兩株副溶血弧菌烈性噬菌體的分離鑒定

宋增福徐華東彭孟凡孫博超趙 政張 也任建峰張慶華

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 2.上海海洋大學(xué)國家水生動物病原庫, 上海 201306; 3.上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室, 上海 201306)

兩株副溶血弧菌烈性噬菌體的分離鑒定

宋增福1,2徐華東1彭孟凡1孫博超1趙 政1張 也1任建峰1,3張慶華1,3

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 2.上海海洋大學(xué)國家水生動物病原庫, 上海 201306; 3.上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室, 上海 201306)

研究旨在篩選烈性噬菌體, 為副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)病害防控增加新的選擇。以副溶血弧菌Vp13為宿主菌, 通過二層瓊脂平板法篩選, 分離到了2株烈性噬菌體SX-2和SX-F。對其形態(tài)結(jié)構(gòu)進行了透射電鏡觀察, 利用DNase I、 RNase A、Mung Bean Nuclease和Hind Ш酶進行噬菌體核酸類型鑒定, 并對噬菌體的裂解譜、最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長曲線進行了測定。透射電鏡觀察結(jié)果顯示: SX-2核衣殼頭部長約110 nm, 寬約50 nm, 尾部長約150 nm, 寬約10 nm, 為典型的復(fù)合體制; SX-F核衣殼呈正六邊形, 長約為56.86 nm,寬約50.74 nm, 未觀察到尾部, 推測為正二十面體對稱; 核酸測定結(jié)果顯示兩者均為線性雙鏈DNA。依據(jù)國際病毒分類委員會第九次報告, SX-2符合肌尾噬菌體科特征, SX-F符合蓋噬菌體科特征。噬菌體SX-2和SX-F對85株弧菌裂解結(jié)果顯示: 噬菌體SX-2能夠裂解23株副溶血弧菌和1株溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),噬菌體SX-F能夠裂解19株副溶血弧菌和1株溶藻弧菌。SX-2和SX-F的最佳感染復(fù)數(shù)均為0.0001。一步生長曲線結(jié)果顯示: SX-F的潛伏期約10min, 裂解期約70min, 裂解量為116.2; 噬菌體SX-2的潛伏期小于10min, 裂解期大約70min, 裂解量為209.3。兩株噬菌體生物學(xué)特性表明SX-2與SX-F均為烈性噬菌體, 這為進一步探討噬菌體防治技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

副溶血弧菌; 烈性噬菌體; 形態(tài)結(jié)構(gòu); 生物學(xué)特性

副溶血弧菌是典型的人畜共患病病原菌之一。在我國, 副溶血弧菌是沿海地區(qū)引起微生物食物中毒的最重要的病原菌, 在美洲和亞洲其他地區(qū),也經(jīng)常有副溶血弧菌引起暴發(fā)性疾病的報道[1]。人食用了被副溶血弧菌污染的海產(chǎn)品會引起腹瀉、嘔吐、發(fā)燒等癥狀, 嚴(yán)重的會導(dǎo)致死亡[2—4]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè), 每年由副溶血弧菌引起的疾病同樣十分嚴(yán)重, 主要癥狀為發(fā)炎、敗血癥等并導(dǎo)致水產(chǎn)動物的大量死亡。抗生素因治療快、使用方便等優(yōu)點,是防治副溶血弧菌所致疾病的主要化學(xué)藥物[4,5]。但抗生素的長期濫用加劇了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生, 導(dǎo)致防治效果越來越差, 并且對環(huán)境的污染也非常嚴(yán)重。2015年我國對蝦產(chǎn)業(yè)遭遇重創(chuàng), 副溶血弧菌是最為重要的病原[6]。尋找新的抗生素替代產(chǎn)品成為了生物與醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點。微生物防治對環(huán)境沒有污染且不會破壞生態(tài)平衡, 越來越受到人們的關(guān)注[7], 噬菌體防治技術(shù)由于其獨特的優(yōu)勢又重新回到人們視野當(dāng)中。

