抗生素對仔豬腸道微生物的影響

劉 穎 王海斌 周 剛 霍永久 董 麗 王海飛 包文斌 喻禮懷*

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州225000；2.太倉市金諸農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，太倉215400；3.江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，淮安223001)

抗生素對仔豬腸道微生物的影響

劉 穎1王海斌2周 剛3霍永久1董 麗1王海飛1包文斌1喻禮懷1*

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州225000；2.太倉市金諸農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，太倉215400；3.江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，淮安223001)

本研究旨在從腸道微生物的角度探究抗生素的作用機制，為今后綠色抗生素替代品添加劑的研究提供理論基礎(chǔ)和參考。試驗選用6頭30日齡的杜×長×大三元雜交去勢公豬，隨機分為2組，分別為基礎(chǔ)飼糧組(不添加抗生素)和抗生素組(基礎(chǔ)飼糧中添加0.12%復(fù)合抗生素)，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。試驗期為35 d。結(jié)果表明：抗生素組腸道微生物物種多樣性較基礎(chǔ)飼糧組更為豐富；抗生素組厚壁菌門(Firmicute)/擬桿菌門(Bacteroidetes)(F/B)比例較高，因此添加抗生素有利于仔豬體內(nèi)脂肪的貯存；從腸道微生物的角度考慮，抗生素可能是通過促進L7A_E11、Flexispira、糞球菌屬(Coprococcus)等菌屬，抑制光崗菌屬(Mitsuokella)、巨球菌屬(Megasphaera)、柔嫩菌屬(Faecalibacterium)等菌屬從而發(fā)揮預(yù)防疾病、提高成活率和促進生長的作用；使用PICRUSt進行功能預(yù)測，抗生素在脂類生物合成蛋白質(zhì)、甲烷代謝、轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄機制、RNA轉(zhuǎn)運和脂肪酸生物合成等通路中發(fā)揮了重要的作用。由此可見，抗生素可以通過調(diào)節(jié)仔豬腸道微生物，加速仔豬體內(nèi)脂肪的貯存，加速斷奶仔豬對粗纖維的降解作用，促進短鏈脂肪酸的生成，從而發(fā)揮預(yù)防疾病、提高成活率和促進生長等作用。

豬；16S rRNA；抗生素；腸道微生物

在過去的幾十年，抗生素在畜牧業(yè)中對于治療疾病、預(yù)防疾病、促進生長、提高飼料轉(zhuǎn)化效率等方面效果顯著[1-2]，對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展起到巨大的推動作用。然而近年有關(guān)抗生素的副作用，例如長期飼喂抗生素會導(dǎo)致抗生素耐藥基因、耐藥菌株的增加，抗生素在亞抑菌濃度下會調(diào)控細菌基因表達以及畜禽內(nèi)源性感染和二重感染等問題引起了人們對抗生素使用的重視[3]。美國傳染病學(xué)會(infectious disease society of America)已經(jīng)建議美國政府限制抗生素在農(nóng)業(yè)方面的使用[4]，歐盟也已經(jīng)禁止用抗生素促進動物生長[5]。然而在國內(nèi)，在現(xiàn)代以及傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)結(jié)合的生產(chǎn)方式下由抗生素帶來的成本效益，使得眾多國內(nèi)的畜牧行業(yè)不得不堅持使用抗生素。

抗生素的作用效果明顯，目前人們認(rèn)可的其抗菌機制主要是抗生素能抑制細菌胞壁合成、損害細菌胞漿膜、抑制細菌蛋白質(zhì)合成、抑制核酸合成等。有關(guān)抗生素促生長的作用機制研究也很多，F(xiàn)rancois[6]和Visek[7]認(rèn)為，抗生素可以控制動物的亞臨床感染，降低對動物生長有抑制作用的微生物代謝產(chǎn)物，降低微生物對宿主動物的養(yǎng)分競爭，使動物腸壁變薄，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收，從而促進生長。也有研究表明，抗生素可以減少胃腸道乳酸桿菌的數(shù)量從而促進動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[8]。Rosen[9]總結(jié)認(rèn)為，抗生素有可能促進有益菌的生長，從而抑制有害菌的生長。Dibner等[10]研究認(rèn)為，腸道微生物可競爭抵御致病菌和其他微生物在腸道中的定植，激活宿主腸道防御體系，對宿主既具有營養(yǎng)作用，也會與宿主爭奪營養(yǎng)物質(zhì)。因此不難看出，抗生素對腸道微生物的影響在促生長機制中占有重要地位，許多學(xué)者的研究也證明了這一點。然而目前國內(nèi)有關(guān)抗生素對腸道微生物的影響研究大多使用平板計數(shù)法，只能對極少數(shù)的微生物或者某些感興趣的微生物進行檢測。隨著PCR技術(shù)的出現(xiàn)及核酸研究技術(shù)的不斷完善，16S rRNA基因檢測技術(shù)已成為病原菌檢測和鑒定的一種強有力工具。

