玄柏爽聲顆粒HPLC指紋圖譜研究

張琇雯 胡 霜 陳念祖 馬 勤 王東蕾 賴永華 黃滔敏△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院藥劑科 上海 200031; 2復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室 上海 201203)

玄柏爽聲顆粒HPLC指紋圖譜研究

張琇雯1胡 霜2陳念祖1馬 勤1王東蕾1賴永華1黃滔敏1△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院藥劑科 上海 200031;2復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室 上海 201203)

目的 建立玄柏爽聲顆粒HPLC指紋圖譜,為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法 采用Agilent TC C18(150 mm×4.6 mm,5 μm) 色譜柱,流動(dòng)相為甲醇-0.2%乙酸水,0～60 min內(nèi)進(jìn)行梯度洗脫;柱溫25 ℃,流速1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm。分別對(duì)11批樣品進(jìn)行測(cè)定,采用“中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)軟件(2004A版)”建立玄柏爽聲顆粒HPLC指紋圖譜,并對(duì)共有峰進(jìn)行藥材歸屬和指認(rèn)。結(jié)果 建立了玄柏爽聲顆粒HPLC指紋圖譜,確定了27個(gè)共有峰,11批樣品的相似度均在0.9以上。各共有峰均能在對(duì)應(yīng)藥材中得到歸屬。用對(duì)照品指認(rèn)了制劑中5個(gè)色譜峰,分別為黃柏堿(11號(hào)峰)、甘草苷(22號(hào)峰)、安格洛苷C(25號(hào)峰)、肉桂酸(26號(hào)峰)、哈巴俄苷(27號(hào)峰)。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性好,可作為玄柏爽聲顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

玄柏爽聲顆粒; HPLC; 指紋圖譜; 質(zhì)量控制

玄柏爽聲顆粒是由復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院在20世紀(jì)60年代末70年代初形成的經(jīng)驗(yàn)方,因療效顯著而沿用至今,是國(guó)內(nèi)知名的十余種醫(yī)院內(nèi)部制劑之一。玄柏爽聲顆粒方由玄參、黃柏、山豆根、紫苑、蟬蛻、桔梗、甘草組成,其中,玄參為君藥,山豆根為臣藥,蜜紫菀為佐藥,具有清熱滋陰、開(kāi)音利咽的作用,用于喉炎、聲帶紅腫、咽喉干燥。目前,玄柏爽聲顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用薄層鑒別的方法,該方法尚未建立反映整體信息的指紋圖譜或有效成分含量測(cè)定項(xiàng)目,因此有必要進(jìn)一步建立專屬性更強(qiáng)的質(zhì)控項(xiàng)目以控制藥品的質(zhì)量。

中藥指紋圖譜具有信息量大、特征性強(qiáng)和整體性等特點(diǎn),能表征藥物的整體信息,是符合中藥特色的評(píng)價(jià)方法,目前在中藥質(zhì)量控制方面得到了廣泛認(rèn)可[1-2]。其中HPLC指紋圖譜分析方法由于具有分離效能高、操作簡(jiǎn)單、分析迅速、重現(xiàn)性好等特點(diǎn),是目前應(yīng)用最廣泛的指紋圖譜技術(shù)[3-5]。本文采用HPLC對(duì)玄柏爽聲顆粒樣品進(jìn)行較為全面的指紋圖譜研究,采用“中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)軟件(2004A版)”進(jìn)行分析,為該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

材 料 和 方 法

儀器 Agilent1100型高效液相色譜儀(美國(guó)惠普公司)包括G1322A Degasser在線脫氣、G1311A QuartPump四元泵、G1316A Column柱溫箱、G1314A VWD 紫外檢測(cè)器、惠普色譜工作站及20 μL手動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng);Auto ScienceAP-01P型純凈水發(fā)生器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);B5500s-MTH 超聲波清洗器(上海Branson超聲波儀器廠);電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司,Sartorius,d=0.1 mg)。

