瓦松總黃酮的提取及其抑菌效果

孫森鳳，張穎穎

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250355； 2山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250355)

瓦松總黃酮的提取及其抑菌效果

孫森鳳1，張穎穎2

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250355；2山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250355)

目的：提取瓦松總黃酮并對(duì)其總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)一步觀察總黃酮的抑菌效果。方法：采用超聲法提取瓦松總黃酮，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，用紫外分光光度法測(cè)總黃酮的含量；并參照NCCLS規(guī)范，用微量稀釋法來測(cè)定總黃酮最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。結(jié)果：測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)性良好，R2=0.999 2，線性范圍在0.02～0.6 mg/mL。瓦松總黃酮對(duì)福氏志賀菌標(biāo)準(zhǔn)株抑菌效果最好，對(duì)部分臨床分離金黃色葡萄球菌耐甲氧西林株(MRSA)、表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株、大腸埃希菌及其臨床分離株、肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株及其臨床分離株抑菌效果較好，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最弱。瓦松水提物抑菌趨勢(shì)與總黃酮一致性較差，總黃酮及水提物均無明顯的MBC。結(jié)論：瓦松總黃酮及其水提物對(duì)本試驗(yàn)選取的菌株均有一定的抑制作用，且抑制作用較好。黃酮好于水提物，作用機(jī)制以抑制為主，而非直接殺菌。瓦松總黃酮具有較好的抑菌效果，在食品開發(fā)上有較高研究?jī)r(jià)值。

瓦松總黃酮；抑菌活性；MIC；MBC

瓦松為景天科植物瓦松或晚紅瓦松的全草，《新修本草》描述，瓦松氣微、味酸，具有清熱解毒、止血收斂、利濕消腫以及養(yǎng)心安神等功效，用于吐血、鼻衄、血痢、瘧疾、痔瘡、濕疹、癰毒和疔瘡等癥的治療[1]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[2]，瓦松有一定的食用價(jià)值，食用口感較好，可作為醬菜的生產(chǎn)原料，并可提取葉蛋白，在食品生產(chǎn)中有深入開發(fā)價(jià)值。在藥理作用價(jià)值方面，現(xiàn)代臨床研究發(fā)現(xiàn)瓦松具有抗腫瘤、抗癌、強(qiáng)心、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等方面均有較好的作用。Yoon Y等人[3]研究表明，日本瓦松粗提物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌共10個(gè)菌種216株菌均有一定的抑制效果，具有明顯的廣譜抗菌效應(yīng)[3]。

瓦松的主要藥效成分包括多糖、黃酮等物質(zhì)，課題組前期已經(jīng)對(duì)瓦松多糖的抑菌效果做了初步研究，發(fā)現(xiàn)瓦松多糖具有一定的抑菌活性，且其抑菌活性高于水提物。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)瓦松黃酮抑菌的研究較少，為進(jìn)一步研究瓦松抑菌的主要成分，深入揭示瓦松抑菌機(jī)制，課題組提取了瓦松總黃酮，對(duì)其抑菌活性開展初步研究。本實(shí)驗(yàn)中選用了部分常見可致食品污染細(xì)菌，包括金黃色葡萄球菌ATCC25923標(biāo)準(zhǔn)株及臨床分離MRSA(金黃色葡萄球菌耐甲氧西林株)、大腸埃希菌ATCC25922標(biāo)準(zhǔn)株及部分臨床分離株、變形桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC49027、表皮葡萄球菌ATCC12228標(biāo)準(zhǔn)株及其它部分臨床分離菌株、肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC13883及臨床菌株等共計(jì)16株細(xì)菌，以不同濃度的瓦松黃酮和水提取物進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，研究瓦松的抑菌效果，以期深入揭示瓦松抑菌機(jī)制，擴(kuò)展瓦松在食品研發(fā)中的應(yīng)用提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 瓦松，粉碎后過40目篩，于密封袋中低溫保存，備用；石油醚(批號(hào)：2014070，天津市精細(xì)化有限公司)；無水乙醇(批號(hào)201602253，天津市精細(xì)化有限公司)；營(yíng)養(yǎng)瓊脂(批號(hào)：20160508，北京奧博星)；MH肉湯(批號(hào)：20140708，北京奧博星)。