自從1917年Felix d’Herelle通過治療實驗證實噬菌體具有治療細(xì)菌病的作用以來, 其已經(jīng)成為當(dāng)前國際上爭奪這一類生物資源的又一戰(zhàn)略高地[8—11]。噬菌體分為溫和噬菌體和烈性噬菌體2大類, 其中烈性噬菌體侵入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)通過裂解酶的作用分泌內(nèi)溶素破壞細(xì)胞壁并裂解細(xì)菌, 在裂解宿主菌的同時大量釋放子代噬菌體, 一個噬菌體顆粒通過4個感染周期就可以使數(shù)十億個細(xì)菌死亡。噬菌體具有宿主專一性, 一般只感染宿主菌而不裂解其他細(xì)菌, 不會破壞微生態(tài)平衡[7,12]。因此, 噬菌體療法因其安全性、耐藥性風(fēng)險低且無環(huán)境污染等優(yōu)點得到人們的重視[13,14]。全球范圍的細(xì)菌耐藥性蔓延的加劇也使得科學(xué)家們重新審視和評估噬菌體防治技術(shù)[15]。我國學(xué)者相繼分離出副溶血弧菌烈性噬菌體, 如江艷華等分離到VpJYP1[16]、丁云娟等分離到qdvp001[17]及彭勇等[18,19]分離到VPp1、VPp2和VPp3等, 這些研究工作的開展為對噬菌體的應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。

盡管噬菌體防治技術(shù)顯示出良好的應(yīng)用前景,但目前的應(yīng)用效果仍然不夠理想, 有待于進一步提高[17,20,21]。本研究擬通過以具有強致病力的副溶血弧菌Vp13為宿主菌, 篩選具有高效裂解能力的噬菌體, 為進一步探索副溶血弧菌的噬菌體防控技術(shù)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株副溶血弧菌(V.parahaemolyticus) Vp13由上海海洋大學(xué)食品學(xué)院趙勇教授惠贈(分離自患病南美白對蝦), Vp1、Vp2等83株副溶血弧菌均分離自患病南美白對蝦, 副溶血弧菌VpATCC17802由加州大學(xué)洛杉磯分校 (UCLA)王艷玲博士惠贈, 溶藻弧菌(V.alginolyticus)VaK由本室分離自患病南美白對蝦。

水樣采集用于分離副溶血弧菌噬菌體的水樣采集于上海市銅川路水產(chǎn)品批發(fā)市場下水道。2015年8月13日采集水樣編號為1—11, 10月3日水樣編號為12—23。

培養(yǎng)基與試劑胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(Tryptose soya broth, TSB, 北京路橋)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(Tryptose soya agar, TSA, 北京路橋)、緩沖蛋白胨水(北京路橋)、氯化鈉(NaCl, 國藥集團)、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium, TCBS, 北京路橋)、EZUP柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒(上海生工), PCR試劑: Master Mix 2×、D15000 marker(北京天根)、甘油, 瓊脂糖凝膠(上海生工)、Tris-HCl (0.5 mol/L pH 7.5上海生工)、20%聚乙二醇6000 (PEG 6000), SM緩沖液(Sodium chloride magnesium sulfate buffer): NaCl 5.8 g、MgSO4·7H2O 2 g、TrisHCl 1 mol/L (pH 7.5) 50 mL、2% gelatin 5 mL, 蒸餾水補足至1000 mL。

主要實驗儀器恒溫培養(yǎng)箱(MIR-262)、離心機(Eppendorf AG 5404)、電泳儀(DYY-6 C); PCR儀(Eppendorf AG 6325)、振蕩培養(yǎng)箱(INNOVA 40R)、凝膠成像系統(tǒng)(GEL DOC XR型, Bio-Rad)、高壓滅菌鍋(MLS-3780)、120KV生物型透射電鏡(Tecnai G2 spirit biotwin)。

1.2 方法

噬菌體分離篩選富集培養(yǎng): 將采集的水樣取20 mL加入50 mL離心管中, 加入1 mL處于生長對數(shù)期的副溶血弧菌Vp13, 混合均勻, 同時加入200 μL CaCl2和200 μL SM緩沖液以及20 mL 20% PEG溶液, 并用鹽度30‰的10×緩沖蛋白胨水加至50 mL過夜培養(yǎng)。

參考余茂効等[22]的二層平板法進行副溶血弧菌噬菌體富集篩選, 略作修改。

富集培養(yǎng)液8000 r/min離心20min, 取上清液用微孔濾膜(直徑=0.22 μm)過濾除菌2次; 做10–1—10–7稀釋, 分別取每個稀釋度樣液200 μL于滅菌的10 mL離心管中, 3個平行; 將培養(yǎng)了10h的副溶血弧菌懸液400 μL(對數(shù)期)與稀釋液混合, 同時加入100 μL CaCl2和100 μL SM緩沖液并混合均勻, 靜置10—15min, 進行二層平板法, 分別于6h、12h、18h和24h觀察噬菌斑出現(xiàn)情況。