腸道微生物是一個龐大且動態(tài)的生態(tài)系統(tǒng)，隨著研究的深入，腸道微生物不僅可以產(chǎn)生個體生命活動中必不可少的產(chǎn)物，對病原體形成一個屏障，而且在腸道形態(tài)、免疫、消化、調(diào)控宿主基因表達方面發(fā)揮著重要的作用[11-12]。腸道微生物可以協(xié)助宿主消化代謝、合成維生素、病原體異位以及促進免疫系統(tǒng)成熟[13-14]。已經(jīng)有報導(dǎo)證實，人類疾病，如肥胖、糖尿病、腸道炎癥疾病等，都與腸道微生物的變化密切相關(guān)[15-18]。對于豬而言，腸道微生物對豬胃腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)展有重要的促進作用，同時也和腹瀉密切相關(guān)[19-20]。養(yǎng)分有效性、pH、氧化還原電位以及腸道的蠕動都會影響動物腸道微生物的組成[21]，對有益腸道微生物群的干擾是抗生素的一個潛在的作用。研究抗生素對微生物群落的影響對全面了解飼用抗生素帶來的好處和后果十分重要。因此，本文利用16S rRNA技術(shù)對比添加抗生素和不添加抗生素的仔豬腸道菌群組成，旨在從腸道微生物的角度再次探究抗生素的作用機制，為綠色抗生素替代品的研究提供理論基礎(chǔ)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設(shè)計

試驗所用抗生素為復(fù)合抗生素，即桿菌肽鋅與黏桿菌素以5∶1混合。

試驗在江蘇省江陰定山豬場進行。試驗選取6頭30日齡的杜×長×大三元雜交去勢公豬，隨機分為2組，分別為基礎(chǔ)飼糧組(不添加抗生素)和抗生素組(基礎(chǔ)飼糧中添加0.12%復(fù)合抗生素)，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。試驗期為35 d，每天08:00和16:00各飼喂1次，自由采食和飲水。每頭豬按豬場規(guī)定接種常規(guī)疫苗，豬舍每天打掃2次，定期消毒。基礎(chǔ)飼糧為粉狀配合飼料，參照NRC(2012)豬營養(yǎng)需要量配制?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)每千克預(yù)混料含 One kg of premix contained the following: VA 1 125 000 IU，VD3250 000 IU，VE 2 000 mg，VK3204 mg，VB1207 mg，VB2600 mg，VB6246 mg，VB122.5 mg，煙酸 nicotinic acid 2 475 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 1 350 mg，葉酸 folic acid 120 mg，生物素 biotin 5 mg，硫酸銅 copper sulfate 19 500 mg，硫酸亞鐵 ferrous sulfate 22 500 mg，硫酸鋅 zinc sulfate 14 145 mg，硫酸錳 manganese sulfate 4 800 mg，碘酸鈣 calcium iodate (5%) 100 mg，亞硒酸鈉 sodium selenite (1%) 33 mg，氯化鈷 cobalt chloride (1%) 5 mg。

2)營養(yǎng)水平為計算值。Nutrient levels were calculated values.

