大鼠早期酒精性肝損傷誘導(dǎo)模型的建立及觀察

陳歡　劉燕玲　劉學(xué)睿

[摘要目的 探討大鼠早期酒精性肝損傷模型的建立方法，為研究早期酒精性肝損傷的發(fā)病分子機(jī)制提供理想動物模型。方法 24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為模型組（16只）和對照組（8只）。對照組飲用自來水；模型組飲用7%～56%梯度遞增的白酒12周。取材前24 h和12 h，分別以56%白酒急性灌胃后處死大鼠。每天記錄大鼠食用飼料量及飲用量；每周稱量大鼠體重。采用全自動生化分析儀測定大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）含量。觀察大鼠肝臟病理學(xué)和形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果 12周后，模型組大鼠體重增長率為（61.67±1.98）% ，明顯低于對照組的（160.09±3.12）% （P<0.05），肝臟指數(shù)模型組（3.74±0.54）高于對照組（2.85±1.26）（P <0.05）。模型組大鼠ALT、AST、TG、TC均較對照組增高（P<0.05），病理學(xué)檢查模型組肝組織明顯脂肪變性，伴局部炎癥、壞死。結(jié)論 該模型操作簡便，動物死亡率低，穩(wěn)定，發(fā)病過程與臨床類似，是研究早期酒精性肝損傷發(fā)病分子機(jī)制的理想模型。

[關(guān)鍵詞]酒精性肝??；大鼠；肝病模型；肝功能

[中圖分類號] R575 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）07（b）-0007-04

[Abstract]Objective To explore the method of establishing a model of early alcoholic liver disease（ALD） in rats in order to provide an ideal animal model for studying the molecular mechanism of early alcoholic liver injury.Methods Twenty-four male SD rats were randomly divided into experimental group （16 rats） and control group （8 rats）.In the control group，SD rats were fed with tap water.In the experimental group，SD rats were fed with alcohol of which the concentration of 7%-56% increased gradually for 12 weeks.During the experiment，the quantity of the fodder and the value of drinking were recorded everyday.Then the weight was weighed every week.24 and 12 hours before rats in experimental group were killed，they were treated with acute lavages with 56% alcohol.The activities of alanine aminotransferase （ALT），spartate aminotransferase （AST），riglyceride （TG） and total cholesterol （TC） in serum were determined by the fully automatic biochemical analyser.Moreover，the histological and morphological changes of liver tissues were observed. Results The growth rate of body mass was （160.09±3.12）% in the control group at the end of 12th week，while it was（61.67±1.98）% in the experimental group （P<0.05）.The ratio of liver body weight of the experimental group （3.74±0.54） was obviously increased compared with the control group （2.85±1.26）（P<0.05）.Compared with the control group，the levels of AST，ALT，TG and TC of the model group were clearly increased （P<0.05）.Meanwhile，the typical fatty liver pathologic changes，local inflammation and necrosis were observed in experimental group. Conclusion The results show that the ALD model with low mortality is stable and easy to copy，which is highly similar to the early ALD in human，and can be used in the study of ALD.

[Key words]Alcoholic liver disease；Rat；Liver disease model；Hepatic function

酒精濫用與依賴日益嚴(yán)重已成為世界性公共衛(wèi)生問題。長期大量飲酒易導(dǎo)致酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD），早期表現(xiàn)為脂肪肝，可發(fā)展為酒精性肝炎、肝纖維化及肝硬化；嚴(yán)重酗酒可造成廣泛肝細(xì)胞壞死甚至肝衰竭[1-3]。選擇與人類ALD相似的動物模型對研究其發(fā)病機(jī)制具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)建立酒精濃度梯度遞增的白酒長期喂養(yǎng)基礎(chǔ)上高濃度酒精急性灌胃誘導(dǎo)的大鼠肝損傷模型，旨在為ALD建立有價值的研究工具。

1材料與方法

1.1材料

SD雄性大鼠（清潔級）24只[西南醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，SCXK（川）2013-17]，平均體重（200±15）g，飼養(yǎng)條件：溫度20～25℃，相對濕度40%～70%。

1.2主要試劑

56度的北京紅星二鍋頭白酒；HE染色劑：珠海貝索技術(shù)有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）試劑盒：南京建成生物有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動物分組及處理

24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組16只，對照組8只，均標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。對照組飲自來水，模型組飲濃度梯度遞增的白酒12周，每周濃度：7%、14%、18%、22%、26%、30%、34%、45%、56%、56%、56%、56%。