噬菌體SX-2和SX-F的純化與濃縮參考余茂効等[22]的噬菌體純化方法, 略作修改。挑取單個噬菌斑至1 mL SM緩沖液中充分震蕩混勻, 靜置1—2h, 吸取100 μL進行10倍法稀釋至10–7, 進行二層平板法驗證分離得到的噬菌斑, 連續(xù)純化5次得到純噬菌體[20]。將純化的噬菌體用二層平板固體培養(yǎng)8h后, 倒入10 mL SM緩沖液, 用1 mL移液槍反復(fù)吹打上層瓊脂平板后, 常溫靜置10h, 使噬菌體充分釋放到液體中, 收集上清液即為濃縮液。

噬菌體SX-2和SX-F的電鏡觀察參考Ramírez-Orozco等[23]的方法, 采用磷鎢酸負(fù)染法進行透射電鏡直接觀察噬菌體。

噬菌體SX-2和SX-F增殖液制備挑取上層平板上的噬菌斑置10 mL的SM緩沖液中混勻, 先置4℃ 10h, 然后將其進行8000 r/min離心20min, 用10 mL一次性注射器吸取上清, 最后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌3次得到增殖液, 于37℃保存?zhèn)溆谩?/p>

噬菌體SX-2和SX-F效價的測定吸取100 μL純化的噬菌體液進行10倍稀釋, 將10–5、10–6及10–7的噬菌體液分別與400 μL的Vp13混合, 利用二層平板法觀察噬菌斑的個數(shù)。

噬菌體效價(pfu/mL)=噬菌斑數(shù)量×稀釋倍數(shù)/加入的噬菌體液體積

噬菌體SX-2和SX-F核酸類型鑒定參照Sambrook等[24]噬菌體核酸提取的方法, 略有改動[25,26]。將增殖的噬菌體液加入DNase Ι (50 μg/mL)和RNaseA (100 μg/mL), 搖床震蕩1h (37℃, 50r), 加入EDTA終止反應(yīng), 加入等體積的20% PEG冰浴2h,12000 r/min離心30min, 棄上清, 沉淀用200 μL SM緩沖液洗脫, 洗脫液用EZUP柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒提取噬菌體核酸。采用DNase I、RNase A、Mung Bean Nuclease及Hind Ш進行酶切實驗,瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果。

噬菌體SX-2和SX-F裂解譜的測定采用雙層平板法, 以噬菌體SX-2為例, 將濃度為3.8×1010pfu/mL的噬菌體液進行10倍稀釋, 每個濃度取200 μL的稀釋液與400 μL對數(shù)期的副溶血弧菌(A600=0.941)混合, 37℃恒溫放置10min, 再與10 mL半固體TSA培養(yǎng)基混勻并倒入事先制好的固體TSA瓊脂平板上制成雙層平板, 冷卻凝固后倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)。

噬菌體SX-2和SX-F最佳感染復(fù)數(shù)測定(MOI)本實驗按照感染復(fù)數(shù)為10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001和0.000001的比例, 分別取SX-2和SX-F噬菌體液100 μL與對數(shù)期的Vp13(1×107pfu/mL) 100 μL混合, 加入到10 mL TSB培養(yǎng)基中, 37℃搖床120 r/min培養(yǎng)10h。將培養(yǎng)液經(jīng)8000 r/min離心10min, 取上清經(jīng)0.22 μm濾膜除菌, 除菌后的噬菌體液用二層平板法檢測噬菌體效價, 效價最高的所對應(yīng)的感染復(fù)數(shù)為最佳感染復(fù)數(shù)。

噬菌體SX-2和SX-F一步生長曲線測定參照余茂効等[22]、Ramírez-Orozco等[23]的方法, 略做改動。以SX-2為例, 以MOI為0.1的比例加入SX-2和宿主菌Vp13(109pfu/108cfu), 37℃靜置10min, 8000 r/min離心1min, 用SM緩沖液洗滌3次去除未吸附的噬菌體, 將沉淀置于10 mL離心管中充分混勻。立即置于37℃搖床培養(yǎng)(150 r/min), 并開始計時。在0時取樣100 μL, 以后每隔10min取樣, 共120min, 每次取完的樣品立即用二層平板法檢測效價, 每個時間點做3次平行, 橫坐標(biāo)為感染時間, 縱坐標(biāo)為噬菌體效價, 繪制SX-2的一步生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體SX-2和SX-F篩選