1.2 屠宰與樣品采集

在試驗的最后1天(仔豬65日齡)，將6頭試驗豬全部屠宰，打開腹腔，分離結(jié)腸，采取結(jié)腸食糜于1.5 mL滅菌凍存管，迅速置于液氮保存，用來測定微生物組成。

1.3 結(jié)腸食糜微生物區(qū)系分析

采用微生物DNA抽提試劑盒(德國，QIAGEN公司)提取100 mg樣品基因組DNA，具體步驟按說明書操作。利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度計(美國)和1%瓊脂糖凝膠電泳進行總DNA質(zhì)檢。將提取的DNA作為模板，PCR擴增16S rDNA V3～V4可變區(qū)。引物序列為上游：338F 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；下游：806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。在通用引物的5′端加上適合HiSeq2500 PE250測序的index序列和接頭序列，完成特異性引物的設(shè)計。PCR擴增體系(20 μL)：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物(5 μmol/L)各0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，DNA模板10 ng。PCR擴增條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(美國，AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物?；厥蘸螅肨hermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度計(美國)和2%瓊脂糖凝膠電泳進行文庫質(zhì)檢。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議使用Illumina MiSeq平臺進行上機測序。

測序后首先對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控得到Clean reads，用Usearch(v7.0.1090)軟件對數(shù)據(jù)進行去嵌合體和聚類的操作，Usearch聚類時，先將Reads按照豐度從大到小排序，通過97%相似度的標(biāo)準(zhǔn)聚類，得到操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)，每個OTU被認(rèn)為可代表1個物種。接下來對每個樣品的Reads進行隨機抽平處理，并提取對應(yīng)的OTU序列。然后使用Qiime軟件，做Alpha多樣性指數(shù)的稀釋曲線，根據(jù)稀釋曲線選擇合理的抽平參數(shù)，利用Qiime軟件對得到的抽平后的OTU進行分析，首先從OTU中分別提取1條Read作為代表序列，使用RDP方法，將該代表序列與16S數(shù)據(jù)庫比對，從而對每個OTU進行物種分類。歸類后，根據(jù)每個OTU中序列的條數(shù)，從而得到OTU豐度表，最后根據(jù)該OTU豐度表進行后續(xù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本研究中組間顯著性差異分析是通過統(tǒng)計學(xué)的方法檢驗2組樣品間微生物群落豐度的差異，并使用偽發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)評估差異的顯著性。從檢驗結(jié)果中，可以篩選出導(dǎo)致2組樣品組成差異的物種。本分析分別在門、綱、目、科、屬、種分類等級進行組間顯著性差異分析。使用Metastats(http://metastats.cbcb.umd.edu/)軟件或者R(v3.0.3)軟件(秩和檢驗、Fisher’s精確檢驗、卡方檢驗、t檢驗、方差檢驗)進行組間顯著性差異分析。P值校正通過R(v3.0.3)軟件包中的p.adjust進行，校正方法為“BH”(即Benjamini-CHochberg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU及其豐度分析

拼接的Clean reads經(jīng)過優(yōu)化后，在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTU，26個樣品共產(chǎn)生457個OTU，個體樣本OTU統(tǒng)計見表2，將每個樣品的OTU個數(shù)進行Venn分析，展示OTU的重疊情況，如圖1所示，基礎(chǔ)飼糧組和抗生素組共有288個OTU，抗生素組的特有OTU有145個，而基礎(chǔ)飼糧組的特有OTU只有24個。對2組中的OTU進行Alpha多樣性分析，圖2中分別描述了observed species指數(shù)、chao指數(shù)、ace指數(shù)、shannon指數(shù)以及simpson指數(shù)，抗生素組在前面4個指數(shù)中均明顯高于基礎(chǔ)飼糧組，在最后一個指數(shù)中明顯低于基礎(chǔ)飼糧組，說明抗生素組中的物種更豐富。這也再次驗證了圖1 Venn分析中，抗生素組的特有OTU更多的結(jié)果。

表2 樣品OTU統(tǒng)計

Tag數(shù)：樣品中能和OTU代表序列對比上，并且OTU具有注釋結(jié)果的Tag的總數(shù)。樣品中1,2,3：分組中的3個重復(fù)個體。

The number of Tag: some sequence of the sample can be matched with OTU representative sequences, and OTU has the annotation results, the total sum of these sequences. 1,2,3 in the sample: three repeats in the group.

