不同水平肌醇對獺兔皮膚中β-連環(huán)蛋白和激素敏感脂酶表達的影響

李 敏 崔亞利* 王丙雷 陳寶江

(1.河北農業(yè)大學動物醫(yī)學院，保定071000；2.河北農業(yè)大學動物科技學院，保定071000)

不同水平肌醇對獺兔皮膚中β-連環(huán)蛋白和激素敏感脂酶表達的影響

李 敏1崔亞利1*王丙雷1陳寶江2*

(1.河北農業(yè)大學動物醫(yī)學院，保定071000；2.河北農業(yè)大學動物科技學院，保定071000)

本試驗旨在研究飼糧中添加不同水平的肌醇對獺兔皮膚中β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和激素敏感脂酶(HSL)表達的影響。選取(40±1)日齡的同期斷奶獺兔120只(公母各占1/2)，隨機分成4組，每組30只。在4組獺兔的飼糧中分別添加0、25、50、75 mg/kg的肌醇，試驗期為3個月。在試驗的第30天(2月齡)、第60天(3月齡)和第90天(4月齡)，分別取腹部、背中部、臀部皮膚，采用免疫組織化學和蛋白質印跡(Western blot)法對β-catenin和HSL的蛋白質表達和定位進行檢測。結果表明：β-catenin在毛囊中廣泛表達，在毛根鞘細胞和毛乳頭均有棕黃色陽性反應細胞。HSL在毛根鞘細胞，尤其是在內根鞘細胞內，呈現(xiàn)非常明顯的棕黑色強陽性表達。飼糧中添加50 mg/kg肌醇可以極顯著增加2～4月齡獺兔背中部皮膚毛囊中β-catenin和HSL陽性表達細胞的平均灰度值(P<0.01)，極顯著增加4月齡獺兔背中部、腹部和臀部皮膚毛囊中β-catenin和HSL陽性表達細胞的平均灰度值(P<0.01)。結果提示，肌醇能夠通過上調4月齡獺兔毛囊中β-catenin和HSL的表達來促進毛囊的發(fā)育，在本試驗中，飼糧肌醇水平達到50 mg/kg時效果最佳。

肌醇；獺兔；毛囊；β-連環(huán)蛋白；激素敏感脂酶

肌醇(環(huán)己醇)廣泛分布于各種天然動植物及微生物的組織中[1]，主要在動物的肝臟、腎臟、大腦和睪丸[2-3]等部位合成，具有生物素與維生素B的類似作用，作為體內活性組織的組成部分發(fā)揮多種生理功能[4]，如促進細胞生長，參與蛋白質的生物合成；促進肝臟脂肪代謝，降低血液中膽固醇含量；作為細胞膜的組成成分之一，在膜磷脂平衡中扮演著重要的角色[5]；促進健康毛發(fā)的生長，防止脫發(fā)等。在食品工業(yè)中肌醇常作為營養(yǎng)強化劑被推廣使用，但是肌醇在毛用動物飼糧中的應用研究很少。

毛囊是一種形態(tài)和結構較為復雜的皮膚附屬結構[6]，它呈周期性地控制著毛發(fā)的生長，決定著動物被毛的品質和產量。毛囊的發(fā)育過程受到多種信號分子的調節(jié)，其中Wnt途徑是最關鍵的信號通路[7]。而作為Wnt信號途徑中下游成員之一的β-連環(huán)蛋白(β-catenin)，是Wnt信號途徑的中心環(huán)節(jié)，對毛囊細胞的生長、分化、運動、凋亡的調節(jié)都具有重要的作用[8]。

肌醇有促進脂肪代謝的作用，而表皮Wnt/β-catenin作為信號級聯(lián)反應中關鍵的啟動因子能夠誘導脂肪生成，表皮Wnt信號在脂肪細胞分化和被毛的生長周期同步化中具有重要作用[9]。雖然穆國柱等[10]對飼糧中添加脂肪對獺兔皮毛質量的影響進行了研究，但是探討脂肪沉積影響因素對毛囊發(fā)育影響的研究卻很少。激素敏感脂酶(HSL)是脂肪分解的限速酶[11]，也是影響動物脂肪沉積的關鍵酶之一。因此，本試驗通過在飼糧中添加不同水平的肌醇，研究其對毛囊中β-catenin和HSL表達的影響，以探討肌醇影響毛囊發(fā)育的可能機制，為肌醇在毛皮動物生產中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物選擇和分組