試劑和藥品 黃柏堿對(duì)照品(批號(hào):140318,上?？禈?biāo)化學(xué)品有限公司);甘草苷對(duì)照品(批號(hào):111610-200604,中國(guó)藥品生物制品檢定所);安格洛苷C對(duì)照品(批號(hào):151205,上?？禈?biāo)化學(xué)品有限公司);哈巴俄苷對(duì)照品(批號(hào):111730-200604,中國(guó)藥品生物制品檢定所);肉桂酸對(duì)照品(批號(hào):110786-200503,中國(guó)藥品生物制品檢定所)。甲醇(HPLC純,美國(guó)Tedia公司);乙酸(批號(hào):20121009,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);玄柏爽聲顆粒(SYZ-ZF-061-2005,復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院委托上海練塘藥業(yè)有限公司加工,批號(hào):20160401、20160402、20160501、20160502、20160601、20160602、20160603、20160604、20160605、20160606、20160607,8 g/袋)。玄參(批號(hào):1008-200003)、山豆根(批號(hào):120976-200503)、紫菀(批號(hào):120956-200505)、蟬蛻(由上海練塘藥業(yè)有限公司鑒定及提供,符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn))、桔梗(批號(hào):121028-200608)、黃柏(批號(hào):121510-201105)及甘草(批號(hào):120904-201318)對(duì)照藥材均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

色譜條件 Agilent TC C18(150 mm×4.6 mm,5 μm) 色譜柱;流動(dòng)相為甲醇-0.2%乙酸水,梯度洗脫:0～10 min用2%～10%甲醇;10～40 min用10%～60%甲醇;40～60 min用60%～90%甲醇;柱溫25 ℃,流速1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm,進(jìn)樣量20 μL。

對(duì)照品溶液配制 精密稱取哈巴俄苷、肉桂酸、甘草苷、黃柏堿和安格洛苷C各10 mg,分別置于10 mL容量瓶中。用75%甲醇水溶解,定容至刻度,制成對(duì)照品溶液。

供試品溶液配制 精密稱取玄柏爽聲顆粒1.0 g,置于25 mL的容量瓶中,加入蒸餾水至刻度,超聲提取60 min,取適量提取液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò),即得玄柏爽聲顆粒供試品溶液。

藥材供試品的制備 按玄柏爽聲顆粒制劑的處方比例,精密稱取玄參、山豆根、紫苑、蟬蛻、桔梗、黃柏及甘草對(duì)照藥材,研細(xì),按供試品溶液配制項(xiàng)下方法進(jìn)行處理,得各藥材供試品溶液。

結(jié) 果

提取方法的選擇 我們考察了玄柏爽聲顆粒在水及30%、50%、75%、100%乙醇中的提取效果,結(jié)果表明隨著乙醇濃度的增加,提取出的色譜峰個(gè)數(shù)逐漸減少;在100%乙醇溶劑中僅提取出2個(gè)色譜峰。部分峰在水溶劑中提取效率不是最高,如哈巴俄苷、安格洛苷C、肉桂酸等,在0～75%乙醇溶液中,這部分峰的提取效率隨著乙醇濃度的增加而增加,而在100%乙醇中,其提取效率又顯著降低,甚至不能提取。因此,綜合考慮指紋圖譜反映樣品的整體性情況,再結(jié)合顆粒劑的制作過(guò)程(該制劑是由各藥材水提成分濃縮噴霧干燥而成,溶化性檢查要求可溶顆粒全部溶化,有輕微渾濁),我們選擇提取色譜峰個(gè)數(shù)最多的水作為提取溶劑。

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 玄柏爽聲顆粒方中玄參為主藥,具有涼血滋陰、瀉火解毒的功效,化學(xué)成分主要有哈巴俄苷、巴苷元、玄參苷甲、乙等環(huán)烯醚萜類和安格洛苷C、肉蓯蓉苷D等苯丙素苷類[6-7]。其中,哈巴俄苷、安格洛苷C、肉桂酸是玄參中主要活性成分[8],哈巴俄苷具有抗炎、降壓、抗乙肝病毒等作用[9],安格洛苷C具有抑制血小板聚集、保肝等作用[9],而肉桂酸能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化[10]。主藥各有效成分在278 nm均有適宜的靈敏度。處方中臣藥山豆根的主要活性成分為苦參堿、氧化苦參堿等生物堿及高麗槐素等黃酮類[11-12],它們均在短波長(zhǎng)處有吸收,在210 nm處對(duì)制劑進(jìn)行進(jìn)樣分析,發(fā)現(xiàn)色譜基線飄移嚴(yán)重,且尚有部分信息未顯示。同時(shí)我們考查了254 nm下樣品的色譜情況,發(fā)現(xiàn)與278 nm相比,254 nm波長(zhǎng)下測(cè)到的共有峰數(shù)目及主要活性成分的吸收峰面積均有所減少。再綜合考慮指紋圖譜君臣佐使的原則,選擇278 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng),在該條件下色譜峰基線穩(wěn)定,各吸收峰吸收強(qiáng),受干擾小。

