脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與玉米赤霉烯酮聯(lián)合暴露對體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的影響

任志華 王亞超 鄧俊良*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都611130；2.西南科技大學，綿陽621010)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與玉米赤霉烯酮聯(lián)合暴露對體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的影響

任志華1王亞超2鄧俊良1*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都611130；2.西南科技大學，綿陽621010)

本試驗旨在研究脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)與玉米赤霉烯酮與(ZEA)聯(lián)合暴露對體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的影響。分別以0.012 50 μg/mL DON+0.006 25 μg/mL ZEA、0.050 μg/mL DON+0.025 μg/mL ZEA、0.2 μg/mL DON+0.1 μg/mL ZEA、0.8 μg/mL DON+0.4 μg/mL ZEA對體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞進行聯(lián)合暴露培養(yǎng)，48 h后測定細胞膜ATP酶(Ca2+-ATP酶、Na+/K+-ATP酶)活性以及細胞內(nèi)pH、Ca2+水平和鈣調(diào)蛋白(CaM)的mRNA表達水平。同時設(shè)不添加毒素的空白對照組。結(jié)果表明：添加毒素的各試驗組間，細胞內(nèi)Ca2+水平、CaMmRNA表達水平隨毒素濃度的升高而增加，且添加毒素的各試驗組均顯著或極顯著高于空白對照組(P<0.05或P<0.01)。細胞內(nèi)pH以及細胞膜Ca2+-ATP酶與Na+/K+-ATP酶活性均隨毒素濃度的升高而降低，且添加毒素的各試驗組均顯著或極顯著低于空白對照組(P<0.05或P<0.01)。由此得出，DON、ZEA聯(lián)合暴露導致體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞內(nèi)酸化、離子平衡失調(diào)等一系列細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，且呈劑量依賴性。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；玉米赤霉烯酮；聯(lián)合暴露；脾臟淋巴細胞；內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)和玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)是飼料中2種最常見的霉菌毒素。霉菌毒素不僅會使動物生長性能、繁殖性能下降，還會造成免疫抑制，引起疾病高發(fā)。細胞是生物體的基本單位，細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定是維持細胞正常功能的必要條件[1]。當細胞內(nèi)環(huán)境失調(diào)時，就會出現(xiàn)糖類、脂類、蛋白質(zhì)三大物質(zhì)代謝紊亂，基因表達復(fù)制異常，蛋白質(zhì)合成異常，細胞結(jié)構(gòu)、功能異常[1]。脾臟是機體重要的免疫器官，體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞已成為重要的研究模型[2-3]。在前期的預(yù)試驗中我們發(fā)現(xiàn)DON與ZEA聯(lián)合暴露會導致體外培養(yǎng)雞淋巴細胞的凋亡(數(shù)據(jù)未列出)。在細胞凋亡過程中，多伴隨細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，其中細胞內(nèi)氧化還原、酸堿度與離子濃度平衡狀態(tài)失調(diào)既是細胞凋亡的特征，又在一定程度上促進細胞凋亡[4]。我們的前期研究表明單獨染毒DON[5]或ZEA[6]均可導致雞體外脾臟淋巴細胞內(nèi)環(huán)境失衡，進而引起細胞凋亡，但兩者聯(lián)合暴露對體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)影響的研究報道較少。本研究以原代培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞為模型，重點研究DON與ZEA聯(lián)合暴露后細胞膜ATP酶(Ca2+-ATP酶、Na+/K+-ATP酶)活性及細胞內(nèi)Ca2+水平、pH及鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)mRNA表達水平變化，為闡明DON與ZEA聯(lián)合暴露致細胞凋亡的機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

胎牛血清(FBS)(美國Gibco)，DON、ZEA及無酚紅的RPMI1640培養(yǎng)基(美國Sigma)，細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)(日本Dojindo)，細胞內(nèi)pH熒光探針BCECF-AM染液(日本Dojindo)，細胞內(nèi)鈣離子熒光探針Fluo-3/AM染液(美國Molecular Probes)，活化Taq酶等PCR反應(yīng)試劑(日本TaKaRa)，Trizol試劑盒、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國Invitrogen)，溴化乙錠(EB)(美國Sigma)，聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)(美國Sigma)，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液(美國Sigma)，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)測定試劑盒(Lorry法)、細胞膜ATP酶(Ca2+-ATP酶與Na+/K+-ATP酶)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 試驗方法

