白芍總苷對(duì)全腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究*

史晴晴杜 歡于紅梅黃 寧郭洋洋

（1.河北省廊坊市第四人民醫(yī)院，河北 廊坊 065700；2.河南省三門峽市中心醫(yī)院，河南 三門峽 472000）

·研究報(bào)告·

白芍總苷對(duì)全腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究*

史晴晴1△杜 歡2于紅梅1黃 寧1郭洋洋1

（1.河北省廊坊市第四人民醫(yī)院，河北 廊坊 065700；2.河南省三門峽市中心醫(yī)院，河南 三門峽 472000）

目的觀察白芍總苷對(duì)全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用并初探其機(jī)制。方法采用四血管夾閉20min的方法制備大鼠全腦缺血再灌注模型，白芍總苷（50、100、200mg/kg）術(shù)前30min灌胃給藥。再灌注6 h后，記錄各組大鼠翻正反射恢復(fù)時(shí)間和腦電恢復(fù)時(shí)間，檢測(cè)腦組織含水量，HE染色法觀察大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，TUNEL法觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡狀況；測(cè)定海馬組織中炎癥細(xì)胞因子含量，抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）含量。結(jié)果中、高劑量白芍總苷能夠顯著降低全腦缺血再灌注大鼠翻正反射和腦電恢復(fù)時(shí)間并降低腦組織含水量（P<0.05或P<0.01），明顯改善海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病理性改變和凋亡狀況，顯著降低凋亡指數(shù)（P<0.01），顯著降低炎癥細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）含量（P<0.05或P<0.01），顯著改善抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活性并降低MDA含量（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論白芍總苷對(duì)全腦缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，可能與其保護(hù)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元、抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。

白芍總苷 全腦缺血再灌注 細(xì)胞凋亡 炎癥 氧化應(yīng)激

局灶性腦缺血和全腦缺血是缺血性腦血管病的兩種類型，前者多由腦血管栓塞所致，而全腦缺血多與心臟驟停、休克、窒息、外科手術(shù)所致低壓低氧等有關(guān)［1-2］。及時(shí)恢復(fù)血流供應(yīng)是挽救腦缺血患者的關(guān)鍵，緊急藥物溶栓和介入手術(shù)是臨床上的常用技術(shù)手段，但血液灌流恢復(fù)后往往出現(xiàn)腦缺血損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象，即腦缺血再灌注損傷，病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致神經(jīng)元繼發(fā)性死亡的主要原因［3-4］，因此以抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷為切入點(diǎn)，研發(fā)有效抑制再灌注損傷的新型藥物或許是改善腦缺血疾病治療效果的有效途徑。白芍總苷為傳統(tǒng)中藥白芍的主要活性成分之一，具有抑制自身免疫、抗炎、抗氧化等多種活性［5］，但白芍總苷對(duì)全腦缺血再灌注損傷是否具有保護(hù)作用的研究報(bào)道尚不多見。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)制備全腦缺血再灌注大鼠模型并給予白芍總苷進(jìn)行干預(yù)治療，研究白芍總苷對(duì)全腦缺血再灌注損傷的影響并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)SD大鼠 （雌雄不限）100只，體質(zhì)量200～240 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（冀）2013-1-003。

1.2 試藥與儀器

白芍總苷膠囊（寧波立華制藥有限公司）。TUNEL試劑盒 （北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（美國(guó)CST公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶 （CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒（安徽欣樂(lè)生物技術(shù)有限公司）。

1.3 分組與給藥

將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組和白芍總苷低、中、高劑量（50、100、200 mg/kg）組，每組20只。術(shù)前30 min，白芍總苷各劑量組分別灌胃給藥，假手術(shù)組和模型對(duì)照組大鼠均給予等體積0.9%氯化鈉注射液。精確稱量適量白芍總苷加入適量0.9%氯化鈉注射液制備濃度為40mg/mL的白芍總苷溶液，并依次稀釋制備濃度為20mg/mL、10mg/mL的白芍總苷溶液；各組給藥劑量為5mL/kg。