從上海銅川路海產(chǎn)品市場下水道采集的2號水樣和5號水樣中分離到2株噬菌體, 分別為SX-2和SX-F。其中SX-2形成的噬菌斑中間透亮, 邊緣有暈環(huán), 隨著時間的延長暈環(huán)會逐步增大。SX-F形成的噬菌斑是一個透亮的噬菌斑, 隨著時間的延長沒有出現(xiàn)暈環(huán)。2種噬菌體出現(xiàn)噬菌斑的時間均在6h。在分離的過程中, 添加20% PEG、10% CaCl2以及SM緩沖液富集培養(yǎng), 比直接使用水樣篩選更容易篩選到噬菌體(表 1)。實驗過程中發(fā)現(xiàn)噬菌體與宿主菌間的濃度比例與培養(yǎng)時間會影響噬菌斑的觀察(表 2)。

表 1 PEG1、CaCl2及SM緩沖液的添加對噬菌體篩選的影響Tab.1 Effects of PEG1, CaCl2and SM buffer on phage screening

表 2 噬菌體與宿主菌濃度比對噬菌斑形成的影響Tab.2 Effects of concentration ratio of phage and host bacteria on the phage plaque

2.2 噬菌體SX-2和SX-F電鏡觀察

噬菌體電鏡照片結(jié)果顯示: SX-F(圖 1A)未觀察到尾部, 是正六邊形, 頭部長約為56.86 nm, 寬約為50.74 nm。SX-2(圖 1B)觀察到頭部和尾部, 頭部長約110 nm, 寬約50 nm, 尾部長約150 nm, 寬約10 nm。

圖 1 噬菌體SX-F(A)和SX-2(B)的透射電鏡照片F(xiàn)ig.1 TEM micrograph of phage SX-F (A) and SX-2 (B)

2.3 噬菌體SX-2和SX-F核酸類型鑒定

1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示提取的噬菌體SX-2和SX-F核酸純度好, 條帶完整。二者都能被DNase I消化降解, 不能被RNase A消化降解, 說明遺傳物質(zhì)是DNA; 都不能被Mung Bean Nuclease消化降解, 能被Hind Ш 消化降解, 說明二者都是雙鏈DNA; 二者核酸條帶都是只有一個條帶, 說明噬菌體SX-2和SX-F兩者的核酸均為線性雙鏈DNA。

2.4 噬菌體SX-2和SX-F裂解譜測定

對2株噬菌體分別做了除宿主菌外的85株弧菌裂解譜的檢測, 其中VaK為溶藻弧菌, 其他均為副溶血弧菌。結(jié)果顯示, 噬菌體SX-2能夠裂解23株副溶血弧菌和1株溶藻弧菌VaK, 噬菌體SX-F能夠裂解19株副溶血弧菌和1株溶藻弧菌VaK, 說明兩株噬菌體都具有一定范圍的裂解譜(表 3)。

2.5 噬菌體SX-2和SX-F最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)測定

噬菌體SX-2和SX-F的效價都是在感染復(fù)數(shù)為0.0001時效價達到最高值, 所以二者的最佳感染復(fù)數(shù)都為0.0001(表 4)。

2.6 噬菌體SX-2和SX-F一步生長曲線測定

噬菌體SX-F的潛伏期約10min, 裂解期約70min, 根據(jù)計算公式計算SX-F裂解量=裂解末期噬菌體效價/感染初期宿主菌濃度, SX-F裂解量=5×1010/4.3×108=116.2; 噬菌體SX-2的潛伏期小于10min, 裂解期約70min。SX-2裂解量=9×1010/4.3× 108=209.3(圖 2)。

3 討論

3.1 噬菌體分離

表 3 SX-2和SX-F對弧菌的裂解Tab.3 Lytic effect of SX-2 and SX-F on Vibrio spp.

表 4 噬菌體SX-2和SX-F的最佳感染復(fù)數(shù)Tab.4 The optimal MOI of phage SX-2 and SX-F

本研究從采集的23份水樣中共分離到了2株副溶血弧菌Vp13的烈性噬菌體SX-2和SX-F。噬菌體的分離受到多種理化因素的影響, 如PEG和鈣、鎂離子、噬菌體與宿主菌間的濃度比例及培養(yǎng)時間等因素都會直接影響分離的結(jié)果。

圖 2 噬菌體SX-F和SX-2的一生長曲線Fig.2 One-step growth curve of phage SX-F and SX-2

PEG具有濃縮噬菌體顆粒和細(xì)菌的作用, 能夠促進噬菌體吸附在細(xì)菌表面; Ca2+和Mg2+能夠增加細(xì)胞膜的通透性促進噬菌體的侵染。Samantha等[27]在分離噬菌體時加入CaCl2, 有助于快速篩選到噬菌體。實驗通過水樣直接篩選, 水樣中噬菌體的效價為2 pfu/mL, 通過加入20% PEG、10% CaCl2以及SM緩沖液富集培養(yǎng), 水樣中噬菌體的效價為4×106pfu/mL,顯著促進了噬菌體的富集與效價的提升, 縮短了噬菌體分離的周期, 提高了噬菌體分離的效率。

