱗癌重復癌一例
    基于深度學習的宮頸鱗癌和腺鱗癌的識別分類
    西妥昔單抗在轉移性結直腸癌一線治療后的后續(xù)應用研究進展
    《牛陰莖乳頭狀瘤的外科治療》圖版
    體表軟組織巨大神經纖維瘤的手術治療
    EGFR表達與放療抵抗的關系及西妥昔單抗用于直腸癌術前放療增敏的研究進展
    瘤體刮除骨水泥填充治療膝關節(jié)周圍骨巨細胞瘤的療效分析
    西妥昔單抗聯(lián)合IMRT同步化療治療晚期鼻咽癌的療效觀察
    整合素αvβ6和JunB在口腔鱗癌組織中的表達及其臨床意義
    亚洲国产日韩一区二区| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 人妻一区二区av| 久久久久久免费高清国产稀缺| 激情五月婷婷亚洲| 久久久亚洲精品成人影院| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲免费av在线视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 精品亚洲成国产av| 午夜日韩欧美国产| 极品人妻少妇av视频| 丝袜人妻中文字幕| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 精品国产一区二区三区四区第35| 一区二区三区精品91| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲精品一区蜜桃| 不卡av一区二区三区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久免费观看电影| 岛国毛片在线播放| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 韩国高清视频一区二区三区| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲黑人精品在线| 男女床上黄色一级片免费看| 免费少妇av软件| 日本一区二区免费在线视频| 国产不卡av网站在线观看| 婷婷色av中文字幕| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产片内射在线| bbb黄色大片| 日本a在线网址| 国产一区二区激情短视频 | 一级毛片我不卡| 午夜免费鲁丝| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲天堂av无毛| 成年美女黄网站色视频大全免费| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 男人爽女人下面视频在线观看| av在线播放精品| av又黄又爽大尺度在线免费看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 日本a在线网址| 成人免费观看视频高清| 人妻 亚洲 视频| 一个人免费看片子| 99热全是精品| 久久国产亚洲av麻豆专区| www.熟女人妻精品国产| 国产极品粉嫩免费观看在线| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产在线一区二区三区精| 亚洲精品中文字幕在线视频| 9191精品国产免费久久| 大片电影免费在线观看免费| 欧美精品一区二区免费开放| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲,欧美,日韩| 欧美 日韩 精品 国产| 美女福利国产在线| 久久影院123| 日韩大片免费观看网站| 99香蕉大伊视频| 国产欧美日韩一区二区三 | 青草久久国产| 大香蕉久久网| 午夜福利乱码中文字幕| 国产亚洲av高清不卡| 欧美精品亚洲一区二区| 激情视频va一区二区三区| 日本91视频免费播放| 中文字幕制服av| 国产精品一二三区在线看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 婷婷色综合www| 咕卡用的链子| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 男女边吃奶边做爰视频| 免费不卡黄色视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 一区在线观看完整版| 久久性视频一级片| 欧美xxⅹ黑人| 免费观看av网站的网址| 99精国产麻豆久久婷婷| 午夜福利,免费看| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产日韩欧美亚洲二区| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲av综合色区一区| 一区二区三区激情视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 一二三四在线观看免费中文在| 国产成人精品久久久久久| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲图色成人| 欧美日韩黄片免| 久久久精品区二区三区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产精品一二三区在线看| 久久狼人影院| 成人亚洲精品一区在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久久久国产一级毛片高清牌| 9色porny在线观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 老司机深夜福利视频在线观看 | 国产免费视频播放在线视频| 极品人妻少妇av视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 香蕉国产在线看| 欧美日韩一级在线毛片| 黄色片一级片一级黄色片| 日本色播在线视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 精品国产乱码久久久久久男人| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲人成77777在线视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲精品一二三| 在线观看免费视频网站a站| 波多野结衣av一区二区av| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 97人妻天天添夜夜摸| 一本久久精品| 午夜91福利影院| 亚洲精品在线美女| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲av综合色区一区| 国产日韩欧美视频二区| 国产精品一二三区在线看| 一二三四在线观看免费中文在| av不卡在线播放| 国产免费一区二区三区四区乱码| 高潮久久久久久久久久久不卡| 91老司机精品| 日日夜夜操网爽| 色播在线永久视频| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲精品日本国产第一区| 欧美精品高潮呻吟av久久| 男女床上黄色一级片免费看| 尾随美女入室| 久久国产精品大桥未久av| 久久av网站| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲av国产av综合av卡| 国产av精品麻豆| 黄色视频不卡| av有码第一页| 黑丝袜美女国产一区| 老司机影院毛片| 久久人妻福利社区极品人妻图片 | 国产麻豆69| 日本vs欧美在线观看视频| 后天国语完整版免费观看| 人人妻人人澡人人看| 亚洲欧洲国产日韩| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 精品久久久精品久久久| 欧美日韩精品网址| 欧美精品亚洲一区二区| 午夜两性在线视频| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产精品二区激情视频| av有码第一页| 国产av精品麻豆| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 天天添夜夜摸| 