不同劑量黃芪注射液對病毒性心肌炎小鼠Caspase-3活性的影響

張蕓娟， 茍弘萍， 牛少敏， 董湘玉

不同劑量黃芪注射液對病毒性心肌炎小鼠Caspase-3活性的影響

張蕓娟， 茍弘萍， 牛少敏， 董湘玉

目的 觀察黃芪注射液對病毒性心肌炎小鼠發(fā)生細(xì)胞凋亡及對半胱天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)活性的影響。方法 4～6周齡雄性Balb/c小鼠60只，隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、黃芪低劑量組、黃芪中劑量組、黃芪高劑量組5組，每組各12只。制備小鼠急性病毒性心肌炎模型后黃芪低、中、高劑量組分別腹腔注射黃芪注射液0.1、0.2、0.4 mL/(g·d)，正常對照組及模型對照組分別給予腹腔注射生理鹽水0.1 mL/(g·d)，每日1次，連用14 d。在第3、7、10、14天取心臟及血清標(biāo)本，進(jìn)行病理學(xué)檢查、Caspase-3表達(dá)活性的檢測、肌酸肌酶同工酶(CK-MB)及心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)的檢測。結(jié)果 (1)模型對照組小鼠心肌病理積分、CK-MB、cTnⅠ值顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(2)黃芪低、中、高劑量組Caspase-3表達(dá)活性、CK-MB、cTnⅠ值、心肌病理積分均明顯低于模型對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(3)黃芪低、中、高劑量組各組間心肌病理積分、CK-MB及Caspase-3表達(dá)活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 (1)細(xì)胞凋亡參與了病毒性心肌炎發(fā)生時(shí)小鼠的心肌損傷，Caspase-3在其中起到重要作用；(2)小劑量的黃芪注射液即可以通過下調(diào)心肌細(xì)胞Caspase-3活性減少病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌細(xì)胞損傷。

病毒性心肌炎； 柯薩奇病毒B3； 細(xì)胞凋亡； 黃芪； Caspase-3； 小鼠

心肌炎是指在無明顯急慢性缺血狀態(tài)下，由各種病原體、免疫或非免疫因素引起的具有相同臨床及病理表現(xiàn)的心肌炎癥性疾病[1]，在兒科臨床工作中，病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)位于心肌炎之首位。其病理表現(xiàn)可總結(jié)為局灶、彌漫的心肌細(xì)胞間質(zhì)性的炎性滲出，細(xì)胞的纖維化，甚至細(xì)胞的壞死。同時(shí)可伴心內(nèi)膜、心包的炎癥性改變[2]。由于心肌細(xì)胞表面存在著腸道病毒家族受體：柯薩奇-腺病毒受體[3]，腸道病毒柯薩奇B組(coxsackie viruses group B，CVB)2～5型和A組9型病毒及腺病毒成為VMC最為常見的易感病毒[4]。因此本實(shí)驗(yàn)選用柯薩奇病毒B3(coxsaekie virus B3，CVB3)所致心肌炎小鼠作為模型，利用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，通過觀察不同劑量黃芪注射液對CVB3所致心肌炎小鼠心肌組織中心肌細(xì)胞凋亡調(diào)控因子半胱天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)活性的影響，研究其在心肌細(xì)胞凋亡過程中所發(fā)揮的免疫調(diào)控機(jī)制，為VMC的臨床治療提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物 近交系純種、雄性SPF級BALB/c小鼠60只，4～6周齡，體質(zhì)量16～18 g，蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心購買[合格證號：SYXK(甘)2014-0001-0060]。60只BALB/c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、模型對照組、黃芪低劑量組、黃芪中劑量組、黃芪高劑量組5組，每組各12只。

1.2 模型制備 除正常對照組外其余各組分別腹腔接種1×103PFU/mL CVB3病毒液0.4 mL，制備小鼠急性VMC模型；正常對照組給予Eagel′s培養(yǎng)液(不含病毒)0.4 mL腹腔注射。受病毒接種1 h后黃芪低、中、高劑量組分別腹腔注射黃芪注射液0.1、0.2、0.4 mL/(g·d)，每日1次，連用14 d。正常對照組及模型對照組分別給予腹腔注射生理鹽水0.1 mL/(g·d)，每日1次，連用14 d。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察心肌組織病理學(xué)變化，計(jì)算心肌組織標(biāo)本的病理積分(Rezkalla方法[5])；觀察血清心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ,cTnⅠ)水平；外周血肌酸肌酶同工酶(CK-MB)活性變化；檢測心肌細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 小鼠心肌組織的病理學(xué)變化 造模第14天，正常對照組無細(xì)胞壞死及炎癥性細(xì)胞浸潤(圖1a，見封三)。模型對照組心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂，間質(zhì)幾無炎癥細(xì)胞浸潤，膠原組織明顯增多，增多的纖維結(jié)締組織將心肌細(xì)胞分割呈片狀、篩網(wǎng)狀(圖1b，見封三)；黃芪低劑量組炎癥改變逐漸恢復(fù)，病灶內(nèi)可見不同程度的纖維化，心肌纖維排列紊亂、疏松、可見少量的炎性細(xì)胞浸潤(圖1c，見封三)。