噬菌體與宿主菌間的濃度比例與培養(yǎng)時間會影響噬菌斑的觀察。藺紅蘋等[20]分離噬菌體時, 噬菌體濃度顯著高于宿主菌濃度時, 雙層平板上呈細(xì)沙樣渾濁或大面積清亮, 噬菌斑出現(xiàn)后隨著時間的延長, 耐受菌生長后覆蓋噬菌斑, 導(dǎo)致不能觀察到噬菌斑。本研究通過優(yōu)化二者間的濃度比例, 發(fā)現(xiàn)當(dāng)噬菌體SX-2和SX-F與宿主菌濃度比例為104—107pfu/mL鯰108cfu/mL時才能在二層平板上清楚地觀察到噬菌斑。當(dāng)噬菌體的濃度(1010pfu/mL)顯著高于宿主菌的濃度(108cfu/mL)時, 觀察到雙層平板上出現(xiàn)細(xì)沙樣混濁(SX-F)和清亮(SX-2)兩種現(xiàn)象, 未能觀察到完整的噬菌斑。培養(yǎng)時間也是影響噬菌斑觀察的另一重要因素, 因此, 完整噬菌斑的觀察要選擇合適的培養(yǎng)時間。在本實驗中, 當(dāng)噬菌體與宿主菌混合濃度比例為104—107pfu/mL∶108cfu/mL時, 觀察噬菌斑的最佳培養(yǎng)時間為6—10h, 此時, 能夠觀察到形態(tài)完整的噬菌斑; 當(dāng)培養(yǎng)時間進一步延長時, 副溶血弧菌形成的菌苔能夠覆蓋噬菌斑, 從而無法觀察到噬菌斑。

3.2 噬菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)

邱德全等[28]分離的副溶血弧菌噬菌體頭部為正二十面體, 直徑約110 nm, 尾部長約270 nm, 底部有3個刺突, 符合肌尾噬菌體科特征。江艷華等[15]分離的副溶血弧菌噬菌體頭部呈二十面體立體結(jié)構(gòu), 直徑約60 nm, 尾部寬約8 nm, 長約20 nm, 符合短尾噬菌體科特征。本文篩選的2株噬菌體與以上學(xué)者描述的副溶血弧菌噬菌體均不同, SX-2的衣殼蛋白由頭部和尾部組成, 頭部長約110 nm, 寬約50 nm, 尾部長約150 nm, 寬約10 nm, 屬于復(fù)合對稱, 核酸類型為線性雙鏈DNA, 符合肌尾噬菌體科特征, SX-F未觀察到尾部, 是正六邊形, 推測為正二十面體, 頭部長約為56.86 nm, 寬約為50.74 nm。核酸類型為線性雙鏈DNA, 符合蓋噬菌體科特征。這兩株副溶血弧菌Vp13的噬菌體是否為新型噬菌體尚需進一步研究。

3.3 噬菌體裂解譜

噬菌體的裂解譜在生物防控方面具有重要的應(yīng)用價值。但是由于噬菌體具有宿主專一性, 因此,大部分噬菌體的裂解譜都十分窄。彭勇等[18,19]對分離到的噬菌體VPp1進行了8株弧菌裂解效果檢測, 隨后又對分離到的噬菌體VPp2和VPp3進行了12株弧菌裂解效果檢測, 結(jié)果顯示噬菌體VPp1、VPp2和VPp3只對2株弧菌具有裂解效果。本實驗85株弧菌檢測結(jié)果表明兩株噬菌體具有較強的裂解能力, 裂解譜占到實驗菌株的24%以上, 具有潛在的應(yīng)用價值, 為開發(fā)新型抗菌的微生物制劑奠定了基礎(chǔ)。

3.4 噬菌體的生物學(xué)特性

感染復(fù)數(shù)是病毒與宿主之間量化與產(chǎn)出的重要生物學(xué)指標(biāo)[20]。噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)是指產(chǎn)出噬菌斑最多時對應(yīng)的初始加入噬菌體數(shù)量與宿主菌數(shù)量的比值。丁云娟等[17]分離的副溶血弧菌噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)為0.1—10, Pringsulaka等[21]測得食竇魏斯氏菌(Weissella cibaria)噬菌體感染宿主菌的最佳感染復(fù)數(shù)在0.01。本實驗篩選到的2株噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)都是0.0001說明這2株噬菌體都具有較強的裂解能力。

