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      不同結核桿菌檢測方法的臨床應用價值

      2017-08-16 04:57:16王江峰夏建新
      關鍵詞:增菌羅氏涂片

      王江峰,石 梁,夏建新

      (紅安縣人民醫(yī)院,湖北 黃岡 438400)

      不同結核桿菌檢測方法的臨床應用價值

      王江峰,石 梁,夏建新

      (紅安縣人民醫(yī)院,湖北 黃岡 438400)

      目的探討羅氏培養(yǎng)、熒光聚合酶鏈反應技術(PCR)、痰涂片試驗、增菌聚合酶鏈反應技術(PCR)四種檢測方法對結核桿菌檢測的臨床應用價值。方法選取我院2015年6月~2016年6月收治的結核病患者60例分為觀察組,將同期收治的非結核病患者40例作為對照組。采集所有患者的痰液標本先后進行羅氏培養(yǎng)、PCR技術、痰涂片試驗、增菌PCR技術檢測,記錄檢測結果,比較不同檢測方法的檢測價值。結果觀察組患者檢測結果顯示,羅氏培養(yǎng)檢出痰液標本陽性14例,陽性率為23.33%;PCR技術檢出痰液標本陽性33例,陽性率為55.00%;痰涂片試驗檢出痰液標本陽性19例,陽性率為31.67%;增菌PCR技術檢出痰液標本陽性40例,陽性率為66.67%。對照組患者檢測結果顯示,四種檢測方法對痰液標本陽性檢出率均為0。增菌PCR技術對痰液標本陽性檢出率>PCR技術>羅氏培養(yǎng)>痰涂片試驗,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論臨床檢測結核桿菌的方法眾多,增菌PCR技術、PCR技術對結核桿菌的特異性強,敏感度高,操作簡單,檢測時間短,適合作為對結核桿菌檢測的實驗室首選檢測方法。

      羅氏培養(yǎng);PCR技術;痰涂片試驗;增菌PCR技術;結核桿菌檢測

      結核病是一種因感染結核桿菌(TB)引起的慢性疾病,具有強傳染性。會侵犯主要臟器,引起肺結核、結核性胸膜炎、腎結核等多種疾病,不同發(fā)病階段的癥狀有所差異,增加了診斷難度[1]。我國是肺結核高負擔國家,結合病患者人數(shù)已經超過千萬,且25%的結核病患者具有傳染性。不僅增加了患者的痛苦,給患者及其家庭帶來了巨大的經濟壓力,還威脅他人安全,成為社會公共衛(wèi)生問題。盡早明確診斷,及時規(guī)范治療多數(shù)患者可以治愈。實驗室結核桿菌檢測方法眾多,尋找檢測特異性強,操作簡單、快捷的檢測方法是臨床關注的重點[2]。本文就增菌PCR技術、羅氏培養(yǎng)、PCR技術、痰涂片試驗對TB檢測情況進行探討,現(xiàn)報告如下。

      1 資料與方法

      1.1 一般資料

      選取我院2015年6月~2016年6月收治的60例結核病患者(觀察組)及同期收治的40例非結核病患者(對照組)。觀察組中男38例,女22例,年齡38~72歲,平均(54.6±4.1)歲。所有患者均符合中華醫(yī)學會結核病學分會關于結核病的診斷標準,患者均簽署《知情同意書》。對照組中男25例,女15例,年齡36~71歲,平均(54.3±4.0)歲,疾病類型:支氣管肺炎20例,間質性肺炎9例,細菌性肺炎5例,肺癌4例,肺膿瘍2例。

      1.2 方法

      1.2.1 檢測材料

      在患者入院后次日清晨,分別采集兩組患者的痰液標本進行TB檢測。培養(yǎng)基為本院自制的酸性改良羅氏培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基為美國Becton Dickinson公司提供的Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基+10% OADC營養(yǎng)添加劑。不同結合桿菌標準菌株由上海肺科醫(yī)院實驗室提供,結合桿菌試劑盒由博奧生物有限公司負責提供。PCR擴增試劑盒由上海生工生物工程股份有限公司提供,嚴格按照實驗室檢驗標準進行操作。