應(yīng)用Rezkalla方法計(jì)算各組各時(shí)間點(diǎn)心肌病變積分見表1。

組別n3d7d10d14d正常對照組120000模型對照組120.48±0.191.98±0.383.60±0.253.80±0.49黃芪低劑量組120.35±0.280.59±0.191.49±0.310.77±0.28黃芪中劑量組120.25±0.050.66±0.241.38±0.190.78±0.59黃芪高劑量組120.28±0.180.62±0.391.42±0.370.80±0.43F235.60252.30432.30156.40P<0.05<0.05<0.05<0.05

表1結(jié)果表明，各時(shí)間點(diǎn)模型對照組心肌病理積分均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各時(shí)間點(diǎn)黃芪低、中、高劑量組心肌病理積分均低于模型對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各時(shí)間點(diǎn)黃芪低、中、高劑量組心肌病理積分兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型對照組小鼠在感染后第3天心肌病理積分開始增高，第14天為高峰；黃芪低、中、高劑量組小鼠第3天心肌病理積分開始增高，第10天為高峰，第14天開始下降。

2.2 各組小鼠血清cTnⅠ檢測結(jié)果比較 見表2。

組別n3d7d10d14d正常對照組120.063±0.0040.061±0.0040.061±0.0030.062±0.004模型對照組120.088±0.0090.321±0.0120.344±0.0320.120±0.007黃芪低劑量組12—0.069±0.0030.065±0.0210.067±0.003黃芪中劑量組12—0.070±0.0240.068±0.0330.064±0.031黃芪高劑量組12—0.074±0.0310.069±0.0560.068±0.014F/t3.0615.8780.2318.32P<0.05<0.05<0.05<0.05

表2結(jié)果表明，各時(shí)間點(diǎn)模型對照組cTnⅠ值均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。除第3天各時(shí)間點(diǎn)黃芪低、中、高劑量組cTnⅠ值均低于模型對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各時(shí)間點(diǎn)黃芪低、中、高劑量組cTnⅠ值兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。正常對照組cTnⅠ未見明顯變化，模型對照組小鼠在感染后第3天血清cTnⅠ已增高，第7～10天達(dá)到高峰，第14天仍高于正常對照組；黃芪低、中、高劑量組小鼠血清cTnⅠ降低。

2.3 各組小鼠血清CK-MB檢測結(jié)果比較 見表3。

組別n3d7d10d14d正常對照組12326.75±32.01323.24±33.29312.89±32.74311.32±24.83模型對照組12466.89±32.74621.57±29.19606.73±31.02582.14±34.19黃芪低劑量組12335.65±12.98398.68±38.47378.48±23.13362.79±24.75黃芪中劑量組12346.63±32.45376.47±52.12368.35±14.79364.64±45.21黃芪高劑量組12330.63±12.75358.42±36.15364.24±12.68354.62±16.37F156.30178.60248.50146.80P<0.05<0.05<0.05<0.05

表3結(jié)果表明，各時(shí)間點(diǎn)模型對照組CK-MB值均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各時(shí)間點(diǎn)黃芪低、中、高劑量組CK-MB值均低于模型對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各時(shí)間點(diǎn)黃芪低、中、高劑量組CK-MB值兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型對照組小鼠血清CK-MB在感染后第3天明顯升高，第7天達(dá)高峰，第14天有所下降。

2.4 實(shí)驗(yàn)第7天各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況 正常對照組有極少量凋亡細(xì)胞(圖2a，見封三)，模型對照組心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡(圖2b，見封三)，黃芪低、中、高劑量組凋亡細(xì)胞相對較少(圖2c，見封三)。