圖1 OTU Venn分析

物種的多樣性包含2個方面，即樣品所含物種的豐富程度和均勻度。我們利用每個OTU在每個樣品的相對豐度，進行OTU的主成分分析(principal component analysis，PCA)。在PCA中如果2個樣品距離越近，則表示這2個樣品的組成越相似，如圖3所示，在PCA中，2組樣品很明顯的被區(qū)分開，說明2組樣品的微生物結(jié)構(gòu)及豐度明顯不同。OTU Rank曲線也說明了這個結(jié)果，如圖4所示，抗生素組3個個體的橫軸長度較基礎(chǔ)飼糧組更寬，曲線也較基礎(chǔ)飼糧組更平坦，說明抗生素樣品中物種組成越豐富，物種均勻度也越高。

盒形圖可以顯示5個統(tǒng)計量(最小值，第1個四分位數(shù)，中位數(shù)，第3個中位數(shù)和最大值，即由下到上的5條線)。

Five statistics can be displayed in the box diagram (minimum value, the first quartile, median, the third median and maximum value, they are five lines from bottom to top).

圖2 組間Alpha多樣性盒形圖

Fig.2 Alpha diversity box shape among groups

2.2 物種及其豐度分析

通過與數(shù)據(jù)庫進行比對，對OTU進行物種分類并分別在門、綱、目、科、屬、種幾個分類等級對各個樣品作物種profiling柱狀圖(圖5)，結(jié)合LEFSE分析圖(圖6)，在門水平上，2組的微生物組成結(jié)構(gòu)如圖6所示。根據(jù)測序結(jié)果，在門水平上，占主導(dǎo)作用的主要是放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍藻門(Cyanobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)及螺旋體門(Spirochaetes)等(豐度大于0.5%)?？股亟M的Spirochaetes、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、β-變形菌(Betaproteobacteria)的豐度顯著高于基礎(chǔ)飼糧組(P<0.05)，Actinobacteria和Cyanobacteria的豐度顯著低于基礎(chǔ)飼糧組(P<0.05)。其中Spirochaetes、Actinobacteria和Cyanobacteria的豐度超過0.5%。另外在抗生素組中多出了衣原體門(Chlamydiae)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和WPS-2等。在屬水平上，2組的微生物組成結(jié)構(gòu)如圖6所示，排在前5名的是普雷沃菌屬(Prevotella)、巨球型菌屬(Megasphaera)、鏈球菌屬(Streptococcus)、柔嫩菌屬(Faecalibacterium)和厭氧弧菌屬(Anaerovibrio)?？股亟M的L7A_E11、Flexispira、糞球菌屬(Coprococcus)、毛螺菌屬(Lachnospira)、Sphaerochaeta、密螺旋體屬(Treponema)、CF231、Parabacteroides、梭狀芽孢桿菌(Clostridium)、Butyricicoccus及顫螺菌屬(Oscillospira)顯著高于基礎(chǔ)飼糧組(P<0.05)，而Mitsuokella、Megasphaera、Faecalibacterium、Oribacterium、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、Collinseella及棒狀桿菌(Corynebacterium)顯著低于基礎(chǔ)飼糧組(P<0.05)。其中Faecalibacterium、巨型球?qū)?Megasphaera)、光崗菌屬(Mitsuokella)、Oribacterium、CF231、Coprococcus及Treponema的豐度超過0.5%。

圖中每個點分別表示每個樣品，不同顏色代表樣品屬于不同的分組。

Each point in the graph represents each sample, and the different colors represent the different samples.

圖3 主成分分析

Fig.3 Principal component analysis

除此之外，本研究還篩選出在其他水平上既滿足豐度大于0.5%，又在2組中差異顯著的菌種(P<0.05)，如在綱水平上只有4C0d_2在基礎(chǔ)飼糧組顯著高于抗生素組(P<0.05)；目水平上基礎(chǔ)飼糧組的標(biāo)記微生物為YS2，抗生素組為螺旋體目(Spirochaetales)；在科水平上基礎(chǔ)飼糧組的標(biāo)記微生物為韋榮球菌科(Veillonellaceae)、抗生素組為Christensenellaceae、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、RF16、S24_7、螺旋體科(Spirochaetaceae)；在種水平上基礎(chǔ)飼糧組的標(biāo)記微生物為柔嫩梭菌群(Faecalibacterium_prausnitzii)、人體普氏菌(prevotella_copri)，而抗生素組為Butyricicoccus_pullicaecorum、Coprococcus_catus、生黃瘤胃球菌(Ruminococcus_flavefaciens)。

A1:抗生素1 Antibiotic 1,A2:抗生素2 Antibiotic 2,A3:抗生素3 Antibiotic 3,B1:基礎(chǔ)飼糧1 Basic diet 1,B2:基礎(chǔ)飼糧2 Basic diet 2,B3:基礎(chǔ)飼糧3 Basic diet 3。圖5同。The same as Fig.5.

