歐洲七葉樹種胚愈傷組織培養(yǎng)與七葉皂苷量的分析

王明梅， 王晨陽， 張 敏， 王意敏， 劉忠華

(北京林業(yè)大學 生物科學與技術學院， 北京 100083)

歐洲七葉樹種胚愈傷組織培養(yǎng)與七葉皂苷量的分析

王明梅， 王晨陽， 張 敏， 王意敏， 劉忠華

(北京林業(yè)大學 生物科學與技術學院， 北京 100083)

通過改變培養(yǎng)基中植物生長調節(jié)劑的配比，篩選出適宜歐洲七葉樹種胚愈傷組織增殖及七葉皂苷含量高的培養(yǎng)基，并對愈傷組織細胞生長與次生代謝物積累的規(guī)律進行初步分析，為細胞培養(yǎng)生產七葉皂苷提供理論基礎。結果表明：歐洲七葉樹種胚愈傷組織增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS+8 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA；在最佳增殖培養(yǎng)基上，愈傷組織的最佳繼代時期為35 d，最佳收獲期為42 d；對愈傷組織比生長速率與七葉皂苷比合成速率進行分析，發(fā)現(xiàn)隨著歐洲七葉樹種胚愈傷組織細胞生長速率和比生長速率的降低，七葉皂苷合成速率和比合成速率增加。

歐洲七葉樹種胚；愈傷組織；七葉皂苷；植物生長調節(jié)劑配比

歐洲七葉樹(AesculushippocastanumL.)為七葉樹科(Hippocastanaceae)七葉樹屬(Aesculus)的一種落葉喬木，樹體高大雄偉，樹冠開闊，葉大而形美，具有良好的遮蔭效果，是世界五大觀賞樹種之一，又是重要的藥用樹種，在我國僅有少量分布。歐洲七葉樹種子中含有三萜皂苷混合物如七葉樹苷元、乙酸、惕各酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖等，總稱為七葉皂苷，還含有七葉酸、七葉靈酸以及黃酮類及甾醇類化合物、香豆素類(七葉樹苷、秦皮苷、秦皮素等)、鞣質、淀粉、鎂、鈉、錳、鈷、碘等[1-3]。七葉皂苷是歐洲七葉樹種子中的主要活性成分，主要包括A、B、C和D 4種組分，根據德國DAC的定義七葉皂苷A、B稱為β-七葉皂苷(β- aescin)，七葉皂苷C、D 稱為α-七葉皂苷(α-aescin)[3]。大量研究表明，七葉皂苷具有消炎、抗?jié)B出、抗水腫、抗氧化、恢復毛細血管通透性，提高靜脈張力，改善血液循環(huán)，促進腦細胞恢復、抗腫瘤等作用[4-9]；目前臨床主要用于治療腰椎間盤突出癥、急性甲狀腺炎、顱腦外傷、腦出血、腦梗死及術后腫脹等疾病[10-15]。

歐洲七葉樹原產于希臘北部和阿爾巴尼亞山區(qū)，我國的北京、上海、青島等城市已有引種栽培，但結實率不高，資源有限難以滿足其醫(yī)藥和綠化需求[2]。利用植物細胞培養(yǎng)生產次生代謝產物可不受季節(jié)、產地等的限制，是解決藥用植物資源短缺的有效途徑[16]。目前，國內外的大部分研究工作都是從歐洲七葉樹的器官中直接提取七葉皂苷，并對其進行成分分析，僅Profumo等[17]利用歐洲七葉樹葉外植體進行胚性愈傷的誘導并對胚狀體中七葉素的含量進行了初步分析。之后有學者分別以歐洲七葉樹的幼嫩葉片、胚芽、莖段、雄蕊花絲等為外植體進行了離體培養(yǎng)及快速繁殖體系的建立[18-21]；Zead等對歐洲七葉樹種子種皮及胚乳中4種主要皂苷(七葉皂苷Ia、Ib和異七葉皂苷Ia、Ib)的含量進行測定，發(fā)現(xiàn)胚乳中七葉皂苷Ia、Ib的含量均高于種皮，七葉皂苷主要貯存于種子的胚乳中[22]；而利用歐洲七葉樹種胚進行細胞培養(yǎng)生產七葉皂苷類化合物，國內外報道較少；通過改變培養(yǎng)基中植物生長調節(jié)劑配比，篩選出適合七葉皂苷生產的植物細胞培養(yǎng)體系，國內外未見報道。因此，筆者探討了不同激素配比對歐洲七葉樹種胚愈傷組織增殖及七葉皂苷量的影響，得到了細胞培養(yǎng)生產七葉皂苷的最佳植物生長調節(jié)劑組合，并對愈傷組織生長量及七葉皂苷含量進行初步分析，以便為歐洲七葉樹種胚細胞培養(yǎng)生產七葉皂苷的相關研究提供技術原理和工藝基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