      1.2.2 檢測方法

      痰涂片、羅氏培養(yǎng):用4%氫氧化鈉將痰液標本進行液化后加入PBS,在離心機中以3000 r/min的速離心5 min,去除上清液。PBS重懸后再次離心5 min,洗滌兩次后沉淀。用PBS重懸、混勻后吸出0.1 mL,依次進行增菌PCR、羅氏培養(yǎng)、PCR、痰涂片試驗。

      PCR:將0.1 mL處理后的待檢標本進行裂解液(蛋白酶K+Chelex)提取DNA,取一直單管PCR反應管,依次加入樣品、陰性質控品、2 μL陽性質控品。在離心機中以8000 r/min的速離心10 s后放入PCR儀。PCR擴增溫度為94°C,變性5 min,94°C時變性1 min,68°C時變性1 min,72°C時變性1 min,循環(huán)35次。再72°C延伸5 min,通過PCR-ELISA鑒定擴增產物。將擴增產物加入包被有結核桿菌包被的生物素標記探針的ELISA波板上,0.1 mL/孔。在37°C溫度中孵育1小時后洗板5次,加入有鏈霉親和素標記的過氧化物酶。在37°C條件下作用15 min,洗板5次后完全去除上清液。再加入TMB顯色液0.1 mL,在37°C條件下反應10 min后加入終止液0.1 mL,通過酶標儀判定反應物在450 nm時的吸光值,記錄檢測結果。

      增菌PCR試驗:將0.1 mL處理后的待檢標本接種于1 mL血平板培養(yǎng)基,溫度為37°C,PH值維持在6.5~7.0,培養(yǎng)4~7天后判定PCR檢測結果

      1.3 統(tǒng)計學方法

      采用SPSS 13.00統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析,計數(shù)資料百分數(shù)(%)表示,采用x2檢驗;以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

      2 結 果

      2.1 不同檢測方法的檢測結果

      羅氏培養(yǎng)、痰涂片試驗、PCR技術、增菌PCR檢測除觀察組痰液標本陽性率分別為23.33%、31.67%、55.00%、66.67%;四種檢測方法對對照組痰液標本陽性率均為0;增菌PCR技術對痰液標本陽性檢出率>PCR技術>羅氏培養(yǎng)>痰涂片試驗,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

      表1 不同檢測方法的檢測結果(n,%)

      2.2 細菌學檢查與PCR、增菌PCR檢測結果對比

      觀察組60例患者細菌學檢查結果顯示涂陽培陽21例,涂陽培陰9例,涂陰培陽26例,涂陰培陰32例;7天增菌PCR檢測陽性率與細菌學檢查結果,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);7天增菌PCR檢測陽性率明顯優(yōu)于PCR,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

      表2 細菌學檢查與PCR、增菌PCR檢測結果比較 [n(%)]

      2.3 PCR的特異性、敏感性

      將HE7RV結核桿菌標準菌株調制1 mg/mL后進行稀釋,分別進行PCR、增菌PCR(4d、7d)。陰性:檢測含有TB的DNA;陽性:樣品中含有TB基因或表達產物。利用增菌PCR對牛分支桿菌、結核分枝桿菌等多種病原菌培養(yǎng)物檢測結果顯示,12中非TB檢測結果均為陰性,牛分支桿菌、結核分枝桿菌為陽性,說明PCR對結合TB的特異性、敏感性強。

      3 討 論

      我國結核病患者人數(shù)眾多,其具有傳染性的特點給患者及社會帶來了巨大的挑戰(zhàn)。TB是結核病患者的主要致病因,盡早明確患者是否存在TB對疾病的診治十分重要[3]。主要通過細菌學檢查明確患者是否存在TB感染、傳染源,細菌學檢查是臨床診斷結核病的“金標準”,對結核疾病的診斷及治療方案的選擇具有重要作用[4]。實驗室檢測TB的方法較多,不同檢測方法各具特色,尋找特異性強、敏感性強、操作簡單、準確檢出率高的檢測方法是臨床檢驗科醫(yī)師關注的重點。