選取同期斷奶的(40±1)日齡獺兔120只(公母各占1/2)，隨機分為4組，每組30只，每籠3只，常規(guī)飼養(yǎng)，預試期7 d，正試期為3個月。對照組和試驗1組、試驗2組、試驗3組獺兔分別飼喂在基礎飼糧中添加0、25、50、75 mg/kg肌醇的試驗飼糧?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。所有試驗飼料均制成直徑為2.5 mm的顆粒飼料。

1.2 樣品的采集

分別在試驗開始后的第30天(2月齡)、第60天(3月齡)、第90天(4月齡)，每組隨機各選取6只健康獺兔，頸靜脈放血處死，去除預定部位的被毛后，分別取腹部、背中部和臀部皮膚(各約1 cm2)，一部分展平并貼附在吸水紙(防止皮樣卷曲)上后，固定于多聚甲醛中，用于免疫組織化學分析；另一部分包裹于錫箔紙(180 ℃烘烤5 h)中，放于-80 ℃冰箱中凍存，用于組織蛋白質的提取。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平

1)預混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of the diet:Fe (as ferric sulfate) 70 mg，Cu (as copper sulfate) 20 mg，Zn (as zinc sulfate) 70 mg，Mn (as manganese sulfate) 10 mg，Co 0.15 mg，I 0.2 mg，Se (as sodium sulfate) 0.25 mg，VA 10 000 IU，VD 900 IU，VE 50 mg，VK 2 mg，硫胺素 thiamine 2 mg，核黃素 riboflavin 6 mg，泛酸 pantothenic acid 50 mg，吡哆醇 pyridoxine 2 mg，VB120.02 mg，煙酸 niacin 50 mg，膽堿 choline 1 000 mg，生物素 biotin 0.2 mg。

2)消化能為計算值，其他為實測值。DE was a calculated value，while the others were measured values.

1.3 試驗試劑

鼠抗人HSL抗體購自Santa公司，鼠抗人β-catenin抗體購自CST公司，鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)免疫組化染色試劑盒和濃縮型二氨基聯(lián)苯胺(3,3-N-diaminobenzidine tertrahydrochloride,DBA)顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，蛋白質抽提試劑盒和蛋白質Marker均購自CWBIO公司，硝酸纖維素膜(NC膜)購自Millipore公司。

1.4 皮膚組織的β-catenin和HSL的免疫組織化學染色

將皮膚切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫(H2O2)室溫作用10 min以滅活內源性酶，蒸餾水洗2 min×3次；將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，電爐加熱至沸騰后斷電，間隔10 min后再重復1次，冷卻后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2 min×2次；滴加5%的牛血清白蛋白(BSA)封閉液，室溫作用20 min；甩去多余液體，滴加1∶50稀釋的一抗(鼠抗人β-catenin/HSL)，4 ℃過夜；室溫放置1 h，PBS沖洗2 min×3次；滴加生物素化山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)，37 ℃作用20 min，PBS沖洗2 min×3次；滴加試劑SABC，37 ℃作用20 min，PBS沖洗5 min×4次；DAB顯色10 min，蒸餾水洗滌2 min×2次，蘇木精輕度復染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。PBS代替一抗作為陰性對照。

用ImageJ軟件對β-catenin和HSL在各組皮膚中的免疫組化染色結果進行測定，每個獺兔皮膚組織分別取3張切片，每張切片取3個視野，對每張圖片進行8位灰階、反向處理后測得其陽性表達細胞的平均灰度值。

1.5 皮膚組織中β-catenin和HSL的蛋白質印跡(Western blot)