1.1.2 儀器 UV9100B型紫外可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52A上海亞榮生化儀器廠，上海)、KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、離心機(jī)(TD5A-W湖南湘儀，湖南湘潭)、SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、FA1004N 電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、SK-1快速混勻漩渦器(中國(guó)深圳)、遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱(上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、梅特勒-托利多分析天平(上海先悅機(jī)電有限公司)、單通道及12道微量移液器(Dragon)、DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒)、96孔培養(yǎng)板(新星實(shí)驗(yàn)器材公司，江蘇南通)、普朗DNM-9602酶標(biāo)儀(北京普朗公司)、一次性無菌培養(yǎng)皿(直徑90 mm，新星實(shí)驗(yàn)器材公司，江蘇南通)、蘇凈安泰BSC-1300IIA生物潔凈安全柜(蘇凈集團(tuán)，江蘇蘇州)和麥?zhǔn)媳葷峁?自制)。

1.1.3 菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌ATCC25923大腸埃希菌ATCC25922表皮葡萄球菌ATCC12228福氏志賀菌ATCC12022、變形桿菌ATCC49027；臨床分離菌株：大腸埃希菌3株、MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)5株，總計(jì)12株。上述標(biāo)準(zhǔn)菌株及臨床分離菌株均由山東中醫(yī)藥大學(xué)微生物教研室提供，各菌株以營(yíng)養(yǎng)瓊脂進(jìn)行接種，37 ℃24 h培養(yǎng)后挑取菌苔以生理鹽水配成1×106cfu/mL的對(duì)應(yīng)菌液備用。

1.1.4 試劑及其配制

(1)試劑：標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁(10080-200707 中國(guó)藥品生物制品檢定所)、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉均為分析純。

(2)試劑的配制：70%乙醇溶液；準(zhǔn)確量取70 mL無水乙醇，加雙蒸水30 mL，混勻；5%亞硝酸鈉溶液；精確稱取2.500 g亞硝酸鈉溶于雙蒸水中，在50 mL容量瓶中定容；10%硝酸鋁溶液；精確稱取5.000 g硝酸鋁溶于雙蒸水中，在50 mL容量瓶中定容；4%氫氧化鈉溶液；精確稱取10.000 g氫氧化鈉溶于雙蒸水中，在250 mL容量瓶中定容。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 用電子天平精密稱取120 ℃恒溫干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于50 mL容量瓶中，用50%乙醇溶解后定容至刻度，搖勻，即為濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 瓦松總黃酮提取及水提物制備

(1)瓦松總黃酮提?。簠⒄障嚓P(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行瓦松總黃酮的提取[4]。精確稱取瓦松30g，加入600mL 70%濃度的乙醇溶液，先超聲波震蕩處理40min，固液比1∶20，超聲頻率47.6Hz，提取溫度40℃。之后于100℃的溫度下回流2.5h。將總黃酮粗提液抽濾，棄去殘?jiān)?，收集濾液。然后將濾液于4℃下8 000r/min離心20min，收集上清液入燒杯中。將所得樣品溶液于旋蒸儀上旋蒸至近干，用盡量少的甲醇將其中樣品洗至蒸發(fā)皿中，減壓濃縮，水浴蒸干，得樣品浸膏77.5mg/g，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求配成所需濃度。

(2)瓦松水提物：稱取瓦松50 g，加入1 000 mL的蒸餾水，文火煎1h，除去藥渣，濃縮水提液至50 mL，即得瓦松水煎液。最終濃度相當(dāng)于原藥1 g/mL。將濃縮液稀釋至0.2 g/mL，以0.22 μm一次性無菌濾器過濾備用。

