草魚TRIM32基因克隆表達(dá)及功能研究

賈路路曾令兵王 方彭俊杰王業(yè)大周 勇劉學(xué)芹

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水生動(dòng)物醫(yī)學(xué)系, 武漢 430070; 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所, 武漢 430070; 3.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 武漢 430070; 4.池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070)

草魚TRIM32基因克隆表達(dá)及功能研究

賈路路1,2,3,4曾令兵2王 方1,3,4彭俊杰1,3,4王業(yè)大1,3,4周 勇2劉學(xué)芹1,3,4

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水生動(dòng)物醫(yī)學(xué)系, 武漢 430070; 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所, 武漢 430070; 3.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 武漢 430070; 4.池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070)

TRIM (Tripartite-motif protein) 家族是機(jī)體先天性免疫的重要成員, 參與細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡、腫瘤抑制、抗病毒等過程。為了進(jìn)一步探究TRIM蛋白在魚類免疫中的作用, 實(shí)驗(yàn)利用PCR方法克隆了草魚TRIM32基因的編碼區(qū)全長(zhǎng), 共1980 bp, 編碼660個(gè)氨基酸。草魚TRIM32具有TRIM家族典型的3個(gè)結(jié)構(gòu)域, 與斑馬魚TRIM32的核苷酸序列同源性較高, 遺傳進(jìn)化分析也聚為一支。間接免疫熒光、Western-blotting檢測(cè)結(jié)果顯示草魚TRIM32在EPC細(xì)胞中成功表達(dá), 主要以點(diǎn)狀分布在細(xì)胞質(zhì)中, 細(xì)胞核中表達(dá)量較少; 組織分布分析表明TRIM32在被檢測(cè)的11個(gè)組織中均有表達(dá), 其中在頭腎組織中的表達(dá)量明顯高于其他組織; 不同胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析進(jìn)一步表明, TRIM32在受精卵時(shí)期、卵裂期和囊胚期的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期(P<0.05), 隨后表達(dá)量下降, 直到出膜后表達(dá)量再次顯著性升高。此外, 雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)顯示TRIM32能夠激活NF-κB信號(hào)通路, 誘導(dǎo)下游的炎癥反應(yīng)。結(jié)果顯示, 草魚TRIM32廣泛分布于魚體內(nèi), 并參與機(jī)體的天然免疫反應(yīng), 對(duì)于抵抗病原體的入侵具有重要作用。

TRIM32; 克隆; 真核表達(dá); NF-κB

TRIM (Tripartite-motif protein)家族蛋白, 也稱為RBCC家族蛋白, 從N端到C端依次是RING結(jié)構(gòu)域、B-box結(jié)構(gòu)域、Coiled-coil結(jié)構(gòu)域, 其在細(xì)胞的增殖、分化、腫瘤的抑制、病毒的抑制等方面發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[1,2]。在哺乳動(dòng)物中TRIM家族的部分成員, 例如TRIM25、TRIM5α等, 在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中可以起到E3泛素連接酶的作用, 從而調(diào)控機(jī)體的抗病毒天然免疫反應(yīng)[3—6]。

在哺乳動(dòng)物中TRIM32的功能研究較多, TRIM32 RING結(jié)構(gòu)域具有泛素連接酶活性, 能夠促進(jìn)下游靶蛋白發(fā)生泛素化修飾, 從而激活NF-κB信號(hào)通路; TRIM32還可以抑制病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá), 促進(jìn)病毒粒子的釋放[7—10]。此外, TRIM32 羧基末端含有6個(gè)NHL重復(fù)結(jié)構(gòu)域(NCL-1、HT2A和LIN-41), 參與蛋白/蛋白相互作用[11]。在皮膚癌變模型小鼠以及UVB輻射誘發(fā)小鼠皮膚癌變的致癌性研究過程中發(fā)現(xiàn), TRIM32的表達(dá)有顯著性升高,同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)TRIM32具有抗凋亡活性[12,13]。目前對(duì)于TRIM家族在魚類中的功能研究相對(duì)較少,主要集中在TRIM家族在魚類先天性免疫中的重要作用[14]。有研究表明魚類中TRIM家族同哺乳動(dòng)物具有相似的功能, 在病毒刺激后魚體中TRIM家族的表達(dá)量上升, 同時(shí)也證實(shí)TRIM家族參與魚體的抗病毒天然免疫反應(yīng)并發(fā)揮重要作用[15,16]。