噬菌體的一步生長曲線能夠反映出噬菌體的3個特征: 潛伏期、裂解期和裂解量。從潛伏期可得知噬菌體吸附于細(xì)胞并釋放出子代噬菌體的最短時間。裂解期是緊接在潛伏期后的宿主細(xì)胞迅速裂解、溶液中噬菌體粒子急速增加的一個階段,從理論上來說, 其裂解是瞬間出現(xiàn)的, 但因宿主群體中各個細(xì)胞的裂解不可能是同步進行的, 故出現(xiàn)較長的裂解期。裂解量指每個感染細(xì)胞所產(chǎn)生的子代噬菌體的平均數(shù)目。其中潛伏期和裂解量是噬菌體增值的2個特征性數(shù)據(jù)。噬菌體SX-F和SX-2的潛伏期(約10min)高于江艷華等[16]分離到的噬菌體VpJYP1(5min), 低于丁云娟等[17]分離的噬菌體qdvp001(20min)。噬菌體SX-F的裂解量(110)與江艷華等[17]分離到的噬菌體VpJYP1(110)相同, 略高于彭勇等[19]分離到的噬菌體VPp1(90.3), 噬菌體SX-2裂解量(209.3)顯著高于噬菌體SX-F、VpJYP1以及VPp1。從潛伏期長短和裂解量的大小比較, 本研究獲得的兩株噬菌體的裂解性能優(yōu)良。

綜上所述, 本實驗分離到的2株副溶血弧菌Vp13的噬菌體均為烈性噬菌體, 具有良好的應(yīng)用價值, 可以作為抗生素的替代制劑用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中副溶血弧菌疾病的防治。

[1]Palanki M S S, Bhat A, Bolanos B, et al.Development of a long acting human growth hormone analog suitable for once a week dosing [J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2013, 23(2): 402—406

[2]Su Y C, Liu C.Vibrio parahaemolyticus: a concern of seafood safety [J].Food Microbiology, 2007, 24(6): 549—558

[3]Wang Y G, Zhang Z, Qing L, et al.The main diseases of cultured turbot (Scophthalmus maximus) and their prevention and treatment [J].Marine Fisheries Research, 2004, 25(6): 61—68 [王印庚, 張正, 秦蕾, 等.養(yǎng)殖大菱鲆主要疾病及防治技術(shù).海洋水產(chǎn)研究, 2004, 25(6): 61—68]

[4]Zhang X, Cai J P.Determination of the antibiotic susceptibilities of four marine pathogenic Vibrios [J].Journal of South China University of Technology (Natural Science Edition), 2003, 31(9): 66—69 [張昕, 蔡俊鵬.四種海洋致病弧菌對抗生素敏感性的測定.華南理工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2003, 31(9): 66—69]

[5]Wu H B, Pan J P.Progress in studies of vibriosis in aquaculture [J].Journal of Fishery Sciences of China, 2001, 8(1): 89—93 [吳后波, 潘金培.弧菌屬細(xì)菌及其所致海水養(yǎng)殖動物疾病.中國水產(chǎn)科學(xué), 2001, 8(1): 89—93]

[6]Yan M C, Chen S B, Shan L Z, et al.A critical review: pathogenic Vibrio in maricultural animals [J].Fishers Science, 2009, 28(8): 475—481 [閆茂倉, 陳少波, 單樂州,等.海水養(yǎng)殖動物致病弧菌的研究進展.水產(chǎn)科學(xué), 2009, 28(8): 475—481]

[7]Li Y C, Bao Y M, Lü J F.Biological control of vibriosis of the marine economic animals [J].Fishers Science, 2004, 23(2): 35—38 [李亞晨, 包永明, 呂建發(fā), 等.海洋水產(chǎn)動物弧菌病的生物防治.水產(chǎn)科學(xué), 2004, 23(2): 35—38]

[8]Zhang Q Y, Gui J F.A kind of strategic bio-resource not to be negelected-freshwater and marine viruses and their roles in the global ecosystem [J].Bulletin of Chinese Academy of Sciences, 2009, 24(4): 414—420 [張奇亞, 桂建芳.一類不可忽視的戰(zhàn)略生物資源——淡水與海水中的病毒及其在生態(tài)系統(tǒng)中的作用.中國科學(xué)院院刊, 2009, 24(4): 414—420]

[9]Dublanchet A, Fruciano E.A short history of phage therapy [J].Médecine Et Maladies Infectieuses, 2008, 38(8): 415