脾臟淋巴細胞懸液的制備：在無菌條件下，將由東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院動物中心提供的40～60日齡健康的伊莎公雞的脾臟取出，放入盛有磷酸鹽緩沖液(PBS)的培養(yǎng)皿里，用PBS輕輕洗滌脾臟周圍的血液殘渣，仔細剝?nèi)テ⑴K周圍的結(jié)締組織，將其移入另一個盛有PBS的浸泡有200目網(wǎng)篩的培養(yǎng)皿中，用鑷子將脾臟放在200目銅網(wǎng)上，用20 mL一次性注射器的內(nèi)芯輕輕研磨，過濾，將濾液適當稀釋成一定濃度的細胞懸液，再將細胞懸液移入預(yù)先裝有雞淋巴分離液的離心管里，立即緩緩以1∶1體積比將細胞懸液移入到雞淋巴分離液上層，室溫下2 000 r/min離心15 min，用巴氏吸管移取淋巴細胞，加入冷的PBS洗滌，4 ℃下1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，加入不含毒素的RPMI1640完全培養(yǎng)液(加胎牛血清)再洗滌1次，重懸，制備5×106細胞/mL的細胞懸液，并用臺盼藍檢測細胞活力大于95%即表明脾臟淋巴細胞懸液制備成功。

DON與ZEA聯(lián)合暴露濃度的確定：本試驗應(yīng)用CCK-8法分別檢測了DON、ZEA對體外培養(yǎng)的雞脾臟淋巴細胞的活性的影響。染毒48 h時，DON的半數(shù)抑制濃度(IC50)為(30.82±10.48) μg/mL，ZEA的IC50為(23.91±4.96) μg/mL。通過IC50，篩選出DON、ZEA單獨的作用濃度，由于在前期預(yù)試驗中DON、ZEA單獨染毒時高濃度組均造成脾臟淋巴細胞的嚴重損傷。因此，在正式試驗中以DON、ZEA低濃度進行聯(lián)合暴露，即確定聯(lián)合暴露劑量為0.012 50 μg/mL DON+0.006 25 μg/mL ZEA(DZ-1組)、0.050 μg/mL DON+0.025 μg/mL ZEA(DZ-2組)、0.2 μg/mL DON+0.1 μg/mL ZEA(DZ-3組)、0.8 μg/mL DON+0.4 μg/mL ZEA(DZ-4組)。同時設(shè)不添加毒素的空白對照組。

1.3 細胞內(nèi)Ca2+水平測定

染毒培養(yǎng)48 h后，收集細胞，1 500 r/min離心3 min，后用PBS洗滌細胞3次。用PBS懸浮細胞，加入細胞內(nèi)鈣離子熒光探針Fluo-3/AM染液使其終濃度為1 μmol/L，混勻，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌3次，在流式細胞儀上測定其平均熒光強度(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm)。

1.4 細胞內(nèi)pH測定

染毒培養(yǎng)48 h后，收集細胞，1 500 r/min離心3 min，后用PBS洗滌細胞3次。在收集的細胞中加入不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，制備5×106細胞/mL的細胞懸液，加入細胞內(nèi)pH熒光探針BCECF/AM染液，使其終濃度為2 μmol/L；然后在CO2培養(yǎng)箱(避光，37 ℃)中孵育30 min。收集細胞，用不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3次，再用PBS重懸細胞，在流式細胞儀上488 nm激發(fā)，相應(yīng)的細胞內(nèi)pH根據(jù)其熒光強度大小顯示于一個二維點陣圖上(X軸525 nm，Y軸610 nm)上。根據(jù)標準曲線結(jié)果，細胞內(nèi)pH即為綠/與紅熒光強度的比值，每個樣本至少選用10 000個細胞進行統(tǒng)計分析[7]。

1.5 細胞膜Ca2+-ATP酶與Na+/K+-ATP酶活性測定

染毒培養(yǎng)48 h后，收集細胞，1 500 r/min離心3 min，后用PBS洗滌細胞3次。每個樣品中加入500 μL含0.1% TritonX-100的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)后，進行超聲裂解(4 ℃)。將裂解液1 000×g離心10 min，取其上清液進行蛋白質(zhì)定量，并用生理鹽水(無磷)適當稀釋使其蛋白質(zhì)含量控制于3～5 mg/mL。取裂解上清液測定其細胞膜Na+/K+-ATP酶與Ca2+-ATP酶活性(定磷法)，詳細測定方法見試劑盒說明書。