本研究克隆表達(dá)了草魚 (Ctenopharyngodon idellus)TRIM32, 分析其在不同組織及不同胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)豐度, 并檢測(cè)對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響, 為研究草魚TRIM32在天然免疫中的作用及機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞組織載體質(zhì)粒pcDNA 4.0和EPC細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存, E.coli.DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa公司, 草魚購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場(chǎng)。

工具酶及化學(xué)試劑限制酶、T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司, 質(zhì)粒DNA小提試劑盒購自O(shè)mega公司, HRPDAB底物顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司, 轉(zhuǎn)染試劑lipo2000購自Promega公司, 鼠源抗His標(biāo)簽抗體購自Sigma公司, HRP標(biāo)記的羊抗鼠熒光二抗購自美國(guó)Invitrogen公司, pNF-κB-Luc購自Agilent Technologies公司、pRL-TK購自Promega公司, M199培養(yǎng)基購自Hyclone公司, 新生胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI鯉TRIM32編碼區(qū)全長(zhǎng)序列(序列號(hào): emb|LN591166.1|), 用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,上游引物為F: 5′-ATGGCCACACCAACATCCC TA-3′, 下游引物為R: 5′-TTAACATGTAGAGGA ACGTCTCT-3′。

設(shè)計(jì)真核表達(dá)引物, 上游引物加入BamHⅠ酶切位點(diǎn), 下游引物加入XbaⅠ酶切位點(diǎn), 上游引物為F1: 5′-AAAGGATCCATGGCCACACCAACATC CCTA-3′, 下游引物為R1: 5′-AAATCTAGAACAT GTAGAGGAACGTCTCT-3′, 下劃線部分為限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。

設(shè)計(jì)熒光定量特異性引物, 上游引物RT-F: 5′-TGCCTTTGCCACCTCCTTG-3′, 下游引物RT-R: 5′-TCTTCTTCATTGTTACTCCCTTCC-3′。

以上引物均由武漢擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 TRIM32基因克隆

試驗(yàn)草魚在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)1周后, 冰上解剖取脾臟組織50—100 mg于1 mL Trizol試劑中, 按照Trizol使用說明提取總RNA, 以其反轉(zhuǎn)錄獲取的cDNA為模板, 通過PCR擴(kuò)增TRIM32基因。PCR擴(kuò)增程序?yàn)? 95℃預(yù)變性5min; 95℃變性30s, 58℃退火30s, 72℃延伸2min, 共35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并純化回收目的片段, 將回收產(chǎn)物連接到克隆載體pMD19-T(TaKaRa公司)得到重組質(zhì)粒pMD19-TTRIM32, 將其轉(zhuǎn)化到E.coli.DH5α感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司)。經(jīng)Ampicillin抗性篩選, 挑取陽性菌落, 擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR鑒定, 并由武漢擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.4 TRIM32序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將測(cè)序所得核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列用BLAST程序比對(duì)分析, 用CLUSTAL軟件對(duì)不同物種TRIM32各結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對(duì)分析, 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建使用MEGA6.06軟件進(jìn)行對(duì)比分析。

1.5 TRIM32真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

提取鑒定正確的重組質(zhì)粒pMD19-T-TRIM32,經(jīng)BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切后膠回收, 以摩爾比3鯰1連接到經(jīng)相同雙酶切的質(zhì)粒pcDNA4.0。轉(zhuǎn)化至E.coli.DH5α感受態(tài)細(xì)胞, Ampicillin抗性篩選, 挑取陽性克隆培養(yǎng)并進(jìn)行菌落PCR鑒定, 所構(gòu)建的重組表達(dá)載體初步命名為pcDNA4.0-TRIM32, 并送至武漢擎科測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.6 免疫印跡鑒定TRIM32基因的表達(dá)