1.4 模型制備

腹腔注射10%水合氯醛（3.0mL/kg）麻醉后，參照PulsinelliWA等［6］報(bào)道的四動(dòng)脈夾閉的方法制備全腦缺血大鼠模型，以腦電圖波幅下降到原來(lái)的1/4以下，翻正反射消失，瞳孔顏色變得灰白為全腦缺血成功標(biāo)志，缺血20 min后恢復(fù)血流灌注；假手術(shù)組行手術(shù)通路，但不做夾閉血管處理。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 記錄翻正反射和腦電恢復(fù)時(shí)間 觀察并記錄翻正反射恢復(fù)時(shí)間；通過(guò)生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng) （BL-420E型，成都泰盟科技有限公司）監(jiān)測(cè)腦電振幅，達(dá)到正常振幅的75%即可認(rèn)定為腦電恢復(fù)，記錄所需的時(shí)間。

1.5.2 腦含水量的測(cè)定 每組隨機(jī)取6只大鼠，麻醉后斷頭取腦，去除小腦和低位腦干后稱大腦組織質(zhì)量，即濕質(zhì)量 （W）；110℃恒溫烘烤48 h后稱重為干質(zhì)量（D）：腦含水量（%）=［（W-D）/W］×100%。

1.5.3 大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及凋亡狀況的觀察 每組隨機(jī)取6只大鼠，參照1.5.2的方法取大腦組織，于4%多聚甲醛溶液中固定72 h，然后行石蠟包埋、切片、展片和脫蠟水化處理，行常規(guī)HE染色后通過(guò)倒置光學(xué)顯微鏡觀察大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)；行TUNEL染色觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡狀況，每張圖片隨機(jī)選取互不重疊的5個(gè)視野并分別計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，然后計(jì)算凋亡指數(shù)（AI），AI（%）=（凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.5.4 炎癥細(xì)胞因子含量、抗氧化酶活性和MDA含量的測(cè)定 每組取剩余的8只大鼠，參照1.5.2的方法取大腦并剝?nèi)『ｑR組織，加入適量冷裂解液行研磨勻漿，離心（3000 r/min，10 min）取上清液，按ELISA試劑盒步驟處理后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定海馬組織勻漿液中炎癥細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）含量；分別按照試劑盒方法步驟處理后通過(guò)紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠翻正反射和腦電恢復(fù)時(shí)間的影響

見表1。模型對(duì)照組大鼠翻正反射和腦電均基本恢復(fù)需35min；經(jīng)中高劑量白芍總苷干預(yù)治療能夠顯著降低全腦缺血再灌注大鼠翻正反射和腦電恢復(fù)時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。模型對(duì)照組含水量較假手術(shù)組顯著升高（P<0.01）；經(jīng)中、高劑量白芍總苷干預(yù)治療能夠顯著降低全腦缺血再灌注大鼠腦組織含水量（P<0.05或P<0.01）。

表1 各組大鼠翻正反射和腦電恢復(fù)時(shí)間、腦含水量結(jié)果比較（±s）

表1 各組大鼠翻正反射和腦電恢復(fù)時(shí)間、腦含水量結(jié)果比較（±s）

與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

翻正反射恢復(fù)時(shí)間（min）腦電恢復(fù)時(shí)間（min）0.0±0.0 0.0±0.0 27.13±7.58**25.11±7.28**25.27±8.18 22.34±7.49白芍總苷中劑量組 20 78.64±0.79△腦含水量（%）假手術(shù)組 20 76.81±0.48模型對(duì)照組 20 79.87±0.81**白芍總苷低劑量組 20 79.09±1.13組別 n 21.93±7.52△18.02±6.57△△白芍總苷高劑量組 20 18.64±5.93△△15.67±5.28△△78.02±0.41△△

2.2 各組大鼠大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的影響

見圖1。假手術(shù)組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元未見異常：層次清晰（3～5層），排列整齊，形態(tài)完整，胞質(zhì)染色均勻，核膜、核仁清晰。模型對(duì)照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯異常：層次紊亂，神經(jīng)元數(shù)量減少、排列稀疏、間隙增大，胞體腫脹變形，部分神經(jīng)元胞核固縮或溶解，核仁消失等。與模型對(duì)照組比較，白芍總苷各劑量干預(yù)治療組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病變呈不同程度減輕，該藥理學(xué)作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，以白芍總苷高劑量組效果最為顯著。