3 討論

VMC發(fā)生時(shí)，心肌細(xì)胞可能直接受到病毒侵犯、損傷[6]，受病毒侵犯的心肌亦可能最終成為病毒的宿主，產(chǎn)生對該病毒的特異性免疫應(yīng)答，即抗心肌抗體，最終被產(chǎn)生的心肌抗體溶解[2]。包括抗線粒體蛋白抗體、抗膜受體抗體、抗肌球蛋白α、β重鏈抗體、抗肌膜抗體等[7]；生化方面，超氧化物歧化酶是另一重要的致病因子，其在急性期降低，恢復(fù)期升高，治療中應(yīng)用抗氧化劑會有明顯的效果[8]。心肌細(xì)胞的凋亡機(jī)制為VMC另一個(gè)重要的致病機(jī)制[9]：Kyto等[10]提出細(xì)胞凋亡參與著VMC的發(fā)展，更會誘導(dǎo)、加重心肌的病變。Saraste等[11]提出VMC早期更易發(fā)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。Zorc-Pleskovic等[12]提出VMC的病理發(fā)展過程中，存在著細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。Binah[13]提出淋巴細(xì)胞中的孔道蛋白及絲氨酸磷脂酶，能夠使靶細(xì)胞凋亡。Fas/FasL系統(tǒng)可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞與心肌細(xì)胞相結(jié)合，使心肌細(xì)胞的離子通道功能紊亂，發(fā)生細(xì)胞凋亡[14]。

心肌細(xì)胞凋亡的過程是一個(gè)受多基因調(diào)控的級聯(lián)反應(yīng)過程，其中Caspases家族是這一過程的中心環(huán)節(jié)，它含有半胱氨酸的活性，屬胞漿蛋白酶家族，在心肌細(xì)胞的凋亡過程中起到重要作用，同時(shí)更是其重要的執(zhí)行者。其中Caspase-3是終末步驟，參與著細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15]。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用Caspase的抑制劑，能夠有效減少40%～60%心肌細(xì)胞的損傷，實(shí)驗(yàn)組小鼠被敲除Caspase-3的基因后，其生存率明顯提高。Caspase的抑制劑，通過降低CD19+B細(xì)胞中CVB3的負(fù)荷，抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制及釋放[16]。

黃芪注射液中主要成分黃芪作為我國傳統(tǒng)中藥材之中的一員，又被稱為獨(dú)根、綿黃、二人抬，系豆科植物：莢膜黃芪、蒙古黃芪的干燥根，在我國經(jīng)典論著《神農(nóng)本草經(jīng)》中，因其具有益氣、固表、補(bǔ)氣升陽、托毒生肌、利水退腫等功效，而被列為上品。而其“益氣活血”“扶正固本”之功能，正適用于VMC中醫(yī)辨證所說“氣虛血瘀型”及“氣陰兩虛型”之病。本實(shí)驗(yàn)選用不同劑量的黃芪注射液觀察其對VMC小鼠的治療作用，通過各組小鼠心肌病理學(xué)改變、血清心肌酶水平改變等各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示細(xì)胞凋亡參與了VMC發(fā)生時(shí)小鼠的心肌損傷，Caspase-3在其中起到重要作用；小劑量的黃芪注射液即可以通過下調(diào)心肌細(xì)胞Caspase-3活性減少VMC小鼠心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌細(xì)胞損傷，提高小鼠的生存質(zhì)量，得到理想的治療效果。將傳統(tǒng)的治療方案結(jié)合中醫(yī)中藥治療有著獨(dú)特的優(yōu)勢，本實(shí)驗(yàn)對中西醫(yī)結(jié)合治療VMC方面具有重要的指導(dǎo)意義。這可能成為VMC治療中的新思路、新線索。

[1] Ellis CR, Di Salvo T. Myocarditis: basic and clinical aspects[J].Cardiol Rev,2007,15(4):170-177.

[2] Huber S.T cells in coxsackievirus-induced myocarditis[J]. Viral Immunol,2004,17(2):152-164.

[3] Ito M, Kodama M, Masuko M, et al. Expression of coxsackievirus and adenovirus receptor in hearts of rats with experimentalautoimmune myocarditis[J]. Circ Res,2000,86(3):275-280.

[4] Bowles NE, Ni J, Kearney DL, Pauschinger M,et al. Detection of viruses in myocardial tissues by polymerase chain reaction. evidence ofadenovirus as a common cause of myocarditis in children and adults[J].J Am Coll Cardiol,2003,42(3):466-472.

[5] Rezkalla S, Kloner RA, Khatib G,et al. Effect of delayed captopril therapy on left ventricular mass and myonecrosis during acutecoxsackievirus murine myocarditis[J]. Am Heart J,1990,120(6 Pt 1):1377-1381.

[6] Brady WJ, Ferguson JD, Ullman EA,et al. Myocarditis: emergency department recognition and management[J]. Emerg Med Clin North Am,2004,22(4):865-885.