轉(zhuǎn)染36h后收集細(xì)胞, 用預(yù)冷的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞, 冰上放置15min; 將細(xì)胞裂解液4℃ 12000 r/min離心15min, 上清為獲取的細(xì)胞總蛋白; 不同處理樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳; 電泳后, 12V電壓過夜轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜; 用封閉液(含1% BSA的TBST)在室溫下封閉1h; 加入一抗鼠源抗His標(biāo)簽抗體和HRP-羊抗鼠二抗后, 將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光底物A和B液的等量混合液中進(jìn)行避光顯色, 用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行照相。

1.7 TRIM32蛋白在EPC細(xì)胞中的定位

用轉(zhuǎn)染試劑lipo 2000將重組質(zhì)粒pcDNA4.0-TRIM32轉(zhuǎn)染至EPC細(xì)胞。具體操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒用量為0.8 μg, 轉(zhuǎn)染4h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液, 36h后用PBS洗滌細(xì)胞3次, 每次5min。100%甲醇室溫固定10min, PBS洗滌3次, 每次5min。用封閉液(含1% BSA的PBS)封閉30min, PBS洗滌3次, 每次5min。加入封閉液稀釋的鼠源一抗(抗His標(biāo)簽), 孵育1—2h, PBS洗滌3次, 每次5min。加入封閉液稀釋的羊抗鼠二抗, 孵育45min, PBS洗滌3次, 每次5min。加入適量PBS, 防止干樣。在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光并拍照。

1.8 草魚TRIM32在不同組織及不同胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

試驗(yàn)草魚為1齡草魚, 魚體全長(zhǎng)20—25 cm, 體重350—400 g。試驗(yàn)魚體在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)1周后, 于冰上解剖取肌肉、腦、眼、鰓、心、肝、腎、頭腎、脾、皮膚、腸道各50—100 mg于1 mL Trizol試劑中, 分別取3組作為3個(gè)平行。按照Trizol使用說明提取總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TRIM32在不同組織的相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)魚卵在受精后于28℃水溫中進(jìn)行孵化, 在光學(xué)顯微鏡下觀察受精卵胚胎發(fā)育情況, 并在受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸期、神經(jīng)胚期、眼囊期、心跳期各取3粒受精卵于1 mL Trizol試劑中(重復(fù)3個(gè)平行), 在出膜期、出膜后1d、出膜后2d、出膜后3d、出膜后4d、出膜后5d取3尾魚苗于1 mL Trizol試劑中(重復(fù)3個(gè)平行), 按照Trizol使用說明提取總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TRIM32在不同胚胎發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量。在此次試驗(yàn)中受精卵時(shí)期為受精后3min, 卵裂期為受精后1h, 囊胚期為受精后2.5h, 原腸期為受精后10h, 神經(jīng)胚期為受精后12h, 眼囊期為受精后14.5h, 尾鰭期為受精后18.5h, 心跳期為受精后19.5h, 出膜期為受精后22h。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 20 μL反應(yīng)體系: cDNA模板2 μL, 上游引物RT-F 0.8 μL, 下游引物RT-R 0.8 μL, SYBR green Real-time PCR master mix 10 μL, 加水至20 μL。PCR擴(kuò)增程序: 95℃3min; 95℃ 10s, 58℃ 30s, 40個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)草魚TRIM32對(duì)NF-κB活性的影響

雙熒光素酶活性測(cè)定按照Promega公司提供的分析系統(tǒng)說明書進(jìn)行。除去細(xì)胞培養(yǎng)基, PBS沖洗細(xì)胞, 加入Passive Lysis Buffer(PLB)細(xì)胞裂解液100 μL, 室溫輕緩晃動(dòng)培養(yǎng)板15min后再吹打細(xì)胞,收集細(xì)胞裂解液, 通過生物化學(xué)發(fā)光分析儀(德國(guó)Berthold公司) 進(jìn)行雙熒光素酶活性測(cè)定。以螢火蟲熒光素酶的活性與海腎熒光素酶活性的比值表示被檢測(cè)的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后所測(cè)得的熒光素酶的相對(duì)活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示, 采用Welch校正的非配對(duì)t檢驗(yàn)。P≥0.05認(rèn)為無顯著性差異; P<0.05認(rèn)為差異顯著, 用“*”表示; P<0.01認(rèn)為差異非常顯著, 用“**”表示。

