體外培養(yǎng)條件下不同長鏈脂肪酸對山羊瘤胃原蟲群體結(jié)構(gòu)和原蟲吞噬細(xì)菌循環(huán)的影響

經(jīng)語佳 高 健 王夢芝 歐陽佳良

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009)

體外培養(yǎng)條件下不同長鏈脂肪酸對山羊瘤胃原蟲群體結(jié)構(gòu)和原蟲吞噬細(xì)菌循環(huán)的影響

經(jīng)語佳 高 健 王夢芝*歐陽佳良

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009)

本試驗(yàn)旨在研究體外培養(yǎng)條件下不同長鏈脂肪酸對山羊瘤胃原蟲群體結(jié)構(gòu)和原蟲吞噬細(xì)菌循環(huán)的影響。試驗(yàn)選取6種不同不飽和度的長鏈脂肪酸[分別為硬脂酸(A組)、油酸(B組)、亞油酸(C組)、α-亞麻油酸(D組)、花生四烯酸(E組)、二十碳五烯酸(F組)，不飽和鍵個(gè)數(shù)從0～5依次遞增]，各脂肪酸的添加水平為底物的3%，進(jìn)行體外培養(yǎng)。在體外培養(yǎng)10 h后測定原蟲吞噬細(xì)菌速率，在體外培養(yǎng)24 h后測定細(xì)菌、原蟲密度以及細(xì)菌蛋白質(zhì)、原蟲蛋白質(zhì)含量。結(jié)果表明：除F組頭毛蟲屬(Ophryoscolecinae)比例顯著高于B和D組(P<0.05)外，不同長鏈脂肪酸的添加對原蟲中厚毛蟲屬(Dasytricharuminantium)、內(nèi)纖毛蟲屬(Entodinium)、雙毛蟲屬(Diplodiniinae)、等毛蟲屬(Isotrichidae)、前毛蟲屬(Epidinium)比例的影響均不顯著(P>0.05)。原蟲密度以A組最高，并顯著高于B組(P<0.05)；細(xì)菌密度以D組最高，并顯著高于A、B、E、F組(P<0.05)。原蟲吞噬細(xì)菌速率A～F組依次為244.50、236.51、229.60、189.04、200.51、174.24 cells/(cell·h)；另外，以D組的細(xì)菌周轉(zhuǎn)率(0.68%)最低，且其細(xì)菌周轉(zhuǎn)時(shí)間(146.92 h)最長。所估算的細(xì)菌蛋白質(zhì)循環(huán)量以D[126.75 mg/(d·頭)]和F組[131.63 mg/(d·頭)]相對較低。因此，在本試驗(yàn)基礎(chǔ)上認(rèn)為，體外培養(yǎng)條件下α-亞麻油酸抑制山羊瘤胃原蟲吞噬細(xì)菌效果較好。

