14個辣椒雜交種純度鑒定的SSR引物篩選

杜培粉

摘 要：利用73對多態(tài)性較好的辣椒SSR引物，對湘研種業(yè)的14個辣椒品種進行差異性篩選，結(jié)果表明，每個品種都有1對以上SSR引物可將其父本、母本及F1代區(qū)分開；同時對每個品種的多個批次進行驗證，檢測結(jié)果與田間檢測結(jié)果基本相符。因此，可利用SSR分子標記技術(shù)進行辣椒種子室內(nèi)純度鑒定，且具有簡單、快速、準確、重復性好等優(yōu)點，SSR分子標記在辣椒種子室內(nèi)純度快速檢測方面具有很大的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：辣椒；SSR標記；純度鑒定

辣椒（Capsicum annuum L.）屬茄科辣椒屬，原產(chǎn)中南美洲，在溫帶地區(qū)為一年生植物，是我國主要的蔬菜，也是重要的調(diào)味品，其栽培面積在我國蔬菜作物中位居第二。辣椒營養(yǎng)豐富，維生素C含量在蔬菜中居首位，還含有豐富的辣椒堿、辣椒素、胡蘿卜素、檸檬酸、茄堿等有益物質(zhì)，具有增強食欲、幫助消化、增強人體抵抗力、抵御多種疾病的作用。在植物育種和種子生產(chǎn)的過程中，F(xiàn)1代雜交種的純度鑒定工作是種子質(zhì)量控制的一個重要環(huán)節(jié)，隨著育種進程的加快，辣椒品種越來越多，對優(yōu)質(zhì)雜交種的種類和需求量日益增加，使辣椒雜交種質(zhì)量鑒定研究工作顯得極其重要。

SSR標記也稱微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA），是近年來發(fā)展起來的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標記技術(shù)。與其他分子標記（AFLP、RAPD、RFLP等）相比，SSR標記具有以下優(yōu)點：

①多態(tài)性高，覆蓋整個基因組；②具有多等位基因的特性，提供的信息量高；③以孟德爾方式遺傳，通常呈共顯性標記，具有很好的穩(wěn)定性，可以鑒別純合體和雜合體；④所需DNA量少等。SSR標記技術(shù)廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性的研究、親緣關(guān)系的研究以及構(gòu)建遺傳連鎖圖譜和基因定位。

近年來，利用SSR標記技術(shù)進行雜交種純度鑒定在玉米、棉花等作物上[1～3]均有報道，但辣椒上很少見。利用SSR標記技術(shù)，篩選出適合14個雜交種室內(nèi)純度鑒定的SSR引物，初步建立了辣椒雜交種種子室內(nèi)純度鑒定的SSR體系。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用的14個辣椒品種全部來自湖南湘研種業(yè)有限公司，是2014年秋季制種。試驗于2015年進行。每個品種取100粒種子，均勻播在發(fā)芽盒中，于恒溫箱中30℃放置8 d，待長出第一片真葉時進行試驗。

1.2 方法

①辣椒總DNA的提取 取發(fā)芽一周的雜交種及其父母本的幼苗，參照CTAB法提取DNA[4]，由于純度鑒定的樣本量較多，為提高工作效率，且保證DNA質(zhì)量，將CTAB法進行簡化，在轉(zhuǎn)換離心管時直接轉(zhuǎn)到96孔板中，這樣得到的DNA不僅濃度足夠高，且純度也很高，保證了下一步試驗準確、方便、快速進行。

②PCR反應(yīng) 10 μL反應(yīng)體系 10×PCR Buffer

1 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL，引物0.3 μL，模板DNA 2 μL，Taq DNA聚合酶 2.5 U 0.1 μL，用無菌水補充到10 μL。反應(yīng)程序：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，10℃保存。

③電泳檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物 利用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（220 V，60 min），檢測PCR擴增產(chǎn)物，電泳完成后，利用銀染色法，觀察記錄，找出父母本間有差異的條帶，重復性好，且擴增條帶清晰的SSR引物，用于雜交種純度鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物的篩選