2 結(jié)果

2.1 TRIM32基因克隆

從草魚脾臟組織中提取總RNA, 以反轉(zhuǎn)錄獲取的cDNA為模板, 擴(kuò)增TRIM32 CDS區(qū)全長(zhǎng)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 結(jié)果顯示均在大約2000 bp位置檢測(cè)到特異性目的條帶(圖 1)。將擴(kuò)增片段純化回收連接到克隆載體pMD19-T得到重組質(zhì)粒pMD19-TTRIM32, 經(jīng)測(cè)序草魚TRIM32 CDS區(qū)全長(zhǎng)為1980 bp。

2.2 TRIM32序列分析

草魚TRIM32同其他物種的核苷酸序列比對(duì)結(jié)果表明, 草魚TRIM32與斑馬魚(Danio rerio)和鯉(Cyprinus carpio)具有很高的同源性, 分別為87%和90%, 而與人類(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的同源性相對(duì)較低, 只有71%和73%。同時(shí)氨基酸結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ确治霰砻鞑蒴~TRIM32具有典型的RING結(jié)構(gòu)域、B-BOX結(jié)構(gòu)域以及SPRY結(jié)構(gòu)域等保守結(jié)構(gòu)域(圖 2)。

圖 1 TRIM32 PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR product of TRIM32

2.3 TRIM32系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

通過草魚與其他物種的TRIM32構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹來進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析(圖 3), 結(jié)果表明草魚TRIM32與斑馬魚和墨西哥脂鯉(Astyanax mexicanus)的親緣關(guān)系較近, 遺傳進(jìn)化分析聚為一支, 與爬行類的揚(yáng)子鱷(Alligator sinensis)和哺乳類的人、小白鼠的遺傳距離較遠(yuǎn)。

2.4 TRIM32真核表達(dá)產(chǎn)物免疫印跡檢測(cè)

構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA4.0-TRIM32并轉(zhuǎn)染至EPC細(xì)胞, 經(jīng)Western-blotting分析檢測(cè)TRIM32的表達(dá)情況, 結(jié)果顯示在約75 kD處有特異性條帶, 且與目的蛋白理論大小一致, 而空載體pcDNA4.0轉(zhuǎn)染組無特異性條帶, 證明目的蛋白在EPC細(xì)胞中得到表達(dá)(圖 4)。

2.5 TRIM32蛋白在EPC細(xì)胞中的定位

將重組質(zhì)粒pcDNA4.0-TRIM32轉(zhuǎn)染至EPC細(xì)胞, 36h后進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè), 同時(shí)以空載體pcDNA4.0轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞作為對(duì)照。結(jié)果顯示: 在pcDNA4.0-TRIM32轉(zhuǎn)染組中有明顯的綠色熒光, 表明TRIM32蛋白主要以點(diǎn)狀分布在細(xì)胞質(zhì)中, 細(xì)胞核中表達(dá)量較少(圖 5)。

2.6 草魚TRIM32在不同組織及不同胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)TRIM32基因在草魚不同組織的表達(dá)進(jìn)行分析, 結(jié)果表明TRIM32在草魚的組織中廣泛表達(dá), 而在頭腎組織中TRIM32的表達(dá)水平最高, 脾臟與腦組織次之, 肌肉組織中表達(dá)量最少(圖 6)。

圖 2 草魚TRIM32蛋白與其他物種序列比對(duì)Fig.2 Grass carp（C.idellus）TRIM32 amino acids sequence

圖 3 草魚與其他物種TRIM32的進(jìn)化樹分析Fig.3 The phylogenetic tree of TRIM32 from grass carp (C.idellus) and other species

圖 4 Western blotting檢測(cè)TRIM32在EPC細(xì)胞中的表達(dá)Fig.4 Western blotting of TRIM32 in EPC cells

對(duì)草魚不同胚胎發(fā)育時(shí)期TRIM32的表達(dá)量進(jìn)行了分析, 結(jié)果表明TRIM32在整個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期均有表達(dá), 而在受精卵時(shí)期、卵裂期和囊胚期的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期, 隨后表達(dá)量下降, 直到出膜后表達(dá)量再次顯著升高(圖 7)。