1.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 取標(biāo)準(zhǔn)溶液各2.0 mL置于10 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻，放置5min，再加10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻，放置5min，然后加氫氧化鈉試液4 mL，最后加50%乙醇定容，搖勻，放置15 min。以加0.00 mL標(biāo)準(zhǔn)品為空白對(duì)照，進(jìn)行分光掃描。結(jié)果表明，蘆丁在510 nm處有最大吸收峰。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別量取標(biāo)準(zhǔn)液0、1.0、1.5、2、2.5、3于10 mL容量瓶，加5%的亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻后靜置5 min；然后加10%的硝酸鋁0.5 mL，搖勻后靜置5 min，最后加入4%的氫氧化鈉溶液4 mL，并用50 %乙醇稀釋至刻度。然后在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，以蘆丁濃度(Y)對(duì)吸光度(X)進(jìn)行回歸分析，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：Y=10X+0.018，R2=0.999 2。結(jié)果表明，蘆丁(黃酮類化合物)濃度與對(duì)應(yīng)的吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，符合Lambert-Beer定律。

1.2.5 培養(yǎng)基制備 營(yíng)養(yǎng)瓊脂,購(gòu)自北京奧博星生物公司，按說明書配制后121 ℃高壓滅菌20 min，分裝于無菌培養(yǎng)皿制成平板，4 ℃保存?zhèn)溆?。MH(B)肉湯購(gòu)自北京奧博星生物公司，按說明書配制分裝后于121 ℃高壓滅菌20 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 細(xì)菌培養(yǎng) 制備營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，分別取上述各菌密集劃線接種于培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)24 h，以生理鹽水洗脫菌苔制備菌液。

1.2.7 MIC測(cè)定 實(shí)驗(yàn)菌液的制備：采用比濁法，將菌液濃度調(diào)整為1×106CFU/mL。抑菌實(shí)驗(yàn)步驟參照NCCLS標(biāo)準(zhǔn)，采用微量稀釋法進(jìn)行[5]。在96孔板中每孔加入培養(yǎng)基100 μL，然后在第1行中加入100μL藥液，從第1行中吸取100 μL混合液加入第2行，依次類推至第6行，得到2、4、8、16、32、64倍稀釋藥物梯度。第7行每孔加入慶大霉素注射液10 μL為陽(yáng)性對(duì)照，第8行直接加入菌液做為陰性對(duì)照。以上藥液和對(duì)照加樣完畢后，每孔加入1×106CFU/mL的對(duì)應(yīng)菌液10 μL，每個(gè)藥物做3次平行試驗(yàn)，37 ℃培養(yǎng)24 h，以酶標(biāo)儀對(duì)培養(yǎng)板在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定 OD值，結(jié)合細(xì)菌生長(zhǎng)情況判斷結(jié)果。

1.2.8 MBC測(cè)定 從2.8中判定為MIC的孔中，吸取培養(yǎng)物取10μL，以涂布棒無菌操作均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，以37 ℃培養(yǎng)24 h后無明顯生長(zhǎng)現(xiàn)象的濃度作為最低殺菌濃度(MBC)[6]。

2 結(jié)果與分析

由表1可見，瓦松總黃酮對(duì)各菌均有較好抑制效果。對(duì)福氏志賀菌標(biāo)準(zhǔn)株的抑菌效果最好，MIC為0.625 mg/mL；對(duì)部分臨床分離MRSA、表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株、大腸埃希菌及其臨床分離株、肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株及其臨床分離株的抑菌效果次之，MIC是1.25 mg/mL；對(duì)金黃色葡萄球菌、變形桿菌及部分MRSA的抑菌效果較弱，MIC為2.5 mg/mL。瓦松水提物抑菌趨勢(shì)與黃酮一致性較差，對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株、表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株及1株MRSA的MIC相同，均為12.5 mg/mL，對(duì)福氏志賀菌標(biāo)準(zhǔn)株和3株MRSA的MIC為50 mg/mL，對(duì)其余菌株的MIC均為100 mg/mL。從MIC結(jié)果看，瓦松總黃酮的抑菌活性要顯著高于瓦松水提物。