亚洲一码二码三码区别大吗| 免费看十八禁软件| 欧美日韩成人在线一区二区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 一区二区三区精品91| 中文欧美无线码| 久久性视频一级片| 69精品国产乱码久久久| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 又大又黄又爽视频免费| 免费在线观看黄色视频的| 一区二区av电影网| 精品久久蜜臀av无| 欧美精品av麻豆av| 久久热在线av| 国产av国产精品国产| 在线精品无人区一区二区三| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 日本五十路高清| 国产在线观看jvid| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲av美国av| 国产亚洲欧美在线一区二区| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲七黄色美女视频| 男女边摸边吃奶| 丝袜人妻中文字幕| 两性夫妻黄色片| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 操出白浆在线播放| 操出白浆在线播放| 免费观看a级毛片全部| 桃花免费在线播放| 亚洲国产欧美在线一区| 精品国产一区二区久久| 中文字幕人妻熟女乱码| bbb黄色大片| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产男人的电影天堂91| 欧美久久黑人一区二区| 精品少妇久久久久久888优播| 男男h啪啪无遮挡| netflix在线观看网站| 美国免费a级毛片| 老司机在亚洲福利影院| 国产一级毛片在线| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品久久久av美女十八| 蜜桃在线观看..| 午夜福利免费观看在线| 欧美精品一区二区大全| 麻豆国产av国片精品| 两个人看的免费小视频| 欧美精品亚洲一区二区| 午夜免费成人在线视频| 国产午夜精品一二区理论片| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 视频区图区小说| 青春草亚洲视频在线观看| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲国产精品国产精品| 成年动漫av网址| 99国产综合亚洲精品| 国产黄频视频在线观看| 操美女的视频在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲精品日本国产第一区| 在线观看人妻少妇| 宅男免费午夜| 国产熟女欧美一区二区| 日本av免费视频播放| 各种免费的搞黄视频| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲av在线观看美女高潮| 久久亚洲国产成人精品v| 波野结衣二区三区在线| 国产精品国产三级专区第一集| 少妇人妻久久综合中文| 制服人妻中文乱码| 99久久综合免费| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产精品一二三区在线看| 久久久国产欧美日韩av| 免费在线观看完整版高清| 婷婷色麻豆天堂久久| 免费不卡黄色视频| 国产高清videossex| 在线观看免费高清a一片| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久 成人 亚洲| 精品久久久精品久久久| 热99国产精品久久久久久7| 久久人人97超碰香蕉20202| 1024香蕉在线观看| 大型av网站在线播放| 人人妻人人澡人人看| 亚洲情色 制服丝袜| 下体分泌物呈黄色| 波多野结衣av一区二区av| 久久鲁丝午夜福利片| 十八禁人妻一区二区| 精品欧美一区二区三区在线| 在线观看免费高清a一片| 97精品久久久久久久久久精品| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久久精品免费免费高清| 十八禁人妻一区二区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 看免费av毛片| 亚洲三区欧美一区| 久久毛片免费看一区二区三区| www.av在线官网国产| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 久久九九热精品免费| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 91精品伊人久久大香线蕉| 手机成人av网站| 涩涩av久久男人的天堂| 大香蕉久久网| 国产黄频视频在线观看| 国产激情久久老熟女| 一本综合久久免费| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产午夜精品一二区理论片| 性色av乱码一区二区三区2| 两性夫妻黄色片| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 欧美日韩亚洲高清精品| 五月开心婷婷网| 国产精品九九99| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产精品一区二区免费欧美 | 99热网站在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看 | 9热在线视频观看99| 日本91视频免费播放| 人妻一区二区av| 久久人妻熟女aⅴ| 超色免费av| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 最近最新中文字幕大全免费视频 | 久久国产精品影院| 精品人妻1区二区| 黄色视频不卡| 电影成人av| 性少妇av在线| 亚洲国产精品一区三区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日本五十路高清| 久久女婷五月综合色啪小说| 欧美精品一区二区免费开放| 精品一区在线观看国产| 亚洲av片天天在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲国产看品久久| 美女高潮到喷水免费观看| 久久久亚洲精品成人影院| 国产精品免费大片| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产不卡av网站在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 久久国产精品影院| 午夜免费观看性视频| 超碰97精品在线观看| tube8黄色片| 永久免费av网站大全| 操美女的视频在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 国产视频一区二区在线看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产99久久九九免费精品| 亚洲精品第二区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 日本av手机在线免费观看| 老司机亚洲免费影院| 蜜桃国产av成人99| 久久久国产精品麻豆| 国产97色在线日韩免费| 高潮久久久久久久久久久不卡| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 成年动漫av网址| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲av综合色区一区| 久久久欧美国产精品| 99国产精品一区二区蜜桃av | 欧美成狂野欧美在线观看| 日本av手机在线免费观看| 免费在线观看影片大全网站 | 国产福利在线免费观看视频| 成人三级做爰电影| 美国免费a级毛片| 新久久久久国产一级毛片| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 99精品久久久久人妻精品| 黑人猛操日本美女一级片| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 