利用SSR分子技術(shù)進行純度檢測，首先要篩選出父母本帶型互補的特征引物，且?guī)颓逦⒉町惷黠@。本試驗用73對SSR引物（由上海英濰捷基生物公司合成），對14個雜交種及其父母本進行PCR擴增，每個品種都有一對以上的特征引物可用，這些特征引物能清晰地將相應(yīng)的雜交種及其父母本區(qū)分開（圖1），并可鑒定出其他的混雜品種。從試驗結(jié)果可以看出，CA-336-2和CA-644-5分別可以鑒定5個雜交種，CA-117-6可以鑒定3個雜交種，CA-864-1、CA-089-3和CA647-2可以鑒定3個雜交種（表1），所用引物序列見表2。

2.2 雜交種的純度鑒定

利用篩選到的特征性引物，對公司制的批量種子進行純度鑒定，提取雜交種及其相應(yīng)的親本DNA進行SSR分析，經(jīng)電泳、染色、讀帶。圖2中母本條帶清晰可見，說明雜交種中有未授上粉的母本，圖3未發(fā)現(xiàn)雜帶，圖4中出現(xiàn)了不同于親本及雜交種的帶型，認為是異品種，統(tǒng)計的室內(nèi)分子純度結(jié)果與田間純度鑒定結(jié)果相比較，結(jié)果基本吻合（表3）。這說明本試驗篩選的SSR引物可用于雜交種的純度檢測，且結(jié)果具有可靠性和實用性，可為種子的提前銷售提供一定的依據(jù)。

3 討論

分子標記技術(shù)已應(yīng)用于作物種質(zhì)資源和遺傳育種的研究[5，6]，特別是在構(gòu)建指紋圖譜和標記目的性狀基因方面取得了進展。楊娟等[7]將SSR標記和SCAR標記結(jié)合起來，建立多重PCR技術(shù)，進行辣椒恢復基因及其等位基因純合狀態(tài)的選擇，顯著提高了辣椒雄性不育三系的選擇效率。但多數(shù)分子標記方法所需的試驗成本較高、技術(shù)難度大、或穩(wěn)定性差，只能適用于相關(guān)的科學研究，很難在種子企業(yè)推廣。本研究采用簡化的CTAB法，解決了大批量提取DNA的問題，既節(jié)省了費用，又保證了DNA質(zhì)量，縮短了純度檢測的時間。目前，分子標記育種技術(shù)尚不成熟和完善，還不能作為一種育種方法單獨使用，辣椒上SSR標記的研究剛起步，已經(jīng)開發(fā)的SSR標記較少[8]，隨著更多辣椒SSR位點的開發(fā)及研究應(yīng)用，將進一步推動SSR標記在種子純度檢驗、遺傳育種及其他研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。而我國傳統(tǒng)育種經(jīng)驗豐富，將分子標記這一先進技術(shù)與育種家的豐富經(jīng)驗相結(jié)合，能使分子標記輔助選擇發(fā)揮其更大的作用。

參考文獻

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[8] Lee J M， Nahm S H， Kim Y M， et al. Characterization and molecular genetic mapping of microsatelliite loci in pepper[J]. Theor Appl Genet， 2004， 108： 619-627.

Abstract： By using 73 pairs of pepper SSR primers with better polymorphism， the differerce screening experiment of 14 pepper cultivars from Xiangyan Seed Industry Co.， Ltd. was carried out. The results showed that for each cultivar， there was more than one pair of SSR primers could distinguish their male parent， female parent and F1 generation. At the same time， the verification experiment about many batches of each cultivar was also carried out， and the detection results were consistent with the field testing results. Therefore， SSR molecular marker technology could be applied on the indoor seed purity identification of pepper， and it had the advantages of simple， rapid， accurate and reproducible， which had a wide application prospect in the rapid detection of indoor purity of pepper seeds.

Key words： Pepper； SSR markers； Purity identification