表1 瓦松總黃酮及水提物MIC結(jié)果

表2 瓦松總黃酮及水提物對(duì)各菌株的MBC結(jié)果

注：“-”表示無明顯MBC。

由表2可見，瓦松總黃酮及水提物對(duì)各菌株均無明顯的MBC，說明其作用機(jī)制主要為抑菌而非殺菌。

3 討論

瓦松具有較高食用和藥用價(jià)值。食用方面，瓦松新鮮植株肉質(zhì)多汁，適口性較好，除可供人類食用外，在畜牧業(yè)上也有一定應(yīng)用價(jià)值[7]；藥用方面，瓦松是民間應(yīng)用較早的中藥之一，具有多種藥理活性[8]。文獻(xiàn)報(bào)道，瓦松可用于吐血、鼻衄、血痢、瘧疾、痔瘡、濕疹、癰毒、疔瘡以及肛周膿腫等癥的治療[1]。研究表明，瓦松對(duì)金黃色葡萄球菌等革蘭陽(yáng)性菌的抑菌效果較好；對(duì)大腸桿菌、變形桿菌等革蘭氏陰性抑菌效果次之[9]。研究顯示，瓦松的主要成分有黃酮類、有機(jī)酸類、甾醇類和強(qiáng)心苷等[10]，其中黃酮類化合物是其重要藥效成分。黃酮類化合物廣泛存在于多種中藥中，有抗微生物、抗氧化、降血糖和抗腫瘤等多種藥理作用，特別是在抗微生物方面，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、陰性菌及部分真菌均有一定的抑菌效果[11]。目前，國(guó)外對(duì)瓦松屬黃酮的研究主要集中于OrostachysjaponicusA. Berger上，以高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)其黃酮成分進(jìn)行了初步分析[12]，發(fā)現(xiàn)其黃酮具有一定的抗氧化作用[13]；在抗腫瘤方面，其黃酮可通過抑制Bcl-2和X-IAP來對(duì)MMP進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而誘導(dǎo)人淋巴細(xì)胞發(fā)生caspase依賴的細(xì)胞凋亡以抑制腫瘤[14]；還可通過滅活A(yù)kt及調(diào)節(jié)緊密連接來抑制前列腺癌LNCaP細(xì)胞的侵襲[15]；在其總黃酮中發(fā)現(xiàn)了7種具有較好鈣蛋白酶抑制活性的成分[16]，提示其有一定的抗?jié)冏饔茫淮送?，該植物甲醇提取物?duì)過氧化氫誘導(dǎo)所致 GT1-1小鼠下丘腦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡具有一定保護(hù)作用[17]。國(guó)內(nèi)方面，王亞紅等[18-20]對(duì)瓦松屬總黃酮的提取及純化方法做了初步研究；張桂芳等[21]發(fā)現(xiàn)瓦松黃酮粗提物對(duì)糖尿病大鼠的高脂血癥和臟器損傷有明顯的治療和修復(fù)作用；王翔飛等[22]以黃花瓦松乙醇提取物和石油醚提取物作用于金黃色葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)有一定抑菌效果。綜合上述國(guó)內(nèi)外研究，瓦松是一種既有食用價(jià)值又有藥用價(jià)值的植物資源，可作為開發(fā)藥食同源相關(guān)產(chǎn)品的重要原材料。為了深入研究瓦松的藥用及食用價(jià)值，在前期研究的基礎(chǔ)上，我們對(duì)瓦松總黃酮進(jìn)行了初步提取，并對(duì)抑菌活性進(jìn)行了檢測(cè)。研究中選擇了臨床上常見引起感染的部分細(xì)菌，包括標(biāo)準(zhǔn)株及其部分臨床分離株，對(duì)瓦松總黃酮的抑菌作用進(jìn)行了初步研究。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，瓦松總黃酮的抑菌效果要顯著地好于水提物。