[10]Qiu D Q , Zhou X J, Qiu M S.Study on anti-disease ability of litopenaeus vannamei and the biological control of vibrio parahaemolyticus bacteriophage under stresses of ammonia nitrogen [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2008, 32(4): 455—461 [邱德全, 周鮮嬌, 邱明生.氨氮脅迫下凡納濱對蝦抗病力和副溶血弧菌噬菌體防病效果研究.水生生物學(xué)報, 2008, 32(4): 455—461]

[11]Wang S, Tong Y G.Recent advance in bacteriophage therapy [J].Microbiology, 2009, 36(7): 1019—1024 [王盛, 童貽剛.噬菌體治療研究進展.微生物學(xué)通報, 2009, 36(7): 1019—1024]

[12]Young R, Wang I N, Roof W D.Phages will out: strategies of host cell lysis [J].Trends in Microbiology, 2000, 8(3): 120—128

[13]Carlton R M, Noordman W H, Biswas B, et al.Bacteriophage P100 for control of Listeria monocytogenes in foods: genome sequence, bioinformatic analyses, oral toxicity study and application [J].Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2005, 43(3): 301—312

[14]Bruttin A, Brussow H.Human volunteers receiving Escherichia coli phage T4 orally: a safety test of phage therapy [J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2005, 49(7): 2874—2878

[15]Zhao C, Wang L.Bacteriophage therapy, old idea, new stage [J].Microbiology, 2011, 38(11): 1698—1704 [趙晨,王輅.噬菌體治療——舊概念, 新階段.微生物學(xué)通報, 2011, 38(11): 1698—1704]

[16]Jang Y H, Wang L Z, Li F L, et al.Isolation, identification and biological properties of a lytic phage against Vibrio parahaemolyticus [J].Chinese Journal of Biological, 2015, 28(11): 1147—1152 [江艷華, 王聯(lián)珠, 李風(fēng)鈴, 等.一株副溶血性弧菌裂解性噬菌體的分離, 鑒定及其生物學(xué)特性.中國生物制品學(xué)雜志, 2015, 28(11): 1147—1152]

[17]Ding Y J, Peng Y, Lin H, et al.Isolation, identification and physiological property of lytic phage against Vibrio parahaemolyticus [J].Microbiology, 2011, 38(11): 1639—1646 [丁云娟, 彭勇, 林洪, 等.一株副溶血弧菌噬菌體的分離鑒定及生理特性.微生物學(xué)通報, 2011, 38(11): 1639—1646]

[18]Peng Y, Wang J L, Ding Y J, et al.Isolation, identification and lysis property of two Vibrio parahaemolyticus phages [J].Fishers Science, 2012, 31(11): 645—650 [彭勇, 王靜雪, 丁云娟, 等.兩株副溶血弧菌噬菌體的分離鑒定及裂解性能.水產(chǎn)科學(xué), 2012, 31(11): 645—650]

[19]Peng Y, Ding Y J, Lin H, et al.Isolation, identification and lysis properties analysis of a Vibrio parahaemolyticus phage VPp1 [J].Marine Sciences, 2013, 37(1): 96—101 [彭勇, 丁云娟, 林洪,等.一株副溶血弧菌噬菌體VPp1的分離鑒定及裂解性能.海洋科學(xué), 2013, 37(1): 96—101]

[20]Lin H P, Qiu D Q, Tan L Y.Isolation and identification of a Vibrio parahaemolyticus phage [J].Fishers Science, 2010, 29(5): 291—294 [藺紅蘋, 邱德全, 譚龍艷.一株副溶血弧菌噬菌體的分離與鑒定.水產(chǎn)科學(xué), 2010, 29(5): 291—294]

[21]Pringslaka O, Patarasinpaiboon N, Suwannasai N, et al.Isolation and characterisation of a novel podoviridaephage infecting Weissella cibaria N 22 from Nham, a Thai fermented pork sausage [J].Food Microbiology, 2011, 28(3): 518—525

[22]Yu M X, Si Z D.Phage Experimental Techniques [M].Beijing: Science Press.1991, 5—29 [余茂効, 司稺東.噬菌體實驗技術(shù).北京: 科學(xué)出版社.1991, 5—29]

[23]Ramirez-orozco M, Serrano-pinto V, Ochoa-álvarez N, et al.Genome sequence analysis of the Vibrio parahaemolyticus lytic bacteriophage VPMS1 [J].Archives of Virology, 2013, 158(11): 2409—2413

