水稻根系耐鎘促生菌的篩選

陸仲煙+杜國冬+時鵬濤+秦玉燕+王運儒

摘 要：根際促生菌（PGPR）是指生活于植物根際環(huán)境，并能直接或間接促進植物生長的微生物。PGPR能通過產生生長激素，鐵載體、ACC脫氨酶和增加根系溶磷量等來促進植物生長，提高植物抗病性和抗逆性。本研究采用培養(yǎng)基加鎘平板法分離出兩株耐鎘細菌，并對兩株細菌對水稻的促生效應進行了驗證。

關鍵詞：水稻根；生菌

一、材料與方法

1.試驗材料。水稻根際土壤（取于廣西環(huán)江縣Cd污染稻田），牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

2.耐鎘細菌的分離。采用培養(yǎng)基加Cd平板法分離耐鎘細菌 （陳金生等，2005）。取10 g水稻根際土放入裝有90 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基和適量玻璃珠的三角瓶中，以150 rpm，37 ℃在搖床上振蕩12 h。吸取0.1 mL，分別涂布在含Cd為0 mg/L，100 mg/L，300 mg/L，500 mg/L和1000 mg/L的培養(yǎng)基平板上，每個處理重復3次。將平板倒置至恒溫箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。再將以上平板上的菌株用平板劃線法接種于Cd濃度為500 mg/L的培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。將所得菌株在500 mg/L的培養(yǎng)基上重復接菌培養(yǎng)3次。最后將分離復篩所得的菌株在4 ℃下斜面保存于冰箱中。

3.耐鎘細菌生長曲線的測定。在斜面保存的菌種中挑取1環(huán)菌落接入100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在搖床上以150 rpm，37 ℃培養(yǎng)12 h，得到種子培養(yǎng)液。吸取4 mL種子液加入含100 mL 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃，150 rpm 培養(yǎng)56 h，每4小時在分光光度計上測定在波長660 nm下的OD值，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制耐鎘細菌的生長曲線。

4.耐鎘細菌對水稻促生效應。用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基在37 ℃，150 rpm，pH為5.5的條件下培養(yǎng)菌株。將培養(yǎng)24 h的菌種，在10000 rpm，25℃條件下離心10 min。去掉上清液，再用滅菌去離子水水重新懸浮菌體，重復3次，調節(jié)OD值，使有效活菌數為1×108 cfu/mL。將石英砂洗凈后曬干，每盤1kg裝于直徑10 cm，高15 cm塑料盆中，備用。選取飽滿均一的水稻種子在5% NaClO溶液中浸泡15分鐘后，用蒸餾水洗凈。播種于育苗盤中，待水稻苗子長到四葉一心后開始移苗。選長勢大小均一的苗子移栽到裝有石英砂的小塑料盆中，每盤6株，移完后澆灌500 mL的霍格蘭營養(yǎng)液。加菌處理的部分水稻苗移栽前用有效活菌數為1×108 cfu/mL菌液液浸泡兩個小時。在Cd處理的盆中，營養(yǎng)液澆灌前先添加CdCl2，使Cd濃度為5 mg/L。營養(yǎng)液用0.1 M HCl和0.1 M NaOH調節(jié)pH至5.5。每天澆灌營養(yǎng)液使液面保持在一定高度。移栽兩周后往加菌處理里每盆注射10 mL的菌液于根系附近。培養(yǎng)30 d，每天觀察記錄水稻的生長情況。

二、結果與分析

1.耐鎘菌株的獲得。經分離復篩后，從水稻根際土壤中獲得2株耐Cd細菌。菌株能在含500 mg/L Cd的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中正常生長。將菌株分別命名為菌株A和菌株B。菌株A為淡綠色，菌株B為淺紅色。兩菌株菌落均較小，呈圓形，表面光滑，菌落黏稠，容易挑取。

2.耐鎘菌株的生長曲線。如圖2.1所示，兩菌株均在經歷了4 h的延緩期后開始進入對數生長期，菌株A在24小時后進入進入穩(wěn)定期，48 h后進入衰亡期，而菌株B約在28小時才后進入穩(wěn)定期，44小時就進入衰亡期。在相同條件下，菌株B的細胞濃度較大，繁殖能力較強。

3.耐鎘菌株對水稻生長的影響。Cd脅迫下，水稻生長受阻，植株生長矮小，葉片從老葉開始干枯，新葉黃化。兩個菌株都未能緩解水稻受害癥狀。在無Cd條件下，接種處理也未能促進水稻生長。接菌處理與不接菌處理的水稻形態(tài)特征無差異。表明，兩個菌株對水稻都沒有促生效應。