[7] Caforio AL, Mahon NJ, Tona F,et al.Circulating cardiac autoantibodies in dilated cardiomyopathy and myocarditis: pathogenetic andclinical significance[J]. Eur J Heart Fail,2002,4(4):411-417.

[8] Si X, McManus BM, Zhang J,et al. Pyrrolidine dithiocarbamate reduces coxsackievirus B3 replication through inhibition of theubiquitin-proteasome pathway[J]. J Virol,2005,79(13):8014-8023.

[9] Lu D, Liu J, Jiao J,et al. Transcription factor Foxo3a prevents apoptosis by regulating calcium through the apoptosisrepressor with caspase recruitment domain[J].J Biol Chem,2013,288(12):8491-8504.

[10]Kyto V, Saraste A, Saukko P, et al.Apoptotic cardiomyocyte death in fatal myocarditis[J]. Am J Cardiol,2004,94(6):746-750.

[11]Saraste A, Arola A, Vuorinen T, et al.Cardiomyocyte apoptosis in experimental coxsackievirus B3 myocarditis[J]. Cardiovasc Pathol,2003,12(5):255-262.

[12]Zorc-Pleskovic R, Alibegovic A, Zorc M, et al. Apoptosis of cardiomyocytes in myocarditis[J]. Folia Biol (Praha),2006,52(1-2):6-9.

[13]Binah O. Cytotoxic lymphocytes and cardiac electrophysiology[J]. J Mol Cell Cardiol,2002,34(9):1147-1161.

[14]Shilkrut M, Yaniv G, Asleh R,et al. Tyrosine kinases inhibitors block Fas-mediated deleterious effects in normoxic and hypoxicventricular myocytes[J]. J Mol Cell Cardiol,2003,35(10):1229-1240.

[15]Zidar N, Jera J, Maja J,et al. Caspases in myocardial infarction[J]. Adv Clin Chem,2007,44:1-33.

[16]DeBiasi RL, Robinson BA, Sherry B,et al. Caspase inhibition protects against reovirus-induced myocardial injury in vitro and in vivo[J]. J Virol,2004,78(20):11040-11050.

(本文編輯：劉穎)

Effect of different dose of astragalus injection on the Caspase-3 activity of mice with viral myocarditis

ZHANGYunjuan，GOUHongping，NIUShaomin，DONGXiangyu.

DepartmentofPediatricCardiology,LanzhouUniversitySecondHospital,Lanzhou730030，China

Objective To observe the effect of astragalus injection on cell apoptosis in mice with viral myocarditis and on the Caspase-3 activity.Methods A total of 60 male Balb/c mice(4 to 6 weeks old) were randomly divided into 5 groups: normal control group(A), model control group(B), low-dose astragalus group(C), middle-dose astragalus group(D) and high-dose astragalus group(E),12 mice in each group. After the mice model of acute viral myocarditis was made, astragalus injection was injected into the abdominal cavity of the mice in group C,D and E[0.1，0.2，0.4 mL/(g·d)], while normal saline was injected in group A and B[0.1 mL/(g·d)],once a day for continuously 14 days. On day 3,7,10,and 14,heart and serum samples were taken for pathological testing and the detection of Caspase-3 activity, CK-MB and cTnI.Results (1)Myocardial pathological score, and the value of CK-MB and cTnI of mice in group B were significantly higher than those of group A, the difference being statistical(P<0.05).(2)The Caspase-3 activity, CK-MB, cTnI value and myocardial pathological score in group C,D and E were significantly lower than those in group B, with significant difference(P<0.05).(3)There was no statistical difference on myocardial pathological score, CK-MB or Caspase-3 activity among group C,D and E(P>0.05).Conclusion (1)Cell apoptosis is involved in the myocardial damage of mice with viral myocarditis, and Caspase-3 plays an important role in it.(2)Small-dose astragalus injection can reduce the apoptosis of myocardial cells in mice with viral myocarditis by down-regulating the Caspase-3 activity of myocardial cells, and thus alleviate the damage to myocardial cells.

Viral myocarditis； Coxsacki virus B3； Cell apoptosis； Astragalus； Caspase-3; Mice

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院院內(nèi)中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(YJzy2013-20)

730030 蘭州，蘭州大學(xué)第二醫(yī)院小兒心血管科

張蕓娟(1983-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，醫(yī)師。研究方向：小兒心血管系統(tǒng)疾病的診治

董湘玉，E-mail：1363918724@qq.com

10.3969/j.issn.1674-3865.2017.04.003

R725.4

A

1674-3865(2017)04-0283-04

2016-12-12)

實(shí)驗(yàn)論著