圖4 OTU Rank曲線圖

Fig.4 The graph of OTU rank

2.3 抗生素組對比基礎(chǔ)飼糧組16S功能預(yù)測

為了比較抗生素組和基礎(chǔ)飼糧組中微生物的功能，使用PICRUSt對其進行功能預(yù)測。如圖7所示，抗生素組在脂類生物合成蛋白質(zhì)、甲烷代謝、轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄機制、RNA轉(zhuǎn)運、脂肪酸生物合成等通路中發(fā)揮更大的功能。

3 討 論

3.1 抗生素對仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

腸道是一個復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，在腸道黏膜表面有大量的微生物菌群定植。動物在健康狀態(tài)下，其腸道微生物處于動態(tài)平衡狀態(tài)，這些長期定植在動物腸道的微生物作為腸道內(nèi)環(huán)境的重要組成部分而存在[22]。腸道微生物菌群通過定植腸道，增加抵抗力，幫助機體防御病原菌的入侵[23]。也可通過增強機體對病原菌的免疫應(yīng)答和阻止病原菌在腸道的附著，幫助機體免受外來病原菌感染[24]。研究證實，無菌動物比腸道內(nèi)微生物菌群正常的動物更容易遭受病原菌感染[25-27]。本研究中，腸道微生物的結(jié)構(gòu)確實因為抗生素的添加與否發(fā)生了改變，抗生素組的腸道微生物多樣性明顯高于基礎(chǔ)飼糧組。長期以來，人們一直認(rèn)為飼用抗生素的促生長作用是源于其對腸道微生物的抑制作用。從這里我們可以推測，抗生素可能是通過抑制某些有害菌，從而給更多有益菌增加了繁殖的空間，最終發(fā)揮作用。

門水平為所有物種的柱狀圖，從綱水平開始，物種豐度均高于0.5%其余全部合并成Others。

Phylum level for all species, starting from the class level, the species richness was higher than 0.5%, which less than 0.5% were all merged into Others.

圖5 樣品在不同分類水平中物種profiling柱狀圖

Fig.5 Species profiling histogram of samples in different classification level

左圖中為LEfSE聚類樹，不同顏色表示不同分組，不同顏色的節(jié)點表示在該顏色所代表的分組中起到重要作用的微生物群，一個顏色圈點代表一個biomarker(組間在豐度上存在顯著差異的物種)，中間圖例為biomarker名稱。黃色節(jié)點表示的是在不同分組中沒有起到重要作用的微生物類群。右圖為差異顯著物種集合(P<0.05)。

The left figure is LEfSE cluster tree, different colors represent different groups, and node with different colors represents the microbiota which plays an important role in the group. A color dots represents a biomarker, the middle legend is the name to biomarker. The yellow node represents microorganism that do not play an important role in different groups. The right figure is the significant different species (P<0.05).

圖6 LEFSE分析圖

Fig.6 LEFSE analysis chart

圖7 16S功能預(yù)測

本試驗結(jié)果表明，無論在何水平，熱圖的聚眾分析均將3個抗生素個體聚在一起，將3個基礎(chǔ)飼糧個體聚在一起，說明2個組內(nèi)的菌群整體不存在明顯差異，而組間差異顯著，試驗分組合理。在門水平上，無論是基礎(chǔ)飼糧組還是抗生素組腸道中的優(yōu)勢菌群都是Firmicutes和Bacteroidetes，值得關(guān)注的是Firmicutes和Bacteroidetes都是發(fā)酵多糖的主力軍，Ley等[28]和Turnbaugh等[11]比較了胖鼠和瘦鼠盲腸內(nèi)容物的菌群，Ley等[15]還比較了胖人和瘦人糞便的菌群，結(jié)果一致表明胖個體的Bacteroidetes豐度較低，而Firmicutes的豐度較高，且Firmicute/Bacteroidetes(F/B)比例在胖個體中偏高。特別是當(dāng)腸道內(nèi)F/B比例較高，宿主攝取食物中能量的能力會加強，體內(nèi)脂肪的貯存也會加劇[28]。B?ckhed等[29]用發(fā)現(xiàn)無菌鼠接種多形Bacteroidetes后其體脂肪顯著增加了23%，但增加的幅度小于接種盲腸混合微生物的(含有高比例的Bacteroidetes)，這說明Bacteroidetes有促進脂肪沉積的作用，這可能與Bacteroidetes能分解植物多糖有關(guān)，但促進脂肪沉積的效果不如Firmicutes高的細菌群體。Firmicutes與Bacteroidetes兩者可能存在一種協(xié)同的共生關(guān)系，高F/B比例可能更易促進宿主吸收/儲存能量。國內(nèi)郭秀蘭[30]也進一步證實豬脂肪沉積與腸道的Bacteroidetes及F/B比例相關(guān)，他們認(rèn)為調(diào)控腸道微生物可作為控制豬脂肪沉積的途徑之一。根據(jù)本試驗數(shù)據(jù)，抗生素組的F/B比例為2.21，基礎(chǔ)飼糧組的F/B比例為1.79，因此本研究推測添加抗生素有利于仔豬體內(nèi)脂肪的貯存。