脂肪酸；不飽和鍵；原蟲；吞噬細(xì)菌

瘤胃微生物蛋白質(zhì)(MCP)是反芻動(dòng)物的主要氮素來源之一，能提供蛋白質(zhì)需要量的40%～80%，其合成量的高低可以反映瘤胃中微生物的數(shù)量和微生物蛋白質(zhì)合成的效率[1]，并且與瘤胃對氮源的有效利用有關(guān)[2]。瘤胃原蟲對細(xì)菌的吞噬和消化所導(dǎo)致的瘤胃內(nèi)氮循環(huán)無疑降低了氮的利用效率[3-5]。因此，原蟲被認(rèn)為是瘤胃氮代謝效率低的主要原因之一。研究表明，去原蟲有利于尿素氮向瘤胃的轉(zhuǎn)運(yùn)[6]，降低瘤胃內(nèi)氮循環(huán)，利于細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成[7]。而油脂和脂肪酸作為反芻動(dòng)物的很好的能量補(bǔ)充物，對原蟲的生長有負(fù)效應(yīng)[8]，能夠促進(jìn)瘤胃微生物蛋白質(zhì)的合成，降低瘤胃內(nèi)氮循環(huán)[9-10]。有報(bào)道稱富含十八碳脂肪酸的植物油脂可以減少甲烷的產(chǎn)生，改善瘤胃發(fā)酵環(huán)境[11-12]；并且，有研究表明體外培養(yǎng)條件下添加植物油脂對培養(yǎng)液酶活力、微生物活力[13]、瘤胃原蟲數(shù)量、細(xì)菌蛋白質(zhì)及DNA含量[14]都有一定的影響。目前，不少研究報(bào)道明確指出不飽和脂肪酸對瘤胃原蟲和細(xì)菌的負(fù)面作用與其不飽和度有關(guān)[15-16]，但不飽和度對原蟲吞噬細(xì)菌活力和原蟲群體結(jié)構(gòu)影響的規(guī)律尚不得而知。本試驗(yàn)選取6種不同不飽和度的長鏈脂肪酸，分別為硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻油酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸，其不飽和鍵個(gè)數(shù)從0～5依次遞增，擬系統(tǒng)地研究長鏈脂肪酸的不飽和度對瘤胃原蟲群體結(jié)構(gòu)和原蟲吞噬細(xì)菌循環(huán)的影響規(guī)律，為降低瘤胃原蟲吞噬細(xì)菌循環(huán)過程中氮損失和提高飼糧中氮素利用效率提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

取3頭1.5周歲、體重(29.4±2.7) kg、裝有永久性瘤胃瘺管的薩能奶山羊，單圈飼養(yǎng)，以玉米+豆粕+羊草為基礎(chǔ)飼糧，精粗比為2∶8，每日按體重的2.5%干物質(zhì)量供料，在每天07:00、19:00分2次等量飼喂，自由飲水。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與體外培養(yǎng)底物

配制6種體外培養(yǎng)底物，這6種體外培養(yǎng)底物中添加的長鏈脂肪酸分別為硬脂酸(A組)、油酸(B組)、亞油酸(C組)、α-亞麻油酸(D組)、花生四烯酸(E組)、二十碳五烯酸(F組)，脂肪酸的添加水平為培養(yǎng)底物的3%。體外培養(yǎng)底物組成見表1。硬脂酸(Cat# 21-12-8)、油酸(Cat# 112-80-1)、亞油酸(Cat# 60-33-3)、α-亞麻油酸(Cat# 463-40-1)和花生四烯酸(Cat# 506-32-1)均購自北京北靈威化學(xué)技術(shù)有限公司，純度≥99.0%；二十碳五烯酸(Cat# 10417-94-4)購自上?？戮S化學(xué)技術(shù)有限公司，純度≥99.0%；木聚糖(Cat# 9014-63-5)、阿拉伯聚糖(Cat# 87-72-9)、葡聚糖(Cat# 9004-54-0)、甘露聚糖(Cat# 9036-88-8)、果膠(Cat# 9000-69-5)和木質(zhì)素(Cat# 8061-51-6)購自美國Sigma公司，純度≥99.0%；纖維二糖(Cat# 528-50-7)、可溶性淀粉(Cat# 9005-84-9)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，純度≥99.0%；尿素(Cat# 57-13-6)購自北京惠寶聯(lián)化科技有限公司，純度≥99.0%；酪蛋白(Cat# 9000-71-9)購自北京索萊寶科技有限公司，純度≥99.0%。

表1 體外培養(yǎng)底物組成(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 體外培養(yǎng)試驗(yàn)

體外培養(yǎng)試驗(yàn)參照Menke等[17]的方法，在底物和培養(yǎng)液的配制量上略做修改，具體操作如下：晨飼前通過瘤胃瘺管從3頭瘺管山羊瘤胃采集瘤胃液，按人工唾液鹽∶瘤胃液=2∶1配制好培養(yǎng)液，通CO239 ℃水浴預(yù)熱備用。準(zhǔn)確稱取各組1.50 g培養(yǎng)底物置于250 mL的三角瓶中，分別加入150 mL培養(yǎng)液，通CO239 ℃ 50 r/min振蕩培養(yǎng)。每組各設(shè)3個(gè)重復(fù)。在培養(yǎng)10 h后進(jìn)行原蟲吞噬細(xì)菌試驗(yàn)，培養(yǎng)24 h后結(jié)束，取20 mL培養(yǎng)液分裝于2個(gè)離心管，一部分用于細(xì)菌和原蟲數(shù)量的測定，一部分用于細(xì)菌蛋白質(zhì)和原蟲蛋白質(zhì)含量的測定。