2.7 草魚TRIM32激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB

將pcDNA4.0-TRIM32質(zhì)粒、pNF-κB-Luc質(zhì)粒和pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞, 48h后, 用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè), 結(jié)果顯示: 轉(zhuǎn)染草魚TRIM32報(bào)告基因組活性是對(duì)照組的1.66倍(圖 8), 說明草魚TRIM32能夠激活NF-κB的活性。

3 討論

3.1 草魚TRIM32的克隆及生物信息學(xué)分析

本研究成功克隆了草魚TRIM32基因的編碼區(qū)全長(zhǎng), 核苷酸序列比對(duì)分析表明與斑馬魚、鯉具有很高的同源性, 分別為87%和90%, 同時(shí)與人類、小鼠也具有較高的相似性。蛋白預(yù)測(cè)分析表明, TRIM32含有一個(gè)RING結(jié)構(gòu)域、一個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和一個(gè)SPRY結(jié)構(gòu)域。從魚類到人類的演化過程中,重要功能區(qū)域RING結(jié)構(gòu)域較為保守, 說明該基因在脊椎動(dòng)物的生命活動(dòng)中起到不可替代的重要作用[17]。這與之前的一些研究結(jié)果相似, 如人類與斑馬魚TRIM家族的基因同源性比較及進(jìn)化分析表明,該TRIM家族基因的進(jìn)化與物種進(jìn)化相一致[18]。這說明了該結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化中的保守性及生理功能的重要性。此外, 草魚TRIM32主要以點(diǎn)狀分布在細(xì)胞質(zhì)中, 細(xì)胞核中表達(dá)量較少, 這一現(xiàn)象與哺乳動(dòng)物中的報(bào)道一致[6]。

圖 6 草魚TRIM32基因在不同組織中的表達(dá)Fig.6 The relative mRNA level of TRIM32 in different tissues

圖 7 草魚TRIM32基因在不同發(fā)育時(shí)期胚胎中的表達(dá)Fig.7 Expression profile of TRIM32 during different early embryonic development stages

圖 8 TRIM32激活NF-kB的相對(duì)熒光活性Fig.8 Induction of NF-kB relative luciferase activity by TRIM32 protein

3.2 草魚TRIM32的表達(dá)分析

TRIM32在草魚的組織中廣泛分布, 在頭腎組織中的表達(dá)水平明顯高于其他組織, 表明該蛋白可能與機(jī)體的免疫功能相關(guān)。草魚在不同胚胎發(fā)育時(shí)期TRIM32的表達(dá)情況顯示, 該蛋白在整個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期均有表達(dá), 在受精卵時(shí)期、卵裂期和囊胚期的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期, 隨后表達(dá)量下降,直到出膜后表達(dá)量再次顯著性升高。因此推測(cè)胚胎在出膜之前, 由于卵膜的保護(hù)作用, 或許不需要功能性的防御系統(tǒng)[19]。TRIM32在胚胎發(fā)育早期表達(dá)水平較高, 隨著發(fā)育的進(jìn)行, 在原腸胚期下降到最低水平直到心跳期都一直保持著較低水平。這說明TRIM32在早期的高表達(dá)主要與受精卵中母性遺傳物質(zhì)存在較多有關(guān)[20]。TRIM32在出膜期表達(dá)量又顯著性升高, 并在出膜后一直保持著相對(duì)較高水平, 表明在胚胎發(fā)育早期抵抗病原體感染方面可能發(fā)揮著重要作用。