流動(dòng)相的選擇 在乙腈-0.2%乙酸水溶液體系下,哈巴俄苷峰分裂,甘草苷拖尾;在甲醇-0.2%三乙胺色譜系統(tǒng)中,主要活性成分出峰時(shí)間較晚;在甲醇-0.2%乙酸色譜系統(tǒng)中,各色譜峰能較好分離,峰形良好、且出峰較多;流動(dòng)相中加入10 mmol/L KH2PO4、0.5%三乙胺及磷酸調(diào)pH對(duì)峰形也無(wú)改善作用,故選擇甲醇-0.2%乙酸色譜系統(tǒng)作為流動(dòng)相。

色譜柱的選擇 在Agilent TC色譜柱中,色譜柱的分離度高,且色譜峰數(shù)多,故選其為本實(shí)驗(yàn)的分離柱。

精密度試驗(yàn) 取批號(hào)為20160602的玄柏爽聲顆粒樣品,按照“供試品溶液配制”項(xiàng)下方法制備,按色譜條件項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定,重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,考察儀器的精密度。結(jié)果表明,以26號(hào)峰肉桂酸作為參照峰,各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.8%,各色譜峰的相對(duì)峰面積的RSD均小于3%,表明儀器精密度良好,符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為20160602的玄柏爽聲顆粒樣品,按照“供試品溶液配制”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份,按色譜條件項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜圖,考察方法的重復(fù)性。結(jié)果表明,以26號(hào)峰肉桂酸作為參照峰,各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%,各色譜峰的相對(duì)峰面積的RSD均小于5%,表明該方法重復(fù)性良好,符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為20160602的玄柏爽聲顆粒樣品,按照“供試品溶液配制”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按色譜條件項(xiàng)下方法,分別于0、3、6、9、12、24 h進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜圖,考察供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明,以26號(hào)峰肉桂酸作為參照峰,各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%,各色譜峰的相對(duì)峰面積的RSD均小于5%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定,符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

指紋圖譜的建立及相似度計(jì)算 分別準(zhǔn)確吸取11批玄柏爽聲顆粒樣品的供試品溶液,采用上述色譜條件項(xiàng)下方法測(cè)定,記錄60 min的HPLC色譜圖。采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)軟件(2004A版)”分析,將11批玄柏爽聲顆粒圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入,時(shí)間窗口設(shè)為0.1,經(jīng)多點(diǎn)校正和數(shù)據(jù)匹配,以平均數(shù)法生成指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜(圖1)。相似度計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1,11批玄柏爽聲顆粒的相似度良好,均在0.9以上。

共有峰的標(biāo)定 選擇11批玄柏爽聲顆粒指紋圖譜中均存在的色譜峰作為共有峰,共確定共有峰27個(gè),依次編號(hào)為1～27。通過(guò)對(duì)照品對(duì)照,分別指認(rèn)5個(gè)色譜峰,其中11號(hào)峰為黃柏堿、22號(hào)峰為甘草苷、25號(hào)峰為安格洛苷C、26號(hào)峰為肉桂酸、27號(hào)峰為哈巴俄苷。選取12個(gè)主要的共有峰作為特征峰,以面積較大、分離度好且出峰穩(wěn)定的26號(hào)峰肉桂酸作為參照峰(S),統(tǒng)計(jì)了12個(gè)主要的共有色譜特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積(表2～3)。不同批次制劑的共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間差別較小,9號(hào)和11號(hào)共有特征峰的相對(duì)峰面積的RSD均大于20%,但由于這兩個(gè)峰占總峰面積的比例均小于10%,符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

圖1 11批玄柏爽聲顆粒HPLC指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜(R)

SampleS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11RS110.9810.9780.9560.9630.9460.9750.9730.9720.9640.9640.986S20.98110.970.960.9630.9420.9710.9650.9670.9630.9660.983S30.9780.9710.9430.9520.9330.9820.9820.9780.970.9640.984S40.9560.960.94310.9970.9870.960.9420.9570.9630.9480.98S50.9630.9630.9520.99710.9840.9660.9510.9630.9650.9510.984S60.9460.9420.9330.9870.98410.950.9330.9480.9510.9330.97S70.9750.9710.9820.960.9660.9510.9890.990.9840.9720.992S80.9730.9650.9820.9420.9510.9330.98910.9880.9780.9720.986S90.9720.9670.9780.9570.9630.9480.990.98810.9920.9830.992S100.9640.9630.970.9630.9650.9510.9840.9780.99210.9820.989S110.9640.9660.9640.9480.9510.9330.9720.9720.9830.98210.982R0.9860.9830.9840.980.9840.970.9920.9860.9920.9890.9821

11:Phellodendrine;22:Liquiritin;25:Angoroside C;26:Cinnamic acid;27:Harpagoside.