1.4 瘤胃微生物計(jì)數(shù)

1.4.1 細(xì)菌計(jì)數(shù)

以2%結(jié)晶紫溶液(2 g結(jié)晶紫溶于10 mL 95%乙醇和90 mL 0.8%草酸銨溶液)進(jìn)行染色，用16×25血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡(奧林巴斯CKX41，日本)(1 000×)下計(jì)數(shù)。細(xì)菌數(shù)量計(jì)算公式如下：

細(xì)菌密度(cells/mL)=N/S×D×16×10×1 000=
N/S×D×16×104。

式中：N為計(jì)數(shù)方格的總數(shù)；S為計(jì)數(shù)方格數(shù)；D為稀釋倍數(shù)。

1.4.2 原蟲計(jì)數(shù)

參考盧德勛等[18]和Nsabimana等[19]的方法對瘤胃原蟲染色計(jì)數(shù)。以MFS染液(氯化鈉8 g、甲基綠0.6 g、福爾馬林溶液100 mL，定容至1 000 mL)染色，用16×25血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡(奧林巴斯CKX41，日本)(1 000×)下計(jì)數(shù)。原蟲數(shù)量計(jì)算公式如下：

原蟲密度(cells/mL)=N/4×D×16×
10×1 000=N×D×4×104。

式中：N為計(jì)數(shù)4個(gè)中方格的總數(shù)；D為稀釋倍數(shù)。

1.4.3 原蟲種屬鑒定及計(jì)數(shù)

通過形態(tài)學(xué)觀察對原蟲鑒定到屬的水平，計(jì)數(shù)方法同上。

1.5 細(xì)菌粗蛋白質(zhì)和原蟲粗蛋白質(zhì)含量的測定

取培養(yǎng)液加等體積生理鹽水39 ℃水浴振蕩(125 r/min)培養(yǎng)60 min，并輔以攪拌；再經(jīng)4層紗布過濾，濾液離心(150×g，10 min)，收集沉淀為原蟲，用生理鹽水洗滌2次后用生理鹽水懸浮，-20 ℃貯存待測。濾液離心后的上清液再經(jīng)過冷凍高速離心(22 000×g，15 min)，收集沉淀為細(xì)菌。將收集的細(xì)菌和原蟲分開制成凍干樣品，然后用全量凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)含量，用于計(jì)算培養(yǎng)液中細(xì)菌蛋白質(zhì)和原蟲蛋白質(zhì)的含量。

1.6 原蟲吞噬細(xì)菌試驗(yàn)

1.6.1 無菌瘤胃液與熒光標(biāo)記瘤胃細(xì)菌(fluorescence-labeled rumen bacteria，F(xiàn)LRB)的制備

無菌瘤胃液的制備：采集瘤胃液，過2 μm濾膜，濾液離心(22 000×g，15 min)，收集沉淀，用滅菌生理鹽水清洗和離心各2遍，然后懸浸于滅菌生理鹽水中。

FLRB的制備：將制備的無菌瘤胃液加1.5 mL三氯三嗪基氨基熒光素(DTAF)染色，60 ℃水浴2 h；離心(22 000×g，15 min)，將上層DTAF溶液倒出，再用滅菌生理鹽水洗滌和離心各3遍；之后懸浸于與取樣同體積的滅菌生理鹽水中，-20 ℃保存。-20 ℃保存的FLRB在使用時(shí)解凍并離心(22 000×g，15 min)后，用對應(yīng)的無菌瘤胃液懸浸制成2倍濃度的FLRB懸液。