      痰涂片是細菌學檢查的基本方法,操作簡單,價格低廉,當天即可獲得檢測結果[5]。明確痰細菌類型,對痰液中的細菌在不同培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),通過觀察生長情況了解細菌種類。同時能進行藥敏分析,對合理用藥提供指導意見。但是,痰涂片不能分辨活菌、死菌,且細菌數(shù)量達到5000~1000條/mL時才能顯示陽性,當細菌數(shù)量未達到上述標準時就會有假陽性結果,特異性差[6]。且多種抗酸桿菌進行痰涂片時都會著色,難以辨別TB,需要通過進一步試驗才能確診,存在明顯的缺陷。細菌學檢測對TB敏感性強,但是需要1~2月才能得出檢測結果,不適用于急診檢測患者。TB、非TB菌株在細菌學培養(yǎng)時均會生長,需要通過菌種鑒定才能明確是否存在TB,在臨床實際運用中存在明顯的不足。隨著檢驗醫(yī)學的不斷進步,PCR技術在臨床的應用得到了廣大醫(yī)務人員的肯定[7]。PCR具備分子生物診斷技術、核酸擴增技術,是生物學領域的先進檢測方法,在結核病的診斷中發(fā)揮著明顯的優(yōu)勢。具有檢測速度快,靈敏度高,特異性強的特點,TB桿菌生長速度慢,通過PCR可以迅速得出診斷結果,為患者的診治提供準確的診斷依據(jù)。

      PCR有常規(guī)PCR、增菌PCR兩種檢測方式,本文將PCR兩種檢測方法與痰涂片、羅氏培養(yǎng)對人體TB檢測情況進行對比觀察發(fā)現(xiàn),增菌PCR對觀察組痰標本陽性檢出率為66.67%,PCR對觀察組痰標本陽性檢出率為55.00%,明顯優(yōu)于痰涂片(31.67%)、羅氏培養(yǎng)(23.33%),由表1可知PCR對TB檢出率明顯優(yōu)于羅氏培養(yǎng)、痰涂片,尤其是增菌PCR對TB的陽性檢出率明顯高于其他方法,而無結核桿菌感染的對照組均未檢出陽性標本,無假陽性結果,說明PCR對TB檢出率高,特異性強[8]。將PCR、增菌PCR檢測結果與細菌學檢查結果進行對比觀察發(fā)現(xiàn),PCR兩種檢測方法對涂陽培陽、涂陽培陰、涂陰培陽檢出率幾乎達到100%,但是PCR對涂陰培陰痰液標本陽性檢出率低,僅為18.75%,增菌PCR(4d)檢出率為31.25%,增菌PCR(7d)檢出率為56.25%,說明增菌PCR檢出率明顯優(yōu)于超過PCR。

      增菌PCR在對痰液標本進行處理基礎上在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4~7天后再進行特點DNA片段擴增進行TB檢測的一種方法,對標本進行預培養(yǎng)使細菌數(shù)量增加,加入液體培養(yǎng)基后稀釋了擴增抑制物,使細菌高度表達,大大提高了陽性檢出率[9]。標本中存在活菌時通過細菌培養(yǎng)后數(shù)量會明顯增多,標本中不含活菌經過細菌培養(yǎng)后細菌數(shù)量不增加,從而保證了陽性檢出率的準確性,減少假陽性結果。由表2可知,7天增菌PCR后對涂陰培陽、涂陰培陰陽性檢出率明顯優(yōu)于4d增菌PCR、常規(guī)PCR,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。增菌PCR的液體培養(yǎng)時間比常規(guī)PCR長,但是靈敏度更強[10]。常規(guī)PCR在進行痰標本檢測時,標本中含有死菌時也會有陽性結果,影響結果的準確性。但是,通過與羅氏培養(yǎng)進行對比發(fā)現(xiàn),增菌PCR的檢測時間相對較短,而結核病患者一般病程漫長,結核菌生長速度緩慢,可以作為TB檢測的常用方法。

      綜上所述,在進行TB檢測時,PCR技術具有明顯的優(yōu)勢,能夠明確痰液標本中是否含有TB。而且,增菌PCR技術在PCR基礎上進行痰液標本培養(yǎng),大大提升了對TB的特異性、敏感性陽性檢出率高。操作簡單,受外因污染少,檢測結果準確率高,值得作為實驗室檢測TB的常用方法。

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      本文編輯:趙小龍

      R446

      B

      ISSN.2095-8242.2017.029.5677.02

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