1.6 細胞內(nèi)CaMmRNA的測定

應(yīng)用Trizol法提取雞脾臟淋巴細胞總RNA，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank中公布的雞的β-肌動蛋白(β-actin)(L08165)和CaM(NM205005)的全基因序列，應(yīng)用Prime 5.0軟件設(shè)計特異的上、下游引物，并經(jīng)GenBank Blast進行同源性檢索后由Invitrogen公司(上海)合成。引物序列及參數(shù)見表1。按cDNA模板的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系進行加樣(30 μL)：10 μL總RNA，1 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，1 μL RNA酶抑制劑，4 μL dNTP，2 μL Oligo dT，4 μL DTT和8 μL 5×Buffer。按反轉(zhuǎn)錄程序進行，具體如下：42 ℃，反應(yīng)30 min，99 ℃滅活5 min，5 ℃ 5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物瞬時離心，保存在-20 ℃?zhèn)溆?。通過Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR，反應(yīng)條件為：活化Taq酶 95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，擴增40個循環(huán)。

表1 CaM和β-actin基因的引物序列及參數(shù)

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用REST 2009軟件分析毒素處理樣品各目的基因mRNA表達水平的差異。

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性F檢驗及其相關(guān)性分析，各指標的測定均重復(fù)3個不同批次的細胞，每批細胞每個組重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 DON、ZEA聯(lián)合暴露對體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞內(nèi)Ca2+水平的影響

由表2可知，DON、ZEA聯(lián)合暴露48 h后，雞脾臟淋巴細胞內(nèi)Ca2+水平隨毒素濃度的升高而增加，各試驗組均極顯著高于空白對照組(P<0.01)，除DZ-2與DZ-3組間沒有顯著差異(P>0.05)外，其余各試驗組間差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)。由此表明，DON、ZEA聯(lián)合暴露可導致體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞內(nèi)Ca2+水平隨毒素濃度的升高而增加，具有顯著的劑量依賴關(guān)系。

2.2 DON、ZEA聯(lián)合暴露對體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞內(nèi)pH的影響

由表2可知，DON、ZEA聯(lián)合暴露48 h后，雞

脾臟淋巴細胞內(nèi)pH隨毒素濃度的升高而逐漸降低，各試驗組均顯著或極顯著低于空白對照組(P<0.05或P<0.01)，同時各試驗組間差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)。由此表明，DON、ZEA聯(lián)合暴露可導致雞脾臟淋巴細胞內(nèi)pH隨毒素濃度的升高而降低，具有顯著的劑量依賴關(guān)系。

2.3 DON、ZEA聯(lián)合暴露對體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞內(nèi)CaMmRNA表達水平的影響

由表2可知，DON、ZEA聯(lián)合暴露48 h后，除DZ-1組雞脾臟淋巴細胞內(nèi)CaMmRNA表達水平較空白對照組稍有降低(P>0.05)外，其余試驗組均較空白對照組顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。各試驗組間，雞脾臟淋巴細胞內(nèi)CaMmRNA表達水平隨著毒素濃度的升高而升高，除DZ-1與DZ-2組差異不顯著(P>0.05)外，其余各試驗組間差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)。由此表明，DON、ZEA聯(lián)合暴露可導致體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞內(nèi)CaMmRNA表達水平隨毒素濃度的升高而增加(除DZ-1組低于空白對照組)，具有顯著的劑量依賴關(guān)系。

表2 DON、ZEA聯(lián)合暴露對體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞內(nèi)Ca2+水平、pH及CaM mRNA表達水平的影響

同列數(shù)據(jù)上標有不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same column, values with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01), and with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.4 DON、ZEA聯(lián)合暴露對體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞膜ATP酶活性的影響

由表3可知，DON、ZEA聯(lián)合暴露48 h后，雞脾臟淋巴細胞膜Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性均隨毒素濃度的升高而逐漸降低，各試驗組均極顯著低于空白對照組(P<0.01)，同時各試驗組間除DZ-3與DZ-4組差異顯著(P<0.05)外，其余試驗組間差異均極顯著(P<0.01)。由此表明，DON、ZEA聯(lián)合暴露可導致體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞膜ATP酶活性隨毒素濃度的升高而降低，具有顯著的劑量依賴關(guān)系。隨毒素濃度的升高，Ca2+-ATP酶活性下降比Na+/K+-ATP酶活性下降明顯，表明Ca2+-ATP酶對DON、ZEA更敏感。

表3 DON、ZEA聯(lián)合暴露對體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞膜ATP酶活性的影響