[24]Sambrook J, Russell D W, Huang P T, et al.Molecular Cloning A Laboratory Manual [M].Beijing: Science Press.2002, 147—243 [薩姆布魯克, D.W.拉塞爾, 黃培堂, 等.分子克隆實驗指南.北京: 科學(xué)出版社.2002, 147—243]

[25]Nasu H, Iida T, Sugahara T, et al.A filamentous phage associated with recent pandemic Vibrio parahaemolyticus O3: K6 strains [J].Journal of Clinical Microbiology, 2000, 38(6): 2156—2161

[26]Yamaichi Y, Iida T, Park K S, et al.Physical and genetic map of the genome of Vibrio parahaemolyticus: presence of two chromosomes in Vibrio species [J].Molecular Microbiology, 1999, 31(5): 1513—1521

[27]Hawtrey S, Lovell L, Rondey K, et al.Isolation, characterization, and annotation: the search for novel bacteriophage genomes [J].The Journal of Experimental Secondary Science, 2011, 1: 6—14

[28]Qiu D Q, Lin H P, Tan L Y.Study of the biochemical properties of the Vibrio parahaemolyticus bacte-rphages [J].Microbiology, 2007, 34(4): 735—739 [邱德全, 藺紅蘋, 譚龍艷.一株副溶血弧菌噬菌體生理特性的研究.微生物學(xué)通報, 2007, 34(4): 735—739]

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF TWO LYTIC PHAGES AGAINST VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS

SONG Zeng-Fu1,2, XU Hua-Dong1, PENG Meng-Fan1, SUN Bo-Chao1, ZHAO Zheng1, ZHANG Ye1, REN Jian-Feng1,3and ZHANG Qing-Hua1,3
(1.College of Fisheries and Life Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2.National Aquatic Animal Pathogens, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3.Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The aim of this study was to screen lytic phase and provide new alternatives for the prevention and control of V.parahaemolyticus.In this study, two lytic phages SX-2 and SX-F were isolated by double-layer plate method against the host bacteria V.parahaemolyticus Vp13.The morphological structures of these two phages were observed by transmission electron microscope (TEM).The types of nucleic acids were identified by the degradation characteristics of DNase I, RNase A, Mung Bean Nuclease and Hind Ш.The lysis spectrum, optimal multiplicity of infection and one step growth curve of SX-2 and SX-F were also analyzed.The results of TEM showed that the capsid protein of lytic phage of SX-2 was a complex symmetry with icosahedral symmetry head that had length of about 110 nm and width of about 50 nm and a spiral symmetry tail that had length of about 110 nm and width of about 10 nm.SX-F showed hexagon with length of about 56.86 nm and width of about 50.74 nm without a tail, which was icosahedral symmetry.Both SX-2 and SX-F were linear double stranded DNA bacteriophage.They were belonged to the family of Myoviridae and Tectivirus based on the taxonomy standard of the ninth report of the International Committee Taxonomy of Viruses.Results of lytic experiment on 85 Vibrio strains showed that phage SX-2 could lysis 23 strains of V.parahaemolyticus and one strain of Vibrio alginolyticus, and phage SX-F could lysis 19 strains of V.parahaemolyticus and one strain of V.alginolyticus.The optimal multiplicity of infection of plase SX-2 and SX-F were 0.0001.One step growth curve showed that the incubation period of phage SX-F was about 10min, the lytic cycle was 70min, and the burst size was 116.2.The incubation period of the phage SX-2 was less than 10min, and the lytic cycle was about 70min, and the burst size was 209.3.These results indicated that both of them were lytic phages, which can be used as an alternative to control and prevention of the V.parahaemolyticus.

Vibrio parahaemolyticus; Lytic phage; Morphological structure; Biological characteristics

S945.1+2

A

1000-3207(2017)04-0793-07

10.7541/2017.99

2016-05-24;

2016-07-15

上海市水產(chǎn)遺傳育種協(xié)同創(chuàng)新中心基金(ZF1206); 上海海洋大學(xué)博士啟動基金(A2-0203-00-100319); 上海市高校新進教師培訓(xùn)及科研啟動基金(A1-2056-16-0021)資助 [Supported by the Shanghai Collaborative Innovation Center for Aquaculture Genetics and Breeding (ZF1206); Shanghai Ocean University Doctor start-up Fund(A2-0203-00-100319);Shanghai New College Teacher Training and Research Start-up Fund(A1-2056-16-0021)]

宋增福(1971—), 男, 山東臨沂人; 博士, 副教授; 主要從事水產(chǎn)病害防控技術(shù)研究。E-mail: zfsong@shou.edu.cn

張慶華, E-mail: qhzhang@shou.edu.cn