歐洲七葉樹種子于2015年9月13日采自北京植物園內，通過MS+2 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA誘導產生愈傷組織；七葉皂苷標準品(由上海源葉生物科技有限公司提供，批號：6805-41-0)，質量分數(shù)大于98%；所用化學試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

UV-2102C型紫外可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司)，KQ5200E型超聲波清洗器(江蘇昆山)，高速冷凍離心機(美國sigma公司)，電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)等。

1.3 方法

1.3.1 愈傷組織的增殖培養(yǎng)

在超凈工作臺上稱取生長旺盛、色澤淡黃的種胚愈傷組織1.0 g接種于添加2,4-D、6-BA和NAA不同激素配比的MS培養(yǎng)基上(表1)，培養(yǎng)基滅菌前pH為5.75～5.78，培養(yǎng)溫度(25±2)℃，黑暗培養(yǎng)21 d，測定細胞的鮮質量、干質量以及七葉皂苷含量，篩選出最佳培養(yǎng)基，再用篩選出的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每隔7 d測定1次細胞的鮮質量、干質量以及七葉皂苷含量。

表1 歐洲七葉樹種胚愈傷組織培養(yǎng)的不同激素配比

1.3.2 七葉總皂苷的測定

采用張新等[23]方法。

1.3.3 標準曲線的繪制

精密稱取七葉皂苷(Escin)標準品適量，加甲醇溶解配制成濃度為(4.6 mg/mL)的七葉皂苷標準品溶液。精密吸取標準品溶液5、10、20、40、60、80和100 μL，分別置于10 mL刻度試管，揮去溶劑，按文獻[23]方法操作，測定吸收值，計算回歸方程為：C=0.006A-0.0086，r=0.999，線形范圍為0～92 μg。

圖1 七葉皂苷標準曲線Fig 1 The standard curve of escin

1.3.4 樣品中七葉皂苷的提取

準確稱取愈傷組織粉末(0.05±0.0005)g，過40目篩，置于10 mL離心管中，精密加入70%乙醇1.75 mL，于超聲波清洗儀中20℃超聲提取30 min，10 000 r/min離心1 min，取上清液，沉淀中加入1.75 mL的70%乙醇，重復提取1次，離心，合并兩次所得的提取液，活性炭脫色，過濾，作為供試液，按文獻[23]方法測其七葉皂苷含量。

1.3.5 計算公式

七葉皂苷的含量(mg/g)=C×V1×V2/V3×1000W

式中：C為稀釋后提取液中七葉皂苷的濃度(μg/mL)；V1為稀釋后提取液的體積(mL)；V2為未稀釋時提取液的總體積(mL)；V3為比色時精確吸取的提取液體積(mL)；W為精確稱取的材料干粉末的質量(g)。

生長速率(g·d-1)=dX/dt(單位時間愈傷組織細胞質量的增加)

比生長速率(d-1)=1/X·dX/dt(單位質量的愈傷組織細胞在單位時間內增加的細胞質量)

七葉皂苷合成速率(mg·d-1)=dp/dt

七葉皂苷比合成速率(d-1)=1/X·dp/dt

式中：X為愈傷組織細胞量；t為時間；p為七葉皂苷含量。

1.3.6 數(shù)據分析

采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據進行分析。

2 結果與分析

2.1 植物生長調節(jié)劑對歐洲七葉樹種胚愈傷組織生長及七葉皂苷合成的影響

表2 不同激素配比對歐洲七葉樹種胚愈傷組織生長量和七葉皂苷量的影響Table 2 Effects of different hormone proportion on callus of embryos in Aesculus hippocastanum L.

不同字母表示在0.05水平差異顯著(P<0.05)

將質地疏松、長勢良好的愈傷組織接種到不同激素配比的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d，其生長量、七葉皂苷含量及愈傷組織表型均有差異(表2)。結果表明：愈傷組織在添加有0.5 mg/L 2,4-D+6 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA的培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出乳白色，質密的表型，其鮮質量和干質量的生長量均達到最大值，分別為1.563和0.113 g，七葉皂苷的含量為6.530%(圖2)；愈傷組織在添加有8 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA的培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出嫩黃色，質地疏松的表型，其鮮質量和干質量的生長量較大，分別為1.460和0.100 g，并且其七葉皂苷含量最高為8.521%；愈傷組織在添加有0.5 mg/L 2,4-D+8 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上七葉皂苷含量較大為8.070%，但其鮮質量和干質量的生長量較小，僅為0.277和0.023 g，顯著低于以上2種處理，并且愈傷組織褐變較嚴重。通過顯著性分析，在添加有0.5 mg/L 2,4-D+6 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA的培養(yǎng)基中愈傷組織生長量與添加有8 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA的培養(yǎng)基中愈傷組織的生長量沒有顯著差異，但七葉皂苷含量差異顯著。綜上所述，將添加有8 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA的培養(yǎng)基作為愈傷組織增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。

圖2 不同激素配比對歐洲七葉樹種胚愈傷組織中七葉皂苷量的影響Fig 2 Effects of different hormone proportion on escin content in embryos callus of Aesculus hippocastanum L.