3 討 論

Tonshin等[8]研究表明，DON對小鼠肝臟線粒體內(nèi)進行了氧化磷酸化，引起了線粒體的膜電位、H+、K+及其他離子水平的變化，線粒體腫脹，K+滲透性增強，Ca2+也流出，損害了線粒體膜的功能，造成鈣穩(wěn)態(tài)失衡。彭雙清等[9]的研究表明，DON對體外培養(yǎng)的人心肌細胞B、L、T三型Ca2+通道均有明顯的阻滯作用，減少三型Ca2+通道的開放概率，縮短開放時間，延長關(guān)閉時間。上述研究結(jié)果說明DON能夠?qū)е滦∈蟾渭毎叭诵募〖毎麅?nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)失衡，干擾與Ca2+相關(guān)的信號傳導，導致細胞功能障礙。而細胞內(nèi)Ca2+超載在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，細胞內(nèi)Ca2+超載主要通過激活Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶和激活Ca2+/CaM依賴性相關(guān)酶活性而誘導細胞凋亡[10]。細胞內(nèi)Ca2+超載與線粒體功能關(guān)系密切，一方面，線粒體作為細胞內(nèi)鈣存儲器而在細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定過程中發(fā)揮重要作用[11]，線粒體功能受損所引起的ATP水平降低直接介導細胞內(nèi)Ca2+水平增加[12]；另一方面，細胞內(nèi)Ca2+超載可以促進線粒體氧化磷酸化解耦聯(lián)與線粒體通透性轉(zhuǎn)移孔的開放，這將導致氧化磷酸化作用的抑制、質(zhì)子動力勢降低、線粒體腫脹、線粒體內(nèi)Ca2+釋放進入胞漿而促進細胞死亡[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，DON、ZEA聯(lián)合暴露導致體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞內(nèi)Ca2+超載，造成線粒體功能障礙，這可能是DON、ZEA導致雞脾臟淋巴細胞發(fā)生凋亡的一條重要機制，這與Busk等[14]應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學分析ZEA對人的腎上腺皮質(zhì)細胞株H295R的影響時發(fā)現(xiàn)ZEA影響氧化磷酸化途徑和線粒體功能障礙的途徑相一致。

細胞內(nèi)Ca2+水平是由多種因素所調(diào)控的，除線粒體對細胞內(nèi)Ca2+水平的調(diào)控作用外，細胞膜Na+/K+-ATP酶與Ca2+-ATP酶在細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用，它們主要參與將胞漿內(nèi)游離Ca2+跨越細胞膜轉(zhuǎn)移到細胞外液過程，同時還參與其他離子轉(zhuǎn)運及ATP合成；若二者活性降低，將導致胞漿內(nèi)Ca2+超載[15]，而CaM是真核細胞內(nèi)Ca2+的重要受體，通過傳遞Ca2+調(diào)節(jié)細胞功能的各種信息。當細胞內(nèi)Ca2+達到一定水平(>10 μmol/L)時，Ca2+便與CaM結(jié)合，使CaM活化，被活化的CaM再去激活Ca2+-ATP酶，使細胞質(zhì)內(nèi)維持較低水平的鈣，行駛第二信使的功能[16]。本研究結(jié)果表明，不同劑量的DON、ZEA聯(lián)合暴露均可使雞脾臟淋巴細胞膜Na+/K+-ATP酶與Ca2+-ATP酶活性顯著或極顯著降低，這可能是細胞內(nèi)Ca2+超載的原因之一。Na+/K+-ATP酶與Ca2+-ATP酶均為ATP依賴性酶，細胞內(nèi)充足的ATP對于維持二者的功能很必要，線粒體呼吸功能抑制而導致的細胞內(nèi)ATP水平降低將會導致Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性受到抑制[17]。本研究中2種ATP酶活性的降低可能是由于DON、ZEA對細胞膜的氧化損傷和對細胞內(nèi)能量代謝的干擾[18]。本試驗中，各試驗組體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞內(nèi)CaMmRNA表達水平顯著或極顯著高于空白對照組，說明DON、ZEA可通過影響胞內(nèi)鈣池釋放Ca2+，使細胞內(nèi)Ca2+水平升高，Ca2+便與CaM結(jié)合，使CaM活化，被活化的CaM再去激活Ca2+-ATP酶，使細胞質(zhì)內(nèi)維持較低的Ca2+水平，而Ca2+-ATP酶活性降低，不能將進入細胞內(nèi)的Ca2+及時排出，從而呈現(xiàn)胞內(nèi)Ca2+的超載，這可能是雞脾臟淋巴細胞發(fā)生凋亡的一條重要機制。