1.6.2 原蟲吞噬細(xì)菌試驗(yàn)方法

按照參考文獻(xiàn)[20]的方法，略改動(dòng)，具體步驟如下：1)按試驗(yàn)設(shè)計(jì)同時(shí)制備2份培養(yǎng)底物，一份不加培養(yǎng)液備用，另外一份按上述體外培養(yǎng)試驗(yàn)方法進(jìn)行體外培養(yǎng)；2)FLRB解凍后離心，加入1/2體積的無菌瘤胃液，加入適量備用底物，置水浴鍋(39 ℃)；3)在體外培養(yǎng)進(jìn)行至10 h時(shí)，取與標(biāo)記菌同體積的培養(yǎng)液分離原蟲，用1/2體積的無菌瘤胃液懸浸；4)合并原蟲與標(biāo)記菌培養(yǎng)液進(jìn)行吞噬試驗(yàn)；5)每5 min取培養(yǎng)液制切片，連續(xù)取5次，用倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯CKX41，日本)檢測蟲體內(nèi)FLRB的數(shù)量，每組3個(gè)重復(fù)，每片以12個(gè)原蟲平均值計(jì)。

1.6.3 瘤胃細(xì)菌和原蟲之間氮循環(huán)相關(guān)指標(biāo)計(jì)算

根據(jù)原蟲吞噬細(xì)菌速率和原蟲密度可以得到原蟲吞噬細(xì)菌量，再結(jié)合細(xì)菌密度可以計(jì)算出由于原蟲吞噬造成的細(xì)菌周轉(zhuǎn)時(shí)間和周轉(zhuǎn)率，計(jì)算公式如下：

吞噬細(xì)菌量[cells/(mL·h)]=吞噬細(xì)菌速率×原蟲密度；
細(xì)菌周轉(zhuǎn)時(shí)間(h)=細(xì)菌密度/吞噬細(xì)菌量；
細(xì)菌周轉(zhuǎn)率(%)=吞噬細(xì)菌量/細(xì)菌密度。

參考Sherr等[21]、李洪波等[22]、王家玲等[23]的報(bào)道可知，熒光標(biāo)記細(xì)菌(fluorescence-labeled bacteria，F(xiàn)LB)的平均體積為0.10 μm3，換算為氮的系數(shù)是0.054 pg/μm3，因此得到原蟲在瘤胃內(nèi)循環(huán)中對細(xì)菌氮的吞噬速率，計(jì)算公式如下：

吞噬細(xì)菌氮速率[pg/(cell·h)]=原蟲吞噬速率×0.054。

根據(jù)吞噬細(xì)菌氮速率和原蟲密度，推算出每只山羊每天瘤胃內(nèi)由于原蟲吞噬而產(chǎn)生的氮循環(huán)量(山羊瘤胃體積按4 L計(jì))，同時(shí)，可以通過瘤胃氮循環(huán)量換算出瘤胃細(xì)菌蛋白質(zhì)循環(huán)量。

氮循環(huán)量[mg/(d·頭)]=吞噬氮速率×原蟲密度×4×24×10-9；
細(xì)菌蛋白質(zhì)循環(huán)量[mg/(d·頭)] =氮循環(huán)量×6.25。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0 軟件的Regression的Curve Estimation過程進(jìn)行回歸分析，并采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行方差分析和Tukey’s多重比較。以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同長鏈脂肪酸對原蟲蛋白質(zhì)、細(xì)菌蛋白質(zhì)含量的影響

由表2可知，原蟲蛋白質(zhì)含量以A組最高，為0.591 mg/mL，顯著高于C、D、E組(P<0.05)，A組與B、F組之間差異不顯著(P>0.05)。原蟲蛋白質(zhì)含量的排序?yàn)锳組>B組>F組>E組>D組>C組。細(xì)菌蛋白質(zhì)含量以A組最低，為0.123 mg/mL，以D組最高，為0.285 mg/mL，D組顯著高于A、B、E、F組(P<0.05)，但與C組差異不顯著(P>0.05)。

2.2 不同長鏈脂肪酸對原蟲、細(xì)菌密度的影響

由表2可知，原蟲密度以A組最高，為2.691×105cells/mL，以B組最低，為1.714×105cells/mL，A組顯著高于B組(P<0.05)，A、C、D、E、F組之間差異不顯著(P>0.05)。細(xì)菌密度以D組最高，為5.752×109cells/mL，以A組最低，為4.728×109cells/mL，D組顯著高于A、B、E、F組(P<0.05)，但與C組差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同長鏈脂肪酸對原蟲蛋白質(zhì)、細(xì)菌蛋白質(zhì)含量以及原蟲、細(xì)菌密度的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Values with different small letter superscripts mean significant different (P<0.05). The same as below.