圖1 各組大鼠大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)（HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響

見圖2。假手術(shù)組大鼠大腦海馬CA1區(qū)僅見少量凋亡細(xì)胞（TUNEL染色陽(yáng)性著色：細(xì)胞核黃褐色）；模型對(duì)照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組明顯增多；與模型對(duì)照組比較，白芍總苷各劑量干預(yù)組海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)呈不同程度減少，以白芍總苷高劑量組最為顯著。計(jì)算并比較各組大鼠大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)（AI）：假手術(shù)組AI為（2.7±1.1）%，模型對(duì)照組AI為（64.9±8.6）%，白芍總苷低、中、高劑量組AI分別為 （59.3±10.4）%、（41.1±6.8）%、（15.6± 3.5）%；模型對(duì)照組AI較假手術(shù)組顯著升高（P<0.01），經(jīng)中高劑量白芍總苷干預(yù)治療能夠顯著降低全腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元AI（P<0.01）。

圖2 各組大鼠大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡狀況（TUNEL染色，400倍）

2.4 各組大鼠腦組織炎癥細(xì)胞因子含量的影響 見表2。模型對(duì)照組炎癥細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）含量顯著升高（P<0.01）；經(jīng)中高劑量白芍總苷干預(yù)治療能夠顯著降低全腦缺血再灌注大鼠炎癥細(xì)胞因子含量（P<0.05或P<0.01）。

表2 各組大鼠腦組織炎癥細(xì)胞因子含量比較（nmol/L，±s）

表2 各組大鼠腦組織炎癥細(xì)胞因子含量比較（nmol/L，±s）

組別 n TNF-α假手術(shù)組 8 24.83±4.94模型對(duì)照組 8 56.18±7.09**白芍總苷低劑量組 8 50.63±6.41 IL-1β IL-6 512.78±36.69 101.48±14.17 928.13±94.03**216.27±25.69**873.47±91.72 192.79±28.64白芍總苷中劑量組 8 44.08±6.68△716.38±70.76△171.36±23.47△白芍總苷高劑量組 8 684.18±69.22△△135.17±17.80△△37.47±5.88△△

2.5 各組大鼠腦組織抗氧化酶活性和MDA含量的影響

見表3。模型對(duì)照組抗氧化酶活性較假手術(shù)組顯著降低且MDA含量顯著升高（P<0.01）；經(jīng)中高劑量白芍總苷干預(yù)治療能夠顯著提高抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活性并明顯降低MDA含量（P<0.05或P<0.01）。

表3 各組大鼠腦組織抗氧化酶活性和MDA含量比較（±s）

表3 各組大鼠腦組織抗氧化酶活性和MDA含量比較（±s）

組別 n假手術(shù)組 8模型對(duì)照組 8白芍總苷低劑量組 8 SOD（U/mg）CAT（U/mg）173.27±8.86 5.10±1.42 139.15±8.22**2.71±1.04**144.02±8.60 3.04±1.17白芍總苷中劑量組 8 148.57±9.02△3.54±1.54△白芍總苷高劑量組 8 156.68±9.32△△4.01±1.68△△GSH-Px（U/mg）MDA（μmol/g）20.41±4.08 16.76±3.49 9.79±2.73**30.73±4.28**11.28±3.47 26.41±4.08 12.58±3.21△19.77±3.86△15.11±3.96△△17.46±3.17△△