在屬水平上，抗生素組的L7A_E11、Flexispira、Coprococcus、Lachnospira、Sphaerochaeta、Treponema、CF231、Parabacteroides、Clostridium、Butyricicoccus和Oscillospira顯著高于基礎(chǔ)飼糧組，而抗生素組的Mitsuokella、Megasphaera、Faecalibacterium、Oribacterium、Butyrivibrio、Collinseella、Corynebacterium顯著低于基礎(chǔ)飼糧組。其中Treponema、Coprococcus、Lachnospira和L7A_E11與粗飼料中果膠降解密切相關(guān)，能通過促進瘤胃微生物蛋白質(zhì)合成，進而提高動物生產(chǎn)性能[31]。Clostridium是丁酸產(chǎn)生的主要菌，微生物發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸，特別是丁酸，在維持宿主健康和疾病預(yù)防上發(fā)揮著重要的作用，它可以向宿主結(jié)腸上皮細胞提供比葡萄糖更優(yōu)化的碳源和氮源，不僅能促進腸上皮細胞的生長，加速受損腸黏膜的修復(fù)，還能生理性地調(diào)控腸上皮細胞的基因表達，有效地抑制腸炎和結(jié)腸直腸癌的發(fā)生[32]。Oscillospira是一種較難培養(yǎng)的厭氧菌，常見于草食動物腸道中[33]，姬玉嬌等[34]發(fā)現(xiàn)，Oscillospira為環(huán)江香豬結(jié)腸內(nèi)容物中的優(yōu)勢菌屬，這與其耐粗飼有很大關(guān)系。相反動植物致病性Corynebacterium會引起家畜各種器官部位的化膿性感染和小麥等農(nóng)作物的潰瘍、萎蔫疾病等[35]。因此抗生素可能是通過對部分有益菌的促進作用，抑制部分有害菌從而發(fā)揮自身的作用。

3.2 抗生素組引起的功能通路變化

本研究中用到的抗生素為桿菌肽鋅和黏桿菌素。桿菌肽鋅屬多肽類抗生素，對革蘭陽性菌具有殺菌作用，其機制主要為抑制細菌的細菌壁合成，也能與敏感細菌的細胞膜結(jié)合，損傷細胞膜的完整性，導(dǎo)致細胞內(nèi)重要物質(zhì)外流。它可以促進畜禽生長，提高飼料轉(zhuǎn)換率。黏桿菌素為抗革蘭陰性桿菌抗生素，具有殺菌作用，對大多數(shù)革蘭陰性桿菌有較強抗菌作用，桿菌肽鋅與黏桿菌素有協(xié)同抗菌作用，作用于仔豬具有預(yù)防疾病、提高成活率、促進生長的作用。本研究中，通過16S功能預(yù)測，發(fā)現(xiàn)抗生素組在脂類生物合成蛋白質(zhì)、甲烷代謝、轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄機制、RNA轉(zhuǎn)運、脂肪酸生物合成等通路中發(fā)揮更大的功能。豬肉作為人類最常見的肉類食品之一，脂肪是必不可少的組成成分，皮下脂肪也是肉品加工的重要原料，可以為人類提供必需脂肪酸，并協(xié)助脂溶性維生素和胡蘿卜素的吸收[36]。對脂類生物合成蛋白質(zhì)及脂肪酸生物合成等通路的促進作用，有益于仔豬脂肪的合成。甲烷是重要的溫室氣體，在集約化飼養(yǎng)的豬舍，豬本身的呼吸和舍內(nèi)糞便會排放大量的溫室氣體，如何科學(xué)有效地處理利用豬場糞便污水，控制環(huán)境污染和糞便管理過程中產(chǎn)生的甲烷等溫室氣體排放，已成為社會關(guān)注的問題[37]。加速甲烷氣體的代謝可能也是添加抗生素的一個潛在作用。