2.3 不同長鏈脂肪酸對各屬原蟲比例的影響

由表3可知，頭毛蟲屬(Ophryoscolecinae)比例以F組最高(5.318%)，顯著高于B和D組(P<0.05)，同時(shí)，頭毛蟲屬也是原蟲所鑒定出的屬中含量最少的屬；體外添加不同長鏈脂肪酸對厚毛蟲屬(Dasytricharuminantium)、內(nèi)纖毛蟲屬(Entodinium)、雙毛蟲屬(Diplodiniinae)、等毛蟲屬(Isotrichidae)、前毛蟲屬(Epidinium)比例的影響均不顯著(P>0.05)，厚毛蟲屬以C組最高(13.836%)，A組最低(10.734%)；內(nèi)纖毛蟲屬以C組最高(32.536%)，B組最低(30.825%)；雙毛蟲屬以E組最高(14.380%)，F(xiàn)組最低(10.765%)；等毛蟲屬以A組最高(18.091%)，F(xiàn)組最低(14.875%)；前毛蟲屬以A組最高(15.394%)，C組最低(10.724 %)。

2.4 不同長鏈脂肪酸對原蟲吞噬細(xì)菌速率的影響

由圖1可知，原蟲吞噬細(xì)菌量隨著吞噬試驗(yàn)時(shí)間的推移而逐漸增長，各組整體增長趨勢基本一致。在0～15 min內(nèi)，原蟲吞噬細(xì)菌量增長較為迅速，而35 min后各組的漲勢逐漸趨于平緩。所以，0～35 min內(nèi)原蟲吞噬細(xì)菌量隨時(shí)間變化的結(jié)果可以比較可靠地用作線性回歸分析來計(jì)算原蟲吞噬細(xì)菌速率。

各組原蟲對FLRB的吞噬量(Y,cells/cell)與吞噬試驗(yàn)時(shí)間(X,min)進(jìn)行線性回歸分析，各組擬合后得出的回歸方程：A組，Y=14.192+3.838X(R2=0.98；P<0.001；n=9)；B組，Y=6.774+3.829X(R2=0.99；P<0.001；n=9)；C組，Y=2.202+3.790X(R2=0.99；P<0.001；n=9)；D組，Y=0.522+3.142X(R2=0.99；P<0.001；n=9)；E組，Y=2.333+3.303X(R2=0.99；P<0.001；n=9)；F組，Y=-0.597+2.914X(R2=0.99；P<0.001；n=9)。以上方程的R2都在0.98以上，表明線性關(guān)系良好、結(jié)果可靠。

據(jù)回歸方程計(jì)算的原蟲吞噬細(xì)菌速率(表3)，A～F組依次為244.50、236.51、229.60、189.04、200.51、174.24 cells/(cell·h)，以A組(硬脂酸)最高，F(xiàn)組(二十碳五烯酸)最低，基本隨不飽和鍵數(shù)量的增加而降低，但花生四烯酸較α-亞麻油酸為高。以換算系數(shù)換算得出原蟲吞噬細(xì)菌氮速率，A～F組依次為1.32、1.28、1.24、1.02、1.08、0.94 pg/(cell·h)。