金黃色葡萄球菌是目前臨床常見的致病菌之一，該菌容易產(chǎn)生耐藥性，可引起皮膚軟組織感染、敗血癥及導(dǎo)管相關(guān)性感染及食物中毒等多種疾病，是目前危及臨床患者生命的重要致病菌[23]，是食品的主要污染菌之一，近年來其典型耐藥株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)所致感染發(fā)生率呈現(xiàn)逐漸增高趨勢(shì)[24]；福氏志賀菌可致細(xì)菌性痢疾，在我國(guó)，福氏志賀菌導(dǎo)致的病例數(shù)占細(xì)菌性痢疾的80%以上[25]，在夏秋季容易通過消化道傳播，亦屬消化道感染細(xì)菌之一；變形桿菌多為機(jī)會(huì)致病菌，但亦可能導(dǎo)致腸道感染以及泌尿系統(tǒng)感染，甚至導(dǎo)致腹瀉等臨床反應(yīng)[26]。大腸埃希菌是臨床上機(jī)會(huì)性感染的主要病原菌之一，能夠引起泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及消化系統(tǒng)等感染[27]，其中某些致病菌株可以污染食物，導(dǎo)致出血性結(jié)腸炎甚至尿毒癥，嚴(yán)重危害食品安全；表皮葡萄球菌是凝固酶陰性葡萄球菌，一般不會(huì)導(dǎo)致疾病，但近年所致醫(yī)源性感染不斷增多[28]；肺炎克雷伯菌是醫(yī)院感染最常見的腸桿菌科細(xì)菌之一，主要有肺炎、尿路、膽道、傷口、導(dǎo)管及血流等的感染[29]，該菌易產(chǎn)生耐藥性變異，故在臨床工作中應(yīng)合理選擇抗生素。上述各菌皆為臨床常見感染菌，多數(shù)均可污染食物造成感染。本研究結(jié)果顯示，瓦松黃酮對(duì)各菌均有一定抑制作用，故其結(jié)果對(duì)食品研究更具指導(dǎo)價(jià)值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，瓦松總黃酮對(duì)其他各標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株均有較好的抑制作用。對(duì)福氏志賀菌標(biāo)準(zhǔn)株有最佳抑菌效果，其MIC為0.625 mg/mL；對(duì)2株臨床分離MRSA、表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株、大腸埃希菌及其臨床分離株、肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株及其臨床分離株的抑菌效果次之，MIC是1.25 mg/mL；對(duì)金黃色葡萄球菌、變形桿菌及2株臨床分離MRSA的抑菌效果最差，MIC為2.5 mg/mL。瓦松水提物抑菌對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株、表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株及1株MRSA的MIC相同，均為12.5 mg/mL；對(duì)福氏志賀菌標(biāo)準(zhǔn)株和另外3株MRSA的MIC為50 mg/mL；對(duì)其余菌株的MIC均為100 mg/mL。MIC結(jié)果顯示，瓦松總黃酮有較強(qiáng)的抑菌活性，顯著好于瓦松水提取物。另從MIC的趨勢(shì)來看，無論是多糖還是水提物，對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株和表皮葡萄球菌均有較強(qiáng)抑制效果，對(duì)其余菌株則有較大差異；所有檢測(cè)的菌株均無明顯MBC，提示瓦松水提物和瓦松總黃酮對(duì)上述細(xì)菌僅有抑制作用，無明顯的殺滅作用。

MIC結(jié)果顯示，瓦松總黃酮對(duì)臨床分離的部分MRSA、大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌都有較好抑制作用，且顯著好于水提物，也好于課題組前期研究過的瓦松多糖(孫森鳳，范華忠，付葉佩，等.瓦松多糖對(duì)部分臨床感染菌的抑菌活性研究，《食品與藥品》雜志已接收)，證明瓦松總黃酮可能是瓦松最主要的抑菌成分。后繼研究中將對(duì)瓦松總黃酮進(jìn)行深入分析，并對(duì)其抗炎、鎮(zhèn)痛等活性開展深入研究，進(jìn)一步明確瓦松的活性物質(zhì)，為拓展瓦松在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用提供更多依據(jù)?！?/p>

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

Extraction and Antibacterial Effect of Total Flavonoids inOrostachyssp.

SUN Sen-feng1，ZHANG Ying-ying2

(1College of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China；2College of Traditional Chinese Medicine，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China)

Orostachyssp.total flavonoids；bacteriostatic activity；MIC；MBC

山東省高校中醫(yī)藥抗病毒協(xié)同創(chuàng)新中心課題“中醫(yī)藥抗病毒免疫技術(shù)體系構(gòu)建”(項(xiàng)目編號(hào)：XTCX2014B01-04)。

孫森鳳(1995— )，女，本科生，研究方向：從事中藥提取純化及藥理。

張穎穎(1977— )，男，碩士，講師，研究方向：中醫(yī)藥抗病原生物。