4 結(jié) 論

① 抗生素組腸道微生物物種多樣性較基礎(chǔ)飼糧組更豐富，且F/B比例較高，因此添加抗生素有利于仔豬體內(nèi)脂肪的貯存。

② 抗生素可能是通過增加L7A_E11、Flexispira、Coprococcus、Lachnospira、Sphaerochaeta、Treponema、CF231、Parabacteroides、Clostridium、Butyricicoccus和Oscillospira等有益菌屬，抑制Mitsuokella、Megasphaera、Faecalibacterium、Oribacterium、Butyrivibrio、Collinseella、Corynebacterium等菌屬，從而發(fā)揮預(yù)防疾病、提高成活率、促進生長的作用。

③ 通過16S功能預(yù)測，發(fā)現(xiàn)抗生素在脂類生物合成蛋白質(zhì)、甲烷代謝、轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄機制、RNA轉(zhuǎn)運和脂肪酸生物合成等通路中發(fā)揮了重要的功能。

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*Corresponding author, associate professor, E-mail: lhyu@yzu.edu.cn

(責(zé)任編輯 武海龍)

Effects of Antibiotics on Intestinal Microorganisms of Piglets

LIU Ying1WANG Haibin2ZHOU Gang3HUO Yongjiu1DONG Li1WANG Haifei1BAO Wenbin1YU Lihuai1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity,Yangzhou225000,China; 2.TaicangJinChuAgriculturalDevelopmentCo.,Ltd.,Taicang215400,China; 3.HuaiyinAgriculturalScienceResearchInstituteofJiangsuXuhuaiRegion,Huai’an223001,China)

The experiment was aimed to explore the mechanism of antibiotics from the perspective of intestinal microbes, and to provide theoretical basis and reference for the future research of green antibiotic alternative. Six Duroc×Landrace×Yorkshire crossbred castrated boars pigs at 30 days of age were selected, and randomly divided into two groups: basal diet group (without antibiotic) and antibiotic group (basal diet supplemented with 0.12% compound antibiotics), each group contained 3 replicates and 1 pigs in each replicate. The experimental lasted for 35 days. The results showed that the intestinal microbial species diversity of antibiotic group was more than that of the basal diet group; the ratio of Firmicute/Bacteroidetes (F/B) of antibiotic group was higher than basal diet group, therefore, the addition of antibiotics was conducive to the storage of fat in piglets; from the perspective of intestinal microflora, antibiotics may through promotingL7A_E11,FlexispiraandCoprococcus, etc and inhibitingMitsuokella,MegasphaeraandFaecalibacterium, etc to prevent disease, improve survival rate and promote growth; using PICRUSt to predict the function, antibiotic played an important role in lipid biosynthesis protein, methane metabolism, transport protein, transcription factor, transcription mechanism, RNA transport, fatty acid biosynthesis and other pass way. In conclusion, antibiotics can through regulate intestinal microflora of piglets to accelerate fat storage, accelerate the degradation of coarse fiber in piglets, promote the production of short chain fatty acids, and ultimately help to prevent disease, improve survival rate and promote growth.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(8)：2912-2922]

pigs; 16S rRNA; antibiotic; intestinal microbes

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.08.036

2017-02-10

江蘇省普通高校學(xué)術(shù)研究生科研創(chuàng)新計劃項目(KYZZ16_0495)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目(CX(16)1003)；江蘇省蘇北科技專項(BN2016078，BN2016095)

劉 穎(1990—)，女，江蘇淮安人，博士研究生，研究方向為動物遺傳育種與繁殖。E-mail： yddkly@163.com

*通信作者:喻禮懷，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail： lhyu@yzu.edu.cn

S828

A

1006-267X(2017)08-2912-11