表3 不同長鏈脂肪酸對各屬原蟲比例的影響

圖1 原蟲吞噬細(xì)菌量隨吞噬試驗(yàn)時(shí)間的變化

2.5 不同長鏈脂肪酸對細(xì)菌和原蟲之間氮循環(huán)的影響

根據(jù)原蟲密度和原蟲吞噬細(xì)菌速率可以計(jì)算得到原蟲吞噬細(xì)菌量(表4)，以A組最高，為657.95×105cells/(mL·h)，以D組最低，為391.50×105cells/(mL·h)。據(jù)細(xì)菌密度和原蟲吞噬細(xì)菌量計(jì)算出由于原蟲吞噬造成的細(xì)菌周轉(zhuǎn)時(shí)間和周轉(zhuǎn)率(表4)，以D組細(xì)菌周轉(zhuǎn)率最低，為0.68%，其周轉(zhuǎn)時(shí)間為146.92 h(每小時(shí)約有0.68%的細(xì)菌被原蟲吞噬，原蟲吞噬經(jīng)過146.92 h細(xì)菌可周轉(zhuǎn)更新一輪)；以A組細(xì)菌周轉(zhuǎn)率最高，為1.39%，其周轉(zhuǎn)時(shí)間為71.86 h；瘤胃內(nèi)細(xì)菌周轉(zhuǎn)率排序?yàn)镈組

表4 不同長鏈脂肪酸對細(xì)菌和原蟲之間氮循環(huán)的影響

僅對吞噬細(xì)菌速率進(jìn)行了方差分析，其余指標(biāo)是經(jīng)過科學(xué)計(jì)算得出。

Only engulfing bacteria rate was analyzed by analysis of variance, and the other indices were gained through scientific calculation.

3 討 論

3.1 體外培養(yǎng)條件下不同長鏈脂肪酸對山羊瘤胃原蟲群體結(jié)構(gòu)的影響

原蟲僅能通過吞噬細(xì)菌來獲得氮源，所以，原蟲的存在增加了氮在瘤胃內(nèi)的周轉(zhuǎn)和消耗。研究表明，長鏈脂肪酸中的不飽和鍵可以抑制原蟲和細(xì)菌的生長，因此部分研究學(xué)者利用原蟲和細(xì)菌對脂肪酸響應(yīng)的差異來抑制原蟲的生長[24]。本試驗(yàn)中，6組中原蟲密度最高的是A組，B、C、D、E、F組相比于A組分別降低了36.31%、2.68%、23.04%、7.99%、2.68%，說明不飽和脂肪酸的添加對瘤胃原蟲的生長有抑制作用，且以油酸和α-亞麻油酸降低原蟲密度效果較優(yōu)。不飽和脂肪酸可以降低瘤胃原蟲數(shù)量[5]，也正是因?yàn)榱鑫冈x數(shù)量的下降使得其對細(xì)菌的吞噬作用減少，因此本試驗(yàn)中B、C、D、E、F組瘤胃細(xì)菌密度相較于A組均有所升高，究其原因可能是原蟲對不飽和脂肪酸的響應(yīng)度高于細(xì)菌，從而導(dǎo)致原蟲活力降低的程度超過其對細(xì)菌的吞噬程度，因此在觀測時(shí)間內(nèi)瘤胃細(xì)菌密度升高，并且，以α-亞麻油酸組的細(xì)菌密度最高。Ivan等[25]報(bào)道稱十八碳不飽和脂肪酸能夠通過對瘤胃內(nèi)氫氣(H2)的利用達(dá)到顯著抑制或毒害原蟲作用。早期有研究表明，瘤胃原蟲和細(xì)菌在脂肪酸的氫化過程中均起到一定作用[26-27]，后來有研究證明原蟲的這種氫化作用主要來自于被吞噬的細(xì)菌[28]。此外，脂肪酸對微生物的毒性作用可能與其改變微生物脂雙分子層細(xì)胞膜有關(guān)[29]，脂肪酸中的雙鍵會(huì)影響原蟲分子的空間結(jié)構(gòu)，破壞細(xì)胞的完整性。