取出液氮中凍存的獺兔皮膚組織，用預冷的蛋白質抽提試劑盒提取獺兔皮膚組織中的總蛋白，每孔上樣20 μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕轉法轉至NC膜，轉膜1 h。將膜完全浸沒3%BSA-TBST中室溫輕搖30 min,加入一抗(用3%BSA-TBST稀釋，1∶500)，室溫孵育10 min，放4 ℃過夜。室溫孵育30 min，TBST洗膜，3 min×5次。用5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗[山羊抗小鼠IgG(H+L)辣根過氧化物酶(HRP)，1∶10 000]，室溫輕搖40 min。TBST洗膜3 min×6次。ECL加到膜上后反應3～5 min，膠片曝光，顯影2 min，定影。內參蛋白抗體使用鼠抗人β-肌動蛋白(β-actin)抗體，以1∶5 000的比例進行稀釋。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0進行描述性統(tǒng)計與方差分析，結果用“平均值±標準差”來表示。

2 結 果

2.1 β-catenin在皮膚毛囊中的定位表達

免疫組織化學染色結果顯示，β-catenin在毛囊中廣泛表達，在毛根鞘細胞和毛乳頭均有棕黃色陽性反應細胞(圖1)。

A、B、C、D分別代表對照組、試驗1組、試驗2組、試驗3組。a，b所示為毛根鞘，c所示為毛根鞘和毛乳頭。圖中標尺長度為50 μm。

A, B, C and D showed control group, experimental group 1, experimental group 2 and experimental group 3, respectively. a, b represented root sheath, and c represented root sheath and dermal papilla. Scale length in figure was 50 μm.

圖1 4月齡獺兔背中部皮膚組織β-catenin免疫組化染色結果

Fig.1 The results of β-catenin in the dorsocentral region skin from 4-month-old Rex rabbits showed by immunohistochemical staining

如表2所示，2月齡獺兔β-catenin陽性表達細胞的平均灰度值，在背中部皮膚中試驗1組與試驗2組較對照組均極顯著增加(P<0.01)；在腹部皮膚中試驗2組和試驗3組極顯著低于對照組(P<0.01)；在臀部皮膚中各試驗組均極顯著低于對照組(P<0.01)。3月齡獺兔β-catenin陽性表達細胞的平均灰度值，在背中部與腹部皮膚中各試驗組較對照組均極顯著增加(P<0.01)；在臀部皮膚中各試驗組較對照組均極顯著降低(P<0.01)。4月齡獺兔β-catenin陽性表達細胞的平均灰度值，在背中部皮膚中各試驗組均極顯著高于對照組(P<0.01)；在腹部皮膚中試驗2組和試驗3組均極顯著高于對照組(P<0.01)，試驗1組則極顯著低于對照組(P<0.01)；在臀部皮膚中試驗2組和試驗3組均極顯著高于對照組(P<0.01)。

表2 皮膚毛囊組織中β-catenin陽性表達細胞的平均灰度值

同行數(shù)據(jù)肩標相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

2.2 HSL在皮膚毛囊中的定位表達

免疫組織化學染色結果顯示，毛根鞘細胞呈現(xiàn)棕黃色的HSL陽性表達(圖2)，尤其是在內根鞘細胞內，HSL呈現(xiàn)非常明顯的棕黑色強陽性表達。

由表3得出，2月齡獺兔HSL陽性表達細胞的平均灰度值，在背中部皮膚中試驗1組和試驗2組極顯著高于對照組(P<0.01)，試驗3組極顯著低于對照組(P<0.01)；在腹部皮膚中試驗2組和試驗3組極顯著低于對照組(P<0.01)；在臀部皮膚中試驗1組極顯著高于對照組(P<0.01)，試驗3組極顯著低于對照組(P<0.01)。3月齡獺兔HSL陽性表達細胞的平均灰度值，在背中部與腹部皮膚中各試驗組均極顯著高于對照組(P<0.01)；在臀部皮膚中各試驗組均極顯著低于對照組(P<0.01)。4月齡獺兔HSL陽性表達細胞的平均灰度值，在背中部皮膚中各試驗組均極顯著高于對照組(P<0.01)；在腹部皮膚中試驗2組和試驗3組均極顯著高于對照組(P<0.01)，試驗1組則極顯著低于對照組(P<0.01)；在臀部皮膚中試驗2組極顯著高于對照組(P<0.01)，試驗3組極顯著低于對照組(P<0.01)。

