微生物法測(cè)定米粉中維生素B6含量不確定度評(píng)估

熊 娟，蔡大川*，張燕忠，陳敏兒，黃璇瑩

(1.中國(guó)廣州分析測(cè)試中心， 廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 510070； 2.廣東省汕頭市潮汕工夫茶研究所)

微生物法測(cè)定米粉中維生素B6含量不確定度評(píng)估

熊 娟1，蔡大川1*，張燕忠2，陳敏兒1，黃璇瑩1

(1.中國(guó)廣州分析測(cè)試中心， 廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 510070； 2.廣東省汕頭市潮汕工夫茶研究所)

應(yīng)用微生物法測(cè)定米粉樣品中維生素B6含量，并從多個(gè)方面分析測(cè)量的不確定度。試驗(yàn)結(jié)果表明：相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.01393，擴(kuò)展不確定度為0.1653，測(cè)量結(jié)果為(5.932±0.1653) μg/hg；影響維生素B6測(cè)定結(jié)果的最主要不確定度分量為微量移液槍容差。

微生物法；維生素B6；不確定度；評(píng)估

維生素B6是嬰幼兒米粉中的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中有嚴(yán)格的限量，但由于其含量較低，常用的高效液相法、氣相色譜法等由于檢出限較高，難以準(zhǔn)確測(cè)量其含量，微生物法因其靈敏度高，被國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)納入國(guó)家仲裁測(cè)定法。但微生物法操作繁瑣、菌株生長(zhǎng)不確定性強(qiáng)，使得測(cè)定結(jié)果受多種因素的影響，最新版國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.154-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素B6的測(cè)定》中第二法規(guī)定試驗(yàn)室可采用商品化的試劑盒替代傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)曲線制定，以減少試驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)誤差[1]。

商品試劑盒性質(zhì)穩(wěn)定，但是測(cè)量過程中還是會(huì)不可避免地產(chǎn)生不確定度[2-4]。因此，不確定度的測(cè)量也越來越被大家所重視[5-7]。本文根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.154-2016，采用微生物法測(cè)定米粉樣品中維生素B6含量，分析試驗(yàn)過程中各種影響因素，并根據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》CNAS—GL06對(duì)不確定的來源進(jìn)行分析和計(jì)算，得出擴(kuò)展不確定度[8]。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

VitaFast@Vitamin B6檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于拜發(fā)分析系統(tǒng)銷售(北京)有限公司，用于定量檢測(cè)食品、藥品和動(dòng)物飼料中的維生素B6含量；SHP-250型生化培養(yǎng)箱，購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，廣泛用于培養(yǎng)試驗(yàn)等；Thermo酶標(biāo)檢測(cè)儀MK3，購(gòu)于賽默飛世爾(上海)儀器有限公司，用于測(cè)量板孔吸光度值。

1.2 試驗(yàn)方法

稱取2.5 g均質(zhì)米粉樣品放入250 mL 錐形瓶中，加入50 mL pH值為4.5的檸檬酸鹽緩沖液，搖勻。加入25 mg馬鈴薯酸性磷酸酶，搖勻。37℃暗處孵育1 h，不時(shí)振蕩。精確加入蒸餾水100 mL，搖勻。95℃水浴提取30 min，其間振蕩至少5次，確保離心管緊閉。迅速冷卻到 30℃以下。離心后根據(jù)濃度范圍，確定是否在2 mL無菌小試管中進(jìn)一步稀釋上清液。

加入10 mL無菌水至試劑盒中維生素B6培養(yǎng)基瓶中，擰緊培養(yǎng)基瓶，搖勻。95℃加熱5 min，其間振蕩至少2次，迅速冷卻至室溫。使用0.2 μm無菌濾膜過濾培養(yǎng)基至無菌離心管中。

取6個(gè)無菌管，按照試劑盒說明書準(zhǔn)備以下濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0、0.002、0.004、0.006、0.008、0.012 mg/hg。樣品提取稀釋倍數(shù)1∶40已經(jīng)包含在標(biāo)準(zhǔn)曲線中。

取出需要數(shù)量的微孔板條并在板上固定，移取150 μL培養(yǎng)基至各微孔中，然后移取150 μL各標(biāo)準(zhǔn)品或稀釋的樣品至指定的微孔中。封閉微孔板條后在30℃條件下暗處孵育44～48 h，用酶標(biāo)儀在630 nm條件下讀取吸光度。

1.3 數(shù)學(xué)模型

米粉中維生素B6(μg/hg)含量按下式計(jì)算：

維生素B6(X)=樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取的濃度(C)×稀釋倍數(shù)(n)×0.822/樣品量(m)

則X的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

1.4 不確定度分量評(píng)定

(1)影響樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取的維生素B6濃度(C)測(cè)定的不確定度分量包括：標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度、微量移液器自身容差引入的不確定度、樣品培養(yǎng)液吸光度值的不確定度、樣品測(cè)定重復(fù)性的不確定度。

(2)影響樣品稱量結(jié)果(m)不確定度的分量為天平自身精密度。

(3)影響樣品稀釋(n)定容的不確定度分量包括：移液器及容量瓶自身容差引入的不確定度、試驗(yàn)環(huán)境溫度變化引入的不確定度。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品維生素B6含量測(cè)定引入的不確定度