總體來看，除了頭毛蟲屬，其他原蟲屬在各組間差異均不顯著。相比于硬脂酸，其他長鏈脂肪酸添加有降低內(nèi)纖毛蟲屬、等毛蟲屬、前毛蟲屬比例的趨勢，這與原蟲密度的結(jié)果相一致。從厚毛蟲屬的結(jié)果得到，其他長鏈脂肪酸組相比硬脂酸組有上升趨勢，而在雙毛蟲屬中，油酸、花生四烯酸組相對于硬脂酸組有上升趨勢。長鏈脂肪酸的添加對不同種屬原蟲的效果不同，這種差異的產(chǎn)生可能與不同種屬原蟲對長鏈脂肪酸的氫化能力不同有關(guān)；另外，也可能與原蟲種屬間不同的繁殖速率、捕食細(xì)菌行為、對營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用以及對長鏈脂肪酸適應(yīng)性有關(guān)。本試驗(yàn)中內(nèi)纖毛蟲屬為原蟲中優(yōu)勢菌屬，比例占到30%～35%，這與王洪榮等[30]以及王夢芝等[31]的研究結(jié)果相一致。另外，研究表明，內(nèi)纖毛蟲屬可以功能選擇性吞噬多種細(xì)菌，每小時(shí)最大吞噬量可達(dá)4 100個(gè)[32]，也正是由于對硬脂酸組擁有的內(nèi)纖毛蟲屬比例較大，其吞噬細(xì)菌速率最快，氮循環(huán)效率最高。

3.2 體外培養(yǎng)條件下不同長鏈脂肪酸對山羊瘤胃原蟲吞噬細(xì)菌循環(huán)的影響

瘤胃內(nèi)細(xì)菌周轉(zhuǎn)率從低到高排序?yàn)棣?亞麻油酸組、油酸組、二十碳五烯酸組、花生四烯酸組、亞油酸組、硬脂酸組。所以，不飽和長鏈脂肪酸的添加可以降低瘤胃內(nèi)細(xì)菌的周轉(zhuǎn)率，并以ɑ-亞麻油酸在調(diào)控瘤胃氮循環(huán)方面效果最好。從吞噬細(xì)菌氮速率來看，由于原蟲吞噬能力的下降，吞噬細(xì)菌氮速率也隨之減緩，本試驗(yàn)中吞噬細(xì)菌氮速率的高低排序?yàn)橛仓峤M、油酸組、亞油酸組、花生四烯酸組、α-亞麻油酸組、二十碳五烯酸組，各組相比于硬脂酸組均有所下降，而硬脂酸組之所以不能降低原蟲吞噬細(xì)菌氮速率原因可能是因?yàn)橛仓釣轱柡椭舅?，對瘤胃微生物的毒害作用極少或沒有，這與Wallace等[24]指出的十八碳脂肪酸對瘤胃細(xì)菌的負(fù)面作用沒有顯著影響相一致。Oldick等[33]報(bào)道稱增加不飽和脂肪酸的不飽和度可以使瘤胃原蟲數(shù)量直線下降，因此，本試驗(yàn)中二十碳五烯酸之所以降低原蟲吞噬細(xì)菌氮速率效果最好可能是因?yàn)槠洳伙柡统潭仍?種長鏈脂肪酸中最高(含有5個(gè)不飽和鍵)。各組原蟲吞噬細(xì)菌氮速率的由高到低排序與其不飽和度從低到高排序的順序基本一致，除了α-亞麻油酸在降低吞噬細(xì)菌速率上優(yōu)于不飽和程度更高的花生四烯酸。原因可能與脂肪酸雙鍵位置有關(guān)，α-亞麻油酸和二十碳五烯酸第1個(gè)不飽和鍵的位置均在第3個(gè)碳原子上，而花生四烯酸在第6個(gè)碳原子上。

原蟲雖然有降解蛋白質(zhì)的能力，但其本身不能合成蛋白質(zhì)，并且原蟲自溶一般可以提供十二指腸微生物蛋白的20%左右[34]。本試驗(yàn)中，油酸、亞油酸、α-亞麻油酸、花生四烯酸二十碳五烯酸組的原蟲蛋白質(zhì)含量相比于硬脂酸組分別降低了6.77%、27.75%、23.18%、19.46%、8.80%，且硬脂酸組顯著高于亞油酸、α-亞麻油酸和花生四烯酸組，說明添加3%的不飽和長鏈脂肪酸能夠降低瘤胃原蟲蛋白質(zhì)含量，其原因可能是因?yàn)椴伙柡烷L鏈脂肪酸對瘤胃原蟲的負(fù)面作用，并隨不飽和度的增加其效應(yīng)加大[35]：一方面，不飽和長鏈脂肪酸抑制原蟲生長，使原蟲密度下降，數(shù)量減少，而原蟲生物量很大程度上決定了原蟲蛋白質(zhì)含量，所以原蟲蛋白質(zhì)含量降低；另一方面，原蟲本身無法合成蛋白質(zhì)，原蟲不能利用氮源合成自身所需要的氨基酸，只能利用微生物和飼糧中的蛋白質(zhì)和肽作為主要氮源[30]，而不飽和長鏈脂肪酸的添加會(huì)抑制原蟲吞噬細(xì)菌的能力，阻礙其獲得氮源，從而導(dǎo)致原蟲蛋白質(zhì)含量降低。