韩国精品一区二区三区| 91精品三级在线观看| 观看av在线不卡| 国产99久久九九免费精品| 好男人电影高清在线观看| 国产欧美亚洲国产| 亚洲欧洲国产日韩| 真人做人爱边吃奶动态| 乱人伦中国视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产精品人妻久久久影院| av不卡在线播放| 精品一区二区三卡| 精品福利永久在线观看| 久久久国产一区二区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产熟女欧美一区二区| 极品人妻少妇av视频| 亚洲国产最新在线播放| 久久久精品免费免费高清| 十八禁人妻一区二区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲黑人精品在线| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 99国产精品一区二区三区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲精品av麻豆狂野| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲国产精品国产精品| 国产伦人伦偷精品视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 免费日韩欧美在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 波多野结衣av一区二区av| 午夜福利在线免费观看网站| 男人操女人黄网站| 久久 成人 亚洲| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 性少妇av在线| 无限看片的www在线观看| 精品一区二区三卡| 日本a在线网址| 亚洲欧洲日产国产| 一二三四在线观看免费中文在| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 只有这里有精品99| av福利片在线| 精品久久久精品久久久| 青春草视频在线免费观看| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲av片天天在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久免费观看电影| 一级毛片女人18水好多 | 欧美97在线视频| 日韩一本色道免费dvd| 午夜免费鲁丝| 97在线人人人人妻| 男的添女的下面高潮视频| 黄色a级毛片大全视频| 国产在线一区二区三区精| 男女免费视频国产| 精品一区在线观看国产| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 中文字幕人妻丝袜制服| av一本久久久久| 久久久久久人人人人人| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| a级毛片黄视频| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产日韩欧美在线精品| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品亚洲成国产av| 国产成人av教育| 精品福利观看| 国产欧美亚洲国产| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 秋霞在线观看毛片| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 一级片免费观看大全| 久久久久久久久免费视频了| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 黄色片一级片一级黄色片| 一级黄片播放器| 国产熟女欧美一区二区| 国产成人av激情在线播放| 在线观看一区二区三区激情| 99精品久久久久人妻精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲第一av免费看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 看免费av毛片| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 一区二区三区激情视频| 免费观看av网站的网址| 黄色毛片三级朝国网站| 一区二区日韩欧美中文字幕| 日本vs欧美在线观看视频| 性色av一级| 久久99一区二区三区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 自线自在国产av| 国产色视频综合| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲九九香蕉| 高清不卡的av网站| 亚洲精品一二三| 2018国产大陆天天弄谢| 乱人伦中国视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 下体分泌物呈黄色| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 精品一区二区三卡| 亚洲av男天堂| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产成人影院久久av| 久久久久网色| 大陆偷拍与自拍| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久毛片免费看一区二区三区| 大码成人一级视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 91国产中文字幕| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 好男人视频免费观看在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 激情五月婷婷亚洲| 国产淫语在线视频| 国产成人欧美在线观看 | 久久人人爽人人片av| 久久99一区二区三区| 一本综合久久免费| 丝袜美腿诱惑在线| 不卡av一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区91| 欧美精品亚洲一区二区| 男女边摸边吃奶| 精品福利观看| 亚洲七黄色美女视频| 日韩免费高清中文字幕av| 天天添夜夜摸| 精品少妇内射三级| 啦啦啦 在线观看视频| 一级毛片女人18水好多 | 在线av久久热| 十八禁高潮呻吟视频| 一区二区av电影网| 成年av动漫网址| 99热国产这里只有精品6| 免费在线观看影片大全网站 | 成人三级做爰电影| 一个人免费看片子| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产在线一区二区三区精| 首页视频小说图片口味搜索 | 一边亲一边摸免费视频| 成年动漫av网址| 大片电影免费在线观看免费| 国产又爽黄色视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 婷婷色av中文字幕| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产精品偷伦视频观看了| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 少妇 在线观看| 免费看十八禁软件| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲精品自拍成人| 一级黄片播放器| 免费人妻精品一区二区三区视频| 一级黄色大片毛片| h视频一区二区三区| 少妇精品久久久久久久| 久久久久视频综合| 国产在线观看jvid| 亚洲精品乱久久久久久| 精品亚洲成a人片在线观看| 最新在线观看一区二区三区 | 国产日韩欧美在线精品| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久亚洲精品不卡| 亚洲欧洲日产国产| 热99久久久久精品小说推荐| 青春草亚洲视频在线观看| 久久av网站| 亚洲精品av麻豆狂野| 看十八女毛片水多多多| 午夜日韩欧美国产| 国产av精品麻豆|