2.3 不同部位皮膚組織中β-catenin和HSL的Western blot檢測結果

Western blotting檢測結果顯示，獺兔皮膚總蛋白中存在分別與鼠抗人β-catenin和HSL的抗體發(fā)生免疫陽性反應的蛋白質條帶，蛋白質的大小分別為92、120 ku，如圖3所示。

3 討 論

毛囊是產毛動物皮膚的重要組成部分，具有獨特的復雜結構和生長的周期性。不同動物、不同部位的毛囊生長周期雖有一定的差異性，但是它們的基本結構是相同的，由內到外依次為毛干、內根鞘、外根鞘、結締組織鞘[12]。毛囊是表皮與真皮之間經過一系列復雜的相互作用的產物，受多種信號分子的調節(jié)，伴隨毛發(fā)周期毛囊有多達6 000種基因的表達發(fā)生改變。本試驗通過在飼糧中添加不同水平的肌醇，研究各組獺兔毛囊中β-catenin和HSL的表達差異，探討飼糧中肌醇水平對毛囊發(fā)育可能的影響機制。

A、B、C、D分別代表對照組、試驗1組、試驗2組、試驗3組。a所示為內根鞘，b所示為毛根鞘。圖中標尺長度為50 μm。

A, B, C and D showed control group, experimental group 1, experimental group 2 and experimental group 3, respectively. a represented inner root sheath, and b represented root sheath. Scale length in figure was 50 μm.

圖2 4月齡獺兔背中部皮膚組織HSL免疫組化染色結果

3.1 不同水平肌醇對不同月齡獺兔皮膚毛囊中β-catenin表達的影響

毛囊的發(fā)育過程受到多種信號分子的調節(jié)，其中Wnt/β-catenin信號途徑是最關鍵的途徑，而β-catenin是Wnt信號途徑中最重要的信號分子，它誘導毛囊的形態(tài)發(fā)生，維持毛囊生長、發(fā)育及毛囊干細胞的分化。

本研究結果顯示β-catenin在毛囊內根鞘、外根鞘以及毛乳頭中均有表達，與于秀菊等[13]對羊駝皮膚的研究結果一致，可見β-catenin是毛囊發(fā)育過程中不可缺少的分子。飼糧中肌醇水平不高于50 mg/kg時，3～4月齡獺兔背中部皮膚毛囊中β-catenin陽性表達細胞的平均灰度值隨著肌醇水平的增加而增加，結合前期研究結果，飼糧中肌醇水平為50 mg/kg時，次級毛囊密度會隨著肌醇水平的增加而變大[14]，可以得出肌醇水平對毛囊中β-catenin和次級毛囊密度的影響基本是相一致的，推斷飼糧中的肌醇可能通過影響毛囊中β-catenin的表達從而影響次級毛囊的周期性發(fā)育，這與王卓[15]的推測相一致。不同肌醇水平對各個部位皮膚中β-catenin表達的影響有一定差異，其中背中部的變化最大。在本試驗中，飼糧中添加50 mg/kg肌醇后，對2～3月齡獺兔3個部位皮膚中β-catenin表達的影響沒有規(guī)律性，但是4月齡時背中部、腹部和臀部毛囊中β-catenin的陽性表達細胞的平均灰度值均極顯著增加，表明β-catenin的表達上調。一般情況下4月齡獺兔正處于新老被毛替換和新被毛開始急劇生長期，推測β-catenin表達量的增加能夠促進毛囊干細胞的分化和毛囊的發(fā)育。

1、2、3、4泳道分別為對照組、試驗1組、試驗2組、試驗3組4月齡獺兔腹部皮膚；5、6、7、8泳道分別為對照組、試驗1組、試驗2組、試驗3組4月齡獺兔背中部皮膚。

Lanes 1,2,3 and 4 showed the skin of abdomen from 4-month-old Rex rabbits in the control group, experimental group 1, experimental group 2 and experimental group 3, respectively; lanes 5, 6, 7 and 8 showed the skin of dorsocentral region from 4-month-old Rex rabbits in the control group, experimental group 1, experimental group 2 and experimental group 3, respectively.