1.3.2 觀察記錄大鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)顏色、飲食量、體重變化、死亡情況

1.3.3 肝組織標(biāo)本采集與處理

12周末，處死大鼠前24 h和12 h，模型組大鼠給予56度的北京紅星二鍋頭白酒（15 g/kg）灌胃2次，對照組等量生理鹽水灌胃。禁食6 h后，20%烏拉坦（5 ml/kg）麻醉，剖開腹腔，觀察肝臟大小和外觀。10%甲醛灌注固定30 min，分離肝臟，稱取重量；肝門處切取約10 mm×10 mm的組織，10%甲醛固定。

1.3.4大鼠體重增長率及肝臟指數(shù)

稱取大鼠體重，體重增長率（%）=（終重量-初始重量）/初始重量×100%。分離肝臟，稱取肝臟濕重，肝臟指數(shù)=（肝臟濕重/大鼠體重）×100%。

1.3.5血清學(xué)指標(biāo)檢測

麻醉大鼠后右心房取血，靜置30 min離心。按說明書采用全自動生化分析儀檢測ALT、AST、TG和TC含量。

1.3.6肝臟病理變化及肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

肝組織固定后脫水、包埋。常規(guī)方法制片，HE染色觀察大鼠肝臟病理學(xué)改變，判定肝脂肪變程度（F0～F4）、炎癥程度（G0～G4）和纖維化分級（S0～S4），根據(jù)酒精性肝病診療指南[4]分級標(biāo)準(zhǔn)（如下）統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.6.1酒精性脂肪肝 依據(jù)肝細(xì)胞脂肪變性占所獲取肝組織標(biāo)本量的范圍分為4度（F0～F4），肝細(xì)胞脂肪變F0：<5%：F1：≥5%～32%；F2：>32%～65%；F3：>65%～75%；F4>75%。

1.3.6.2酒精性肝炎 依據(jù)炎癥程度分為4級（G0～G4）：G0無炎癥；G1腺泡3帶呈現(xiàn)少數(shù)氣球樣肝細(xì)胞，腺泡內(nèi)散在個別點(diǎn)灶狀壞死和中央靜脈周圍炎；G2腺泡3帶明顯氣球樣肝細(xì)胞，腺泡內(nèi)點(diǎn)灶狀壞死增多，出現(xiàn)Mallory小體，門管區(qū)輕至中度炎癥；G3腺泡3帶廣泛的氣球樣肝細(xì)胞，腺泡內(nèi)點(diǎn)灶狀壞死明顯，出現(xiàn)Mallory小體和凋亡小體，門管區(qū)中度炎癥伴和（或）門管區(qū)周圍炎癥；G4融合性壞死和（或）橋接壞死。

1.3.6.3酒精性肝纖維化 依據(jù)纖維化的范圍和形態(tài)分為4期（S0～S4）：S0無纖維化；S1腺泡3帶局灶性或廣泛的竇周/細(xì)胞周纖維化和中央靜脈周圍纖維化；S2纖維化擴(kuò)展到門管區(qū)，中央靜脈周圍硬化性玻璃樣壞死，局灶性或廣泛的門管區(qū)星芒狀纖維化；S3腺泡內(nèi)廣泛纖維化，局灶性或廣泛的橋接纖維化；S4肝硬化。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；等級資料比較采用秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般情況

各組大鼠均無死亡。對照組大鼠活潑，毛發(fā)光澤，食量正常。模型組食欲減退，毛色發(fā)黃，光澤度差，部分大鼠精神狀態(tài)較差。模型組飲用液體量和食量均比對照組少。

2.2兩組大鼠體重增長率及肝臟指數(shù)的比較

模型組與對照組體重均有上升，與對照組比較，模型組體重增長較慢，后期有降低趨勢。12周后，對照組體重增長率明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組肝臟指數(shù)高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.3兩組大鼠血清學(xué)指標(biāo)的比較