圖2 對(duì)照品(A)和玄柏爽聲顆粒(B)HPLC圖

表3 11批玄柏爽聲顆粒各共有特征峰的相對(duì)峰面積

玄柏爽聲顆粒與原藥材指紋圖譜相關(guān)性 在同一測(cè)定條件下,對(duì)玄柏爽聲顆粒和各原藥材的供試品溶液進(jìn)行色譜測(cè)定,通過(guò)對(duì)共有峰的保留時(shí)間、峰形等因素進(jìn)行考察,以確定玄柏爽聲顆粒與各原藥材指紋圖譜的相關(guān)性,找出各共有峰的來(lái)源。結(jié)果表明,玄柏爽聲顆粒的27個(gè)共有峰均可以在相應(yīng)的藥材中得到指認(rèn),其中,11號(hào)峰為黃柏堿來(lái)源于黃柏、22號(hào)峰為甘草苷來(lái)源于甘草、25號(hào)峰為安格洛苷C來(lái)源于玄參、26號(hào)峰為肉桂酸來(lái)源于玄參、27號(hào)峰為哈巴俄苷來(lái)源于玄參(圖3、表4)。

A:XuanboShuangshengGranule; b:Periostracum Cicada; c:Platycodon Grandiflorum; d:Liquorice; e:Radix Asteris; f:Cortex Phellodendri; g: SophoraTonkinensis; h: Radix Scrophulariae.

圖3 玄柏爽聲顆粒指紋圖譜中各共有峰歸屬色譜圖

討 論

本實(shí)驗(yàn)建立了玄柏爽聲顆粒的指紋圖譜,確定了27個(gè)共有峰,并指認(rèn)了其中5個(gè)色譜峰。對(duì)11批制劑進(jìn)行了相似度分析,相似度均在0.9以上,符合中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)的基本要求。通過(guò)原藥材指紋圖譜,我們對(duì)制劑中各共有峰進(jìn)行了歸屬,可分析出制劑中各色譜峰的藥材來(lái)源。該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定,可為該制劑的質(zhì)量控制提供一定的參考。

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HPLC fingerprint ofXuanboShuangshengGranule

ZHANG Xiu-wen1, HU Shuang2, CHEN Nian-zu1, MA Qin1,WANG Dong-lei1, LAI Yong-hua1, HUANG Tao-min1△

(1DepartmentofPharmacy,EyeandENTHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China;2DepartmentofPharmacology,SchoolofPharmacy,FudanUniversity,Shanghai201203,China)

Objective To establish the HPLC fingerprint ofXuanboShuangshengGranule for its quality control. Methods The components were separated on an Agilent TC-C18column (150 mm×4.6 mm,5 μm) at 25 ℃,with a gradient elution in 0-60 min at the flow rate of 1 mL/min using 0.2% acetic acid aqueous solution and methanol as the mobile phase.The detection wavelength was 278 nm.By detecting 11 batches ofXuanboShuangshengGranule,the HPLC fingerprint was established using “Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCMs (Version 2004A)”and the common peaks were analyzed and identified in raw herbal material. Results The HPLC fingerprint ofXuanboShuangshengGranule was obtained with similarity all over 0.9.Totally 27 common peaks were confirmed,and each common peak could be found in raw herbal medicines.Based on the reference substances,5 common peaks were identified,including phellodendrine (peak 11),liquiritin (peak 22),angoroside C (peak 25),cinnamic acid (peak 26) and harpagoside (peak 27). Conclusions This method is simple,accurate,repeatable and reliable,which could be applied in the quality control ofXuanboShuangshengGranule.

XuanboShuangshengGranule; HPLC; fingerprint; quality control

R917

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.04.023

2016-11-08;編輯:王蔚)

△Corresponding author E-mail:taominhuang@139.com