3 討 論

芍藥分為赤芍和白芍，均來(lái)源于毛茛科芍藥屬植物的干燥根［7-8］，二者功能主治與臨床應(yīng)用具有一定的差異［9］。但既往王飛等［10］和徐紅梅等［11］研究發(fā)現(xiàn)，赤芍和白芍均能通過(guò)提高體內(nèi)一氧化氮（NO）并降低內(nèi)皮素（ET）含量而對(duì)血瘀大鼠血液流變學(xué)異常具有良好的改善作用，楊煜等［12］發(fā)現(xiàn)白芍總苷縮短大鼠體外血栓長(zhǎng)度，改善血瘀大鼠血液黏度的藥理學(xué)作用與赤芍總苷類似，并且白芍對(duì)血小板聚集功能的作用優(yōu)于赤芍［13］。白芍總苷為白芍的主要活性成分，具有多種生物學(xué)活性，但白芍總苷對(duì)全腦缺血再灌注損傷是否具有保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)參照的PulsinelliWA等［6］報(bào)道的四動(dòng)脈夾閉法是目前國(guó)際公認(rèn)的全腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭苽浞椒ㄖ唬?4］，該方法制備的動(dòng)物模型病理與人腦急性缺血性病變接近，且重復(fù)性強(qiáng)、成功率高。腦組織是對(duì)缺血缺氧最為敏感的器官，阻斷血流后幾分鐘即可出現(xiàn)無(wú)氧酵解而大量生成乳酸，導(dǎo)致酸中毒，其中海馬是對(duì)腦缺血最敏感的區(qū)域之一，而海馬CAl區(qū)的錐體細(xì)胞層最為敏感［15］，所以本研究選擇大腦海馬CA1區(qū)為觀測(cè)區(qū)域。炎癥細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）是臨床上監(jiān)測(cè)炎癥反應(yīng)的常用指標(biāo)。正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)生產(chǎn)的氧自由基（ROS）在SOD和CAT、GSH-Px的催化作用下最終被還原為對(duì)人體無(wú)害的H2O和O2［16-17］；不飽和脂肪酸是細(xì)胞膜的主要組成之一，極易被ROS攻擊而氧化最終生成MDA，因此MDA的含量水平能夠間接反應(yīng)機(jī)體氧化應(yīng)激損傷程度［18］。

本研究結(jié)果顯示，中高劑量白芍總苷干預(yù)治療能夠顯著降低全腦缺血再灌注大鼠翻正反射恢復(fù)時(shí)間和腦電恢復(fù)恢復(fù)時(shí)間、降低腦組織含水量、抑制海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病變并抑制其凋亡；降低海馬組織炎癥細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）含量，改善抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活性并降低MDA含量；提示白芍總苷對(duì)全腦缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與白芍總苷保護(hù)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元、抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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Protective Effect of Total G lucosides of Paeony on Global Cerebral Ischem ia-reperfusion Injury

SHIQingqing，DU Huan，YU Hongmei，et al. The Fourth People's Hospital of Langfang，Hebei，Langfang 065700，China.

Objective：To study the protective effect of total glucosides of paeony on cerebral ischemia reperfusion injury in rats and explore itsmechanism.Methods：A ratmodel of global cerebral ischemia reperfusion was prepared by clamping four vesselswith 20min.Total glucosides of paeony（50，100，200mg/kg）were administered by intragastric administration 30 min before operation.Six hours after of reperfusion，the recovery time of righting reflex and the recovery time of EEG were recorded，and the water content of brain tissue wasmeasured.HE stainingmethod was used to observe themorphological changes of neurons in CA1 region of hippocampus.The apoptosis of hippocampal CA1 neurons was observed by TUNEL，and the content of inflammatory cytokines，the activity of antioxidant enzymes and the content of malondialdehyde（MDA）in hippocampus were measured.Results：100，200 mg/kg total glucosides of paeony can significantly reduce the righting reflex and the recovery time of brain electricity and reduce the water content of brain tissue in rats with global cerebral ischemia and reperfusion（P<0.05 or P<0.01）；it could obviously improve the pathological changes and apoptosis of neurons in CA1 region of hippocampus，and significantly reduce the apoptotic index（AI）（P<0.01）；it significantly reduced the levels of inflammatory cytokines（IL-1β、IL-6、TNF-α）（P<0.05 or P<0.01）；it significantly improved antioxidant enzymes（SOD，CAT，GSH-Px）activity and decreased MDA content（P<0.05 or P<0.01）.Conclusion：Total glucosides of paeony have a protective effect on global cerebral ischemia reperfusion injury，whichmay be related to the protection of neurons in the hippocampal CA1 region and the inhibition of oxidative stress and inflammatory response.

The total glucosides of paeony；Global cerebral ischemic-reperfusion；Apoptosis；Inflammation；Oxidative stress

R285.5

A

1004-745X（2017）07-1172-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.012

2017-04-27）

河北省廊坊市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2016013151）

△通信作者（電子郵箱：lfsysqq@163.com）