模型組大鼠血清ALT、AST、TG、TC含量均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

2.4肝臟病理變化及肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

對照組肝臟棕紅色，表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)地柔軟；模型組肝臟色澤較暗，黃褐色，外觀腫大，邊緣圓鈍。HE染色顯示：對照組肝被膜完整，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊、緊密，胞質(zhì)豐富，僅有少量脂滴，無明顯變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤（圖1-A）。模型組肝小葉中央?yún)^(qū)受累明顯，中央靜脈擴(kuò)張，肝竇擴(kuò)張，周圍大量肝細(xì)胞水樣變性，脂肪變性明顯；有小灶性肝細(xì)胞壞死，未見片狀壞死；可見炎細(xì)胞浸潤，纖維病變不明顯（圖1-B）。按分級標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分后統(tǒng)計(jì)分析可見，模型組動物肝細(xì)胞脂肪變性和炎性病變程度與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩組肝細(xì)胞纖維性變程度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表3～5）。

3討論

酒精濫用與依賴現(xiàn)象日漸嚴(yán)重，ALD發(fā)病率呈逐年上升趨勢。10%～20%的長期大量飲酒者可發(fā)生程度不等的ALD，危害身體健康[5]。ALD模型建立與動物種屬、造模方法、條件、時間及實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡榷嘁蛩孛芮邢嚓P(guān)[6]。建立可重復(fù)、簡單易行、穩(wěn)定，且與臨床相似的動物模型對ALD的研究至關(guān)重要。

急性酒精灌胃、慢性酒精喂養(yǎng)、胃內(nèi)喂養(yǎng)等是國內(nèi)常用的ALD造模方法，其中急性酒精灌胃法較常用[7-10]，但各實(shí)驗(yàn)室在酒精濃度、劑量、灌胃次數(shù)等方面無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，且直接灌胃動物死亡率高，模型不穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)參照Maricic等[11-12]的方法進(jìn)行了改良，建立了以酒精濃度梯度遞增白酒長期喂養(yǎng)基礎(chǔ)上高濃度酒精急性灌胃誘導(dǎo)的大鼠ALD模型。該方法與臨床酒精性肝損傷患者發(fā)病過程相似，有良好模仿性，簡單易行。

通過對大鼠一般情況、體重增長率、肝臟指數(shù)等指標(biāo)的觀測，實(shí)驗(yàn)組與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝臟是酒精代謝的主要場所，長期過量飲酒可導(dǎo)致肝細(xì)胞變性，膜通透性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)容物釋放入血，血清酶學(xué)改變。ALT、AST是反映肝細(xì)胞損傷最敏感的指標(biāo)[13-14]，其中ALT診斷價值最高[15]，僅1%的肝細(xì)胞壞死即可致血清ALT水平升高1倍。當(dāng)AST值超過ALT時，提示肝實(shí)質(zhì)損害嚴(yán)重，為慢性加重標(biāo)志之一[16]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M血清ALT、AST均顯著高于對照組，說明該造模方式可有效損傷動物肝臟細(xì)胞，損壞肝功能。研究發(fā)現(xiàn)，酒精可通過產(chǎn)生自由基及脂質(zhì)過氧化作用造成肝細(xì)胞化學(xué)性損傷[17-18]。酒精進(jìn)入機(jī)體后，在乙醇脫氫酶和微粒體乙醇氧化酶作用下脫氫氧化為乙酸，使肝細(xì)胞內(nèi)還原型輔酶Ⅰ/輔酶Ⅰ（NADH/NAD）比值升高，抑制三羧酸循環(huán)，氧化脂肪酸能力下降，TG合成增加，肝細(xì)胞脂肪沉積導(dǎo)致細(xì)胞脂肪變性[19]。肝臟中蓄積的TG以極低密度脂蛋白（VLDL）形式出肝入血，血清TG含量相應(yīng)增加，是反映肝損傷的指標(biāo)之一[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動物血清模型組TG、TC均明顯高于對照組，證明該模型成功復(fù)制ALD特征。

長期酒精慢性刺激基礎(chǔ)上急性損傷后，模型組大鼠肝臟形態(tài)學(xué)和病理學(xué)檢測均見明顯異常。根據(jù)2010年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會公布的《酒精性肝病診療指南（2010年修訂版）》的組織病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，分級后統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明模型組動物肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯脂肪變性和炎性病變，與對照組比較，兩項(xiàng)指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而兩組肝細(xì)胞纖維性變程度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可能與該種造模方式酒精刺激較緩和，時間較短有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功獲得與人類飲酒習(xí)慣及臨床發(fā)病特征類似的ALD早期動物模型。該模型穩(wěn)定，操作簡便且動物死亡率低，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)靶向早期酒精性肝病的分子機(jī)制研究和臨床防治提供較好模型。

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（收稿日期：2017-04-12 本文編輯：任 念）