2.1.2 微量移液器的不確定度 根據(jù)JJG 646-2006規(guī)定，20℃時(shí)20～200 μL量程的測(cè)量范圍內(nèi)最大允許差為±3.0 μL，取均勻分布，則由此帶來的不確定度為：

該移液器在本試驗(yàn)中的加樣體積為150 μL，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.3 樣品培養(yǎng)液吸光度值的不確定度 樣品培養(yǎng)液吸光度值的不確定度由重復(fù)測(cè)定所得吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)差決定，將最終樣品溶液平行培養(yǎng)12管，測(cè)定每管培養(yǎng)液的吸光度值，結(jié)果如表1所示。

表1 樣品培養(yǎng)液吸光度值重復(fù)測(cè)定結(jié)果

根據(jù)貝塞爾公式計(jì)算由隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.1.4 測(cè)定重復(fù)性的不確定度 在重復(fù)性條件下，對(duì)該樣品進(jìn)行12次獨(dú)立測(cè)量(n=12)，結(jié)果如表2。

表2 低聚糖重復(fù)測(cè)定結(jié)果

根據(jù)貝塞爾公式計(jì)算由隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式為：

樣品維生素B6濃度測(cè)定引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

稱取樣品使用的電子天平精密度為0.001 g，根據(jù)天平檢定證書，其最大允許誤差為±0.001 g。本試驗(yàn)中使用減法稱取樣品2.500 g，共稱重2 次，即空盤質(zhì)量和總質(zhì)量，天平線性按矩形分布計(jì)算，樣品稱重的不確定度：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.3 樣品稀釋定容引入的不確定度

2.3.2 溫度變化引起的不確定度 假設(shè)溫差為±15℃，則由此導(dǎo)致的體積V的分散區(qū)間半寬度為：△V=100×2.1×10-4×15=0.32 mL，按均勻分布，則由溫度變化引入的不確定度為：

由100 mL容量瓶引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

樣品稀釋定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4 維生素B6測(cè)定的不確定度分量

表3 維生素B6含量測(cè)定的不確定度分量

2.5 擴(kuò)展不確定度及測(cè)定結(jié)果

U(x)=kUrel(x)X=2×0.01393×5.932=0.1653

米粉中維生素B6含量為：

X=(5.932±0.1653)μg/hg (k=2)

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用微生物法測(cè)定米粉樣品中維生素B6的含量，結(jié)果為(5.932±0.1653) μg/hg，k=2。由于本試驗(yàn)采用商品化的試劑盒，在接種菌種數(shù)量、菌種活力等方面無法測(cè)定其不確定度，所以在標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取的維生素B6濃度(C)、樣品稱量結(jié)果(m)、樣品稀釋(n)定容等幾個(gè)方面進(jìn)行不確定度評(píng)定，結(jié)果表明：不確定度的主要來源樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取的維生素B6濃度測(cè)定，其中最主要來自微量移液器容差的不確定度。所以在試驗(yàn)過程中應(yīng)注意盡量減小微量液體轉(zhuǎn)移的偏差，注意對(duì)微量移液器進(jìn)行定期維護(hù)和校準(zhǔn)。

[1]張艷,王甲威,趙相霞.微生物法測(cè)定維生素的質(zhì)量控制[J].中國(guó)乳品工業(yè),2014,42(8):54-57.

[2]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.JJF1059-1999 測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[S].北京：中國(guó)計(jì)量出版社，1999.

[3]李慎安.化學(xué)試驗(yàn)室測(cè)量不確定度[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

[4]國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局計(jì)量司組.測(cè)量不確定度評(píng)定與表示指南[M].北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2000.

[5]郝曉莉,趙瑛博,陳芳芳.分光光度法測(cè)定白菜中亞硝酸鹽的不確定度評(píng)定[J].食品科學(xué),2013,34(6):208-210.

[6]牛華,牛之瑞,馮雷.高效液相色譜法測(cè)定辣椒粉中羅丹明B的測(cè)量不確定度評(píng)估[J].食品科學(xué),2014,35(8):165-168.

[7]王吉祥,張學(xué)忠,王亞.氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中聯(lián)苯菊酯的不確定度評(píng)定[J].食品科學(xué),2014,35(12):200-203.

[8]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.JJF1059.1 2012 測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[S].北京:中國(guó)計(jì)量出版社,2012.

(責(zé)任編輯：劉新永)

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Uncertainty evaluation in determination of vitamin B6 in rice flour by microbiological method

XIONG Juan1， CAI Da-chuan1*， ZHANG Yan-zhong2， CHEN Min-er1， HUANG Xuan-ying1

(1.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofEmergencyTestforDangerousChemicals,ChinaNationalAnalyticalCenter510070； 2.InstituteofChaoshanKungfuTeainShantou)

In this paper, the content of vitamin B6 in rice flour samples was determined by microbiological method, and the uncertainty of measurement was analyzed from several aspects. The results showed that, the relative synthetic standard uncertainty was 0.01393, the expanded uncertainty was 0.1653, and the result was ( 5.932 0.1653 ) μg/100 g. The main uncertainty component affecting the determination results of vitamin B6 is the capacity difference within micro pipette tips.

Microbial method; vitamin B6; uncertainty; assessment

2017-04-10

熊娟，女，1985年生，助理研究員。

*通訊作者：蔡大川，男，1973年生，高級(jí)工程師 (E-mail：cai-dachuan@21cn.com)。

10.13651/j.cnki.fjnykj.2017.04.007