3.3 草魚TRIM32的功能探究

草魚TRIM32在EPC細(xì)胞中過表達(dá)后, 通過雙熒光素酶系統(tǒng)檢測(cè)顯示, 轉(zhuǎn)染草魚TRIM32報(bào)告基因活性是對(duì)照組的1.66倍。這說明草魚TRIM32的功能和哺乳動(dòng)物TRIM32的功能類似, 能夠激活NF-κB信號(hào)通路, 誘導(dǎo)下游的炎癥反應(yīng)[21,22]。草魚TRIM32誘導(dǎo)的數(shù)量級(jí)低于TRIM32在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中過表達(dá)的數(shù)量級(jí), Zhang等[23]在293細(xì)胞中TRIM32對(duì)NF-κB的誘導(dǎo)是對(duì)照組的9倍。在魚類研究中也有類似的報(bào)道, CgsMyD88在大鯢肌肉細(xì)胞(GSM)中的報(bào)告基因活性是對(duì)照組的1.88倍[24],明顯低于大西洋鮭魚MyD88在293細(xì)胞中的數(shù)量級(jí)[25],猜測(cè)可能由于NF-κB啟動(dòng)子的來源不同導(dǎo)致。此外, 在本實(shí)驗(yàn)中熒光的活性低于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的活性, 可能是由于魚類細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率低于哺乳動(dòng)物, 使得TRIM32的表達(dá)量較低, 從而導(dǎo)致數(shù)量級(jí)較低。

綜上所述, 本研究成功克隆了草魚TRIM32編碼區(qū)全長(zhǎng), 該序列含有TRIM家族特有的結(jié)構(gòu)特征。TRIM32的組織表達(dá)結(jié)果顯示TRIM32在頭腎組織中的表達(dá)量顯著高于其他組織; 不同胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析進(jìn)一步表明, TRIM32在受精卵時(shí)期、卵裂期和囊胚期的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期,隨后表達(dá)量下降, 直到出膜后表達(dá)量再次顯著性升高。此外, 通過雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)顯示TRIM32能夠激活NF-κB信號(hào)通路, 誘導(dǎo)下游的炎癥反應(yīng),說明草魚TRIM32在天然免疫中扮演著重要角色,但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

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THE PRELIMINARY STUDY ON CLONING, EXPRESSION PROFILES AND FUNCTION OF GRASS CARP (CTENOPHARYNGODON IDELLUS) TRIM32

JIA Lu-Lu1,2,3,4, ZENG Ling-Bing2, WANG Fang1,3,4, PENG Jun-Jie1,3,4, WANG Ye-Da1,3,4, ZHOU Yong2and LIU Xue-Qin1,3,4
(1.Department of Aquatic Animal Medicine, College of Fisheries, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2.Chinese Academy of Fishery Sciences, Yangtze River Fisheries Research Institute, Wuhan 430070, China; 3.Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center of Hubei Province, Wuhan 430070, China; 4.Hubei Provincial Engineering Laboratory for Pond Aquaculture, Wuhan 430070, China)

The TRIM family, an important member in natural immune system, regulates cell proliferation, differentiation, apoptosis, tumor suppression, antiviral activity and other processes.The TRIM32 full-length sequence of grass carp (Ctenopharyngodon idellus) was cloned by using PCR method.It was 1980 bp in length encoding 660 amino acids.The TRIM32 protein has three typical structural features of the TRIM family.Sequence analysis indicated that TRIM32 of grass carp shared the highest identity with zebrafish, which belongs to the same branch on the phylogenetic trees.Immunofluorescence and Western-blotting showed that TRIM32 successfully expressed in cytoplasmic speckles of EPC cells.Tssue distribution analysis showed that TRIM32 was widely expressed, especially in the renal tissue.TRIM32 was significantly higher in zygote period, cleavage and blastula stage than that of the other stages during different stages of embryonic development, and then decreased until hatching in which it increased significantly.In addition, grass carp TRIM32 can activate the nuclear factor NF-κB based on dual luciferase assay and induce inflammation.

TRIM32; Cloning; Eukaryotic expression; NF-κB

Q344+.1

A

1000-3207(2017)04-0741-07

10.7541/2017.92

2016-07-07;

2016-11-07

湖北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BBA234)資助 [Supported by the Science & Technology Supporting Program from Hubei Province (2015BBA234)]

賈路路(1991—), 女, 河南濮陽人; 碩士; 主要從事魚類疾病學(xué)研究。E-mail: 15527985398@163.com

劉學(xué)芹, 女, 山東煙臺(tái)人; 博士, 教授, 碩士生導(dǎo)師; 主要從事水產(chǎn)病毒致病機(jī)理與綜合防控研究。E-mail: xueqinliu@mail.hzau.edu.cn