2.2 歐洲七葉樹種胚愈傷組織生長與七葉皂苷合成

將質地疏松，長勢良好的愈傷組織接種到最佳增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)49 d，其生長曲線與七葉皂苷合成曲線(如圖3)顯示，愈傷組織轉接到最佳增殖培養(yǎng)基后即進入快速生長，剛轉接的7 d內未出現(xiàn)明顯的生長緩慢的現(xiàn)象，原因可能是新的培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質豐富且生長空間充足，所以此時次生代謝物產量也有所增加；0～35 d愈傷組織快速生長，鮮質量從1.023 g生長到6.193 g，干質量從0.076 g生長到0.43 g；35 d之后愈傷組織進入穩(wěn)定期。七葉皂苷含量在0～7 d內迅速增加，從8.444%增加到最大14.604%，7～14 d迅速下降到最低點為3.901%，之后再增加，含量值維持在7.65%以上，但42 d后七葉皂苷含量呈下降趨勢，原因可能是培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質缺乏，次生代謝物合成減少。綜上所述，愈傷組織培養(yǎng)35 d時達到最大生長量，而七葉皂苷含量處于較低水平，故此時是愈傷組織的最佳繼代期；愈傷組織培養(yǎng)42 d時生長量稍有下降，但七葉皂苷含量相對較高，因此此時是愈傷組織的最佳收獲期。

2.3 歐洲七葉樹愈傷組織比生長速率與七葉皂苷比合成速率

歐洲七葉樹種胚愈傷組織生長速率和比生長速率如圖4所示。由圖4可知，0～7 d內愈傷組織生長速率與比生長速率相對較低，7～35 d內愈傷組織生長速率迅速增加，35 d時達到最大值0.312 g/d，35～42 d生長速率迅速下降；7～21 d內愈傷組織比生長速率迅速增加，21～35 d內比生長速率處于較穩(wěn)定狀態(tài)，28 d時達到最大值為0.053/d，35～42 d比生長速率迅速下降，42～49 d生長速率與比生長速率稍有上升。

圖3 歐洲七葉樹種胚愈傷組織生長與七葉皂苷合成曲線Fig 3 The growth curves of Aesculus hippocastanum L. embryos callus and escin production

圖4 愈傷組織生長速率與比生長速率Fig 4 Dynamic changes of callus growth rate and specific growth rate

圖5 七葉皂苷合成速率與比合成速率Fig 5 Dynamic changes of escin synthesis rate and specific synthesis rate

歐洲七葉樹種胚愈傷組織中七葉皂苷的合成速率與比合成速率如圖5所示。由圖5可知，七葉皂苷的合成速率與比合成速率的變化趨勢相同，0～7 d內七葉皂苷合成速率與比合成速率達到最高值為8.80 mg/g/d和7.54/d，可能因為培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質充足，促進了次生代謝物的合成；7～14 d在愈傷組織細胞生長迅速時期，七葉皂苷的合成速率與比合成速率迅速下降，呈現(xiàn)負增長，可能是因為愈傷組織比生長速率增加較大，即絕對生長速度較快，減少甚至停止了次生代謝物的合成，14～21 d七葉皂苷合成速率與比合成速率迅速增加，21～35 d七葉皂苷合成速率與比合成速率又處于下降趨勢，35～42 d七葉皂苷合成速率與比合成速率處于上升趨勢，而此時愈傷組織細胞生長速率降低，可能是因為培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質減少，生長空間變小，細胞生長緩慢，促進次生代謝物的合成；42～49 d合成速率與比合成速率處于下降趨勢。

綜上推測，隨著歐洲七葉樹種胚愈傷組織細胞生長速率和比生長速率的降低，七葉皂苷合成速率和比合成速率增加；而愈傷組織生長速率和比生長速率增加時，七葉皂苷的合成速率和比合成速率變化無特定的規(guī)律。