三、結論

從南方Cd污染水稻田的水稻根際土中能分離篩選出耐鎘細菌。所分離的兩個菌株和伯克氏菌均能在500 mg/L的Cd脅迫下正常生長，有極強的耐鎘能力。兩個菌株對水稻沒有促生效應。

四、討論

PGPR能產生生長素并具有溶磷能力，生長素能促進根系伸長和不定根的發(fā)育，可提高植物對N、P等營養(yǎng)元素的吸收，促進作物生長 （Spaepen et al.， 2007； Mantelin et al.， 2004； Adesem et al.， 2008）。Vivas 等將從鋅污染土壤中分離出來的Brevibacillus 屬的PGPR應用到鋅污染的土壤中，結果發(fā)現分離出來的PGPR能顯著提高植物生物量，提高氮、磷的積累（Vivas et al.， 2006）。PGPR能增加紫花苜蓿的出苗率，增加根長、株高和生物量以及葉綠素含量 （安永輝等，2009）。接種芽孢桿菌DBM能有效緩解鋅毒害，顯著促進水稻生長，加菌處理比不加菌對照的地上部和根部干重分別高出97.8%和77.2%（陳佛保等，2012）。

將PGPR作為生防菌的研究報道較多，國內外現已發(fā)現包括根瘤菌、芽孢桿菌、熒光假單胞菌、沙雷氏屬等20多個種屬的根系微生物有作為生防菌的潛力。目前這一領域的研究已經深入到基因組學和蛋白質組學層面。PGPR生防菌可提高黃瓜對甲蟲和馬賽克病毒的抗性 （Ramamoorthy et al.， 2001），能有效防治水稻白葉病，降低病葉率 （王金生等，2001）。一般認為，PGPR提高植物抗病性的機理主要是PGPR搶先占據了植物根圍和葉圍中的競爭位點，并能產生水楊酸、嗜鐵素等物質來誘導寄主植物對病原菌的抗性（康貽均，程潔，2010）。

PGPR能提高植物對干旱、鹽分、重金屬等非生物脅迫的忍耐力（康貽均，程潔，2010）。由于人地矛盾的突出和重金屬污染土壤的加劇，PGPR在非生物脅迫領域特別是重金屬脅迫逐漸成為研究的熱點。在逆境脅迫下，植物會產生大量的乙烯，抑制植物生長，加速器官衰老。而PGPR產生的ACC脫氨酶能夠降解乙烯合成的前體物質ACC，減少乙烯含量，從而緩解了逆境脅迫，提高植物抗逆能力（Penrose et al.， 2001； Glick et al.， 2007）。Zhang 研究發(fā)現，在重金屬脅迫下，PGPR能提高植株體內POD、SOD、CAT的活性，抵御重金屬產生的氧化脅迫，促進植物生長 （Zhang et al.， 2010）。一些耐重金屬的PGPR可通過釋放金屬螯合劑，和改變氧化還原電位等來降低重金屬的有效性，或降低其毒性，而使植物免受重金屬的毒害。

參考文獻：

[1]安永輝.植物促生菌對紫花苜蓿幼苗生長及生理的影響 [碩士學位論文].長春：東北師范大學，2009.

[2] 陳佛保，柏 珺，林慶祺，等. 植物根際促生菌（PGPR）對緩解水稻受土壤鋅脅迫的作用.農業(yè)環(huán)境科學學報，2012，31 （1）：67-74.

[3]康貽均，程潔. 植物根系促生菌作用機制研究進展.應用生態(tài)學報，2010，21（1）：232-238.

[4] Abou-Shanab R.A.， Angle J.S.， Van Berkum P.. Chromate-tolerant bacteria for enhanced metal uptake by Eichhornia crassipes （Mart.）. Int J. Phytoremediation， 2007， 9 （2）： 91-105.

[5] Adesem A.O.， Torbert H.A.， Kloepper J.W.. Enhanced plant nutrient use efficiency with PGPR and AMF in an integrated nutrient management system. Canadian Journal of Microbiology， 2008， 54 （1）： 876- 886.

[6]Chen Zhaojin， Sheng Xiafang， He Linyan， et al.. Effects of root inoculation with bacteria on the growth， Cd uptake and bacterial communities associated with rape grown in Cd-contaminated soil. Journal of Hazardous Materials， 2013， 244 （1）： 709-717.