細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定是維持細胞正常功能的必要條件，細胞膜Ca2+-ATP酶，它分解1個ATP分子可將1～2個Ca2+跨膜轉(zhuǎn)移到胞外，同時以1∶2比例將H+轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)，使離子交換結(jié)果為電中性，質(zhì)膜兩側(cè)膜電位差不致影響Ca2+的轉(zhuǎn)運，細胞膜特別是質(zhì)膜的Na+/Ca2+交換，已被認為是鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過程中的一個重要組分，而酸堿平衡的調(diào)節(jié)則是內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的前提。細胞內(nèi)pH的調(diào)節(jié)是通過離子轉(zhuǎn)運機制以及胞漿強大的緩沖能力來完成的，這種離子轉(zhuǎn)運機制包括：Na+/H+對流、ATP驅(qū)動的H+泵以及幾種碳酸氫鹽交換器，而Na+/H+對流在細胞調(diào)控pH中起主要作用[19]。細胞內(nèi)酸化程度與細胞凋亡發(fā)生率存在量效關(guān)系，研究表明，細胞內(nèi)pH變化直接參與線粒體介導的細胞凋亡，而胞內(nèi)酸化可以促進細胞色素c介導的半胱天冬酶的激活[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，DON、ZEA聯(lián)合暴露可引起體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞內(nèi)pH降低，因此，可以認為DON、ZEA所致的線粒體膜功能受損是胞內(nèi)酸化的主要原因，而胞內(nèi)酸化又進一步促進細胞凋亡。

4 結(jié) 論

DON、ZEA聯(lián)合暴露導致體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，主要包括細胞內(nèi)Ca2+超載(上調(diào)細胞內(nèi)CaMmRNA表達、增加細胞內(nèi)Ca2+水平)、胞內(nèi)酸化、細胞膜ATP酶(Na+/K+-ATP酶與Ca2+-ATP酶)活性降低。

致謝：

感謝東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院徐世文教授、李艷飛教授、李金龍教授、王偉老師、張志剛老師、張子威博士、蘇健碩士、張博碩士、關(guān)博碩士在試驗期間給予的幫助。

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*Corresponding author, professor, E-mail: dengjl213@126.com

(責任編輯 菅景穎)

Effects of Combined Exposure to Deoxynivalenol and Zearalenone on Homeostasis of Chicken Splenic Lymphocytes CulturedinVitro

REN Zhihua1WANG Yachao2DENG Junliang1*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China; 2.SouthwestUniversityofScienceandTechnology,Mianyang621010,China)

The aim of this experiment was conducted to study the effects of combined exposure to deoxynivalenol (DON) and zearalenone (ZEA) on the homeostasis of chicken splenic lymphocytes culturedinvitro. The chicken splenic lymphocytes were culturedinvitrowith different doses of DON and ZEA in cultured fluid, and the combined exposure doses were DON 0.012 50 μg/mL and ZEA 0.006 25 μg/mL, DON 0.050 μg/mL and ZEA 0.025 μg/mL, DON 0.2 μg/mL and ZEA 0.1 μg/mL, DON 0.8 μg/mL and ZEA 0.4 μg/mL, individually. After cultured 48 hours, the activities of cellular membrane ATPases (Ca2+-ATPase and Na+/K+-ATPase), and the intracellular Ca2+level, pH and calmodulin (CaM) mRNA expression level in chicken splenic lymphocytes were determined. And the blank contrast group was set separately. The results showed as follows: the intracellular Ca2+level andCaMmRNA expression level in the treated groups were increased with the increase of toxin concentration, which were significantly or extremely significantly higher than those in the blank control group (P<0.05 orP<0.01). The intracellular pH and the activities of cellular membrane Ca2+-ATPase and Na+/K+-ATPase in the treated groups were decreased with the increase of toxin concentration, which were significantly or extremely significantly lower than those in the control group (P<0.05 orP<0.01). In conclusion, combined exposure to DON and ZEA can lead to a series of intracellular homeostasis, such as intracellular acidification and imbalance of ion homeostasis, which is dose dependent.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(8)：2836-2842]

DON; ZEA; combined exposure; splenic lymphocyte; homeostasis

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.08.028

2017-01-24

國家自然科學基金項目(31402269)

任志華(1982—)，女，河南開封人，副教授，博士，從事動物中毒病研究。E-mail: zhihua_ren@126.com

*通信作者:鄧俊良，教授，博士生導師，E-mail: dengjl213@126.com

S859.87

A

1006-267X(2017)08-2836-07