4 結(jié) 論

體外培養(yǎng)條件下，山羊瘤胃原蟲吞噬細(xì)菌速率基本上隨長鏈脂肪酸不飽和鍵數(shù)量的增加而降低，瘤胃細(xì)菌周轉(zhuǎn)率以亞麻油酸組最低，為0.68%，周轉(zhuǎn)時(shí)間最長，為146.92 h。綜上，α-亞麻油酸抑制瘤胃原蟲吞噬細(xì)菌循環(huán)效果最好。

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*Corresponding author, associate professor, E-mail: mengzhiwangyz@126.com

(責(zé)任編輯 菅景穎)

Effects of Different Long-Chain Fatty Acids on Protozoal
Community Structure and Bacterial Recycling Due to Protozoa Engulfment of Goat RumeninVitro

JING Yujia GAO Jian WANG Mengzhi*OUYANG Jialiang

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

This experiment was conducted to investigate the effects of different long-chain fatty acids on protozoal community structure and bacterial recycling due to protozoa engulfment of goat rumeninvitro. Six long-chain fatty acids with different saturations were selected, they were stearic acid (group A), oleic acid (group B), linoleic acid (group C), α-linoleic acid (group D), arachidonic acid (group E) and eicosapentaenoic acid (group F), respectively, and the number of unsaturated bond of them was orderly increased from 0 to 5. The fatty acids above were used at a level of 3% in the substrate to perform theinvitroculture. The protozoal engulfing bacteria rate was assayed at 10 h of theinvitrocultured and the densities of protozoal and bacterial and the contents of the protozoal protein and bacterial protein were measured at 24 h of theinvitroculture. The results showed that, except the percentage ofOphryoscolecinaein group F was significantly higher than that in groups B and D (P<0.05), adding different long-chain fatty acids had no significant effects on the percentages ofDasytricharuminantium,Entodinium,Diplodiniinae,IsotrichidaeandEpidinium(P>0.05). The protozoal density was the highest in group A which was significantly higher than that in group B (P<0.05); while the bacterial density in group D was the highest and significantly higher than at in groups A, B, E and F (P<0.05). The bacteria engulfing rate of protozoa in 5 groups was 244.50 (group A), 236.51 (group B), 229.60 (group C), 189.04 (group D), 200.51 (group E), 174.24 cells/(cell·h) (group F), respectively. Additionally, the bacteria recycling rate was the lowest in group D with the longest bacterial cell recycling time (146.92 h). It was further calculated that, the bacterial protein recycling amounts were comparatively lower in groups D [126.75 mg/(d·head)] and F [131.63 mg/(d·head)]. Base on this experiment, it is therefore considered that α-linoleic acid has better inhibitory effect on the bacterial recycling due to protozoa engulfment of goat rumeninvitro.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(8)：2707-2715]

fatty acids; unsaturated bond; protozoa; engulfing bacteria

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.08.013

2017-03-07

國家自然基金項(xiàng)目(31672446)；江蘇省自然科學(xué)基金基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(BK20151312)；江蘇省優(yōu)勢學(xué)科

經(jīng)語佳(1992—)，女，江蘇揚(yáng)州人，碩士研究生，動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)。E-mail: yujiajingyz@126.com

*通信作者：王夢芝，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: mengzhiwangyz@126.com

S816

A

1006-267X(2017)08-2707-09