3 結論

植物生長調節(jié)劑的配比是影響愈傷組織細胞生長量和次生代謝物產量的重要因素之一，且不同物種細胞生長量和次生代謝物產量的積累與其所依賴的植物生長調節(jié)劑配比緊密相關[24-25]。呂秀立等[26]研究發(fā)現(xiàn)高濃度的6-BA與NAA組合利于歐洲七葉樹胚性愈傷組織的誘導與增殖；Profumo等[17]研究發(fā)現(xiàn)，歐洲七葉樹胚性愈傷組織及胚狀體中七葉皂苷的含量要比種子中高很多。本實驗在12種不同激素配比的培養(yǎng)基中，選用高濃度的6-BA與不同濃度的2,4-D、NAA進行組合。歐洲七葉樹種胚愈傷組織在未添加2,4-D的培養(yǎng)基中，隨著6-BA、NAA濃度的增加，七葉皂苷含量顯著增加，表明6-BA、NAA對歐洲七葉樹種胚愈傷組織中七葉皂苷的合成具有促進作用；愈傷組織在未添加NAA的培養(yǎng)基中，隨著2,4-D濃度的增加，七葉皂苷含量變化無規(guī)律性，但愈傷組織生長量均顯著降低，表明2,4-D對七葉皂苷合成的促進作用不明顯，且高濃度的2,4-D與高濃度的6-BA組合不利于愈傷組織的增長。由此可見，在歐洲七葉樹種胚愈傷組織的增殖培養(yǎng)過程中6-BA和NAA的組合有利于提高愈傷組織生長量和七葉皂苷含量。

在利用植物細胞培養(yǎng)生產次生代謝物中，研究細胞生長規(guī)律和次生代謝物的積累規(guī)律，對提高次生代謝物產率及植物細胞培養(yǎng)的進一步放大具有重要意義[27]。本研究發(fā)現(xiàn)歐洲七葉樹種胚愈傷組織固體培養(yǎng)的周期約為35 d，在一個培養(yǎng)周期中愈傷組織細胞沒有明顯的遲滯期，直接進入快速生長期，之后進入穩(wěn)定期和衰亡期。0～35 d為快速生長期，35 d后進入穩(wěn)定期，穩(wěn)定期時間相對較長，之后進入衰亡期。經過35 d的培養(yǎng)，愈傷組織生物量達到最大，七葉皂苷含量的較大值在42 d，42 d之后七葉皂苷含量下降，原因可能是培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質缺乏，次生代謝物合成減少。因此建議選擇的最佳繼代時間是35 d，最佳收獲時間則為42 d。

利用植物細胞培養(yǎng)生產次生代謝物是解決藥用植物資源短缺的有效途徑，但次生代謝物的生產率低，成為限制該技術商業(yè)化和大規(guī)模生產的主要障礙[28]，而植物細胞培養(yǎng)中提高次生代謝產物的產量主要包括兩個方面：一是細胞生物量的提高，二是次生代謝產物積累的提高，而兩者并不總是統(tǒng)一的[29]，因此探討兩者的關系對細胞培養(yǎng)生產次生代謝物質很有必要。通過分析細胞比生長速率與次生代謝物比合成速率可得出細胞生長與次生代謝物積累的關系[30]。生長速率和比生長速率是用來確定生物或培養(yǎng)物生長速度的量度，比生長速率即愈傷組織細胞的絕對生長速度[30]，七葉皂苷比合成速率即絕對合成速度。本研究通過分析歐洲七葉樹愈傷組織比生長速率與七葉皂苷比合成速率發(fā)現(xiàn)，隨著歐洲七葉樹種胚愈傷組織細胞生長速率和比生長速率的降低，七葉皂苷合成速率和比合成速率增加；而愈傷組織比生長速率增加時，七葉皂苷的比合成速率變化無特定的規(guī)律。

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Callus culture of embryos inAesculushippocastanumL. and analysis on escin content

WANG Ming-mei, WANG Chen-yang, ZHANG Min, WANG Yi-min, LIU Zhong-hua

(College of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)

Through changing the plant growth regulators proportion of medium, the optimal medium for callus proliferation and high content of escin were obtained; the growth of callus and accumulation of secondary metabolites were preliminarily analyzed which can provide theoretical basis for the production of escin in cell culture. Results revealed that the optimal medium for callus proliferation of embryos inAesculushippocastanumL. was MS+8 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA. In the optimal medium, the best subculture period was 35 d and the best harvest time was 42 d. The callus specific growth rate and escin specific synthesis rate were analyzed, which showed that with the decrease of the callus growth rate and specific growth rate, the escin synthesis rate and specific synthesis rate was increased.

AesculushippocastanumL. embryos; callus; escin; the proportion of plant growth regulators

2016-07-25；

2016-08-11

國家自然科學基金(31470668)

王明梅，碩士，從事藥用植物及其次生代謝研究工作，E-mail:mingmeiwang@126.com

劉忠華，博士，副教授，主要從事植物生長發(fā)育及系統(tǒng)進化研究，E-mail:liuzh6@bjfu.edu.cn

Q943；Q946.83+8.4

A

2095-1736(2017)04-0053-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.04.053