圖3 β-catenin和HSL Western blot檢測結果

Fig.3 The results of β-catenin and HSL detected by Western blot

3.2 不同水平肌醇對不同月齡獺兔皮膚毛囊中HSL表達的影響

本試驗結果顯示HSL主要表達于毛根鞘細胞。飼糧中不同水平肌醇對各個部位皮膚中HSL表達的影響程度不同，對背中部毛囊的影響最為明顯。3～4月齡獺兔背中部皮膚毛囊中HSL陽性表達細胞的平均灰度值隨著肌醇水平的增加而增加，對腹部和臀部皮膚毛囊中HSL的表達的影響沒有規(guī)律性。飼糧中肌醇水平為50 mg/kg時，4月齡獺兔背中部、腹部和臀部皮膚毛囊中的HSL陽性表達細胞的平均灰度值均極顯著增加。這可能是因為處于剛開始被毛急劇生長期的4月齡獺兔需要較多的能量供給，而毛囊中HSL表達量的增加，可通過促進脂肪降解為毛囊的生長發(fā)育提供充足的能量保證。結合前期研究結果，飼糧中肌醇水平不高于50 mg/kg時，次級毛囊密度會隨著肌醇水平的增加而變大[14]，推測肌醇通過提高毛囊中HSL的表達來促進毛囊細胞脂肪的降解過程，從而為毛囊的生長發(fā)育提供能量。

4 結 論

肌醇能夠通過上調4月齡獺兔毛囊中β-catenin和HSL的表達來促進毛囊的發(fā)育，在本試驗中，飼糧肌醇水平達到50 mg/kg時效果最佳。

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*Corresponding authors: CUI Yali, associate professor, E-mail: yalicui70@163.com; CHEN Baojiang, professor, E-mail: chenbaojiang@vip.sina.com

(責任編輯 菅景穎)

Effects of Different Inositol Levels on β-Catenin and Hormone-Sensitive Triglayceride Lipase Expression in Skin of Rex Rabbits

LI Min1CUI Yali1*WANG Binglei1CHEN Baojiang2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071000,China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071000,China)

The aim of the present study was to investigate the effects of different inositol levels in diets on the expression of β-catenin and hormone-sensitive triglayceride lipase (HSL) in skin of Rex rabbits. A total of 120 (40±1)-day-old Rex rabbits (half male and half female) were randomly divided into 4 groups with 30 rabbits per group. Rex rabbits in 4 groups were fed diets with different levels of inositol (0, 25, 50 and 75 mg/kg, respectively), and the experiment lasted for 3 months. The skin of abdomen, dorsocentral region, hip were collected on days 30 (2-month-old), 60 (3-month-old), 90 (4-month-old), respectively, and the protein expression and location of β-catenin and HSL were studied by immunohistochemistry and Western blot methods. The results showed that the β-catenin was widely expressed in hair follicle, and the hair root sheath cells and hair papilla all had brown positive reaction cells. HSL was showed a very obvious dark brown strong positive expression in hair root sheath cells, especially in inner root sheath cells. The addition of 50 mg/kg inositol could extremely significantly increase the mean gray value of β-catenin and HSL positive cells in the hair follicles of the dorsocentral region skin of 2- to 4-month-old Rex rabbits (P<0.01), extremely significantly increase the mean gray value of β-catenin and HSL positive cells in the hair follicles of the dorsocentral region, abdomen and hip skin of 4-month-old Rex rabbits (P<0.01). The results suggest that inositol can promote the growth of hair follicle by increasing the expresstion of β-catenin and HSL of 4-month-old Rex rabbits, and the effect is the best when dietary inositol level is 50 mg/kg in this experiment.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(8)：2743-2749]

inositol; Rex rabbits; hair follicle; β-catenin; HSL

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.08.017

2017-01-21

國家兔產業(yè)技術體系(CARS-44-B-3)；吉林海資生物技術有限公司橫向課題

李 敏(1991—)，女，河北衡水人，碩士研究生，研究方向為細胞生物學與分子免疫學。E-mail: 844413347@qq.com

*通信作者:崔亞利，副教授，碩士生導師，E-mail: yalicui70@163.com；陳寶江，教授，博士生導師，E-mail: chenbaojiang@vip.sina.com

S816.7

A

1006-267X(2017)08-2743-08