慶大霉素暴露對(duì)小鼠腎臟與耳蝸功能損傷效應(yīng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系研究

孫克冰柳柯

1北京大學(xué)航天中心醫(yī)院腎內(nèi)科

2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科

·基礎(chǔ)研究·

慶大霉素暴露對(duì)小鼠腎臟與耳蝸功能損傷效應(yīng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系研究

孫克冰1柳柯2

1北京大學(xué)航天中心醫(yī)院腎內(nèi)科

2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科

目的觀察氨基糖甙類藥物慶大霉素進(jìn)入小鼠腎臟和耳蝸毛細(xì)胞在時(shí)間和數(shù)量上的特點(diǎn)及腎功能和聽功能損害情況。方法將18只6周齡的C57小鼠隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組（contr）、用藥后1天組（d1）、用藥后7天組（d7），每組6只動(dòng)物。置備完成的TexasRed標(biāo)記慶大霉素（GTTR）以100mg/kg濃度腹腔注射小鼠，1次/天，通過激光共聚焦顯微鏡觀察熒光標(biāo)記慶大霉素在各組小鼠耳蝸毛細(xì)胞和腎臟組織積蓄情況，采用Image-Pro Plus軟件測算標(biāo)本熒光強(qiáng)度值，并進(jìn)一步估算各標(biāo)本慶大霉素?cái)z取情況。同時(shí)，通過生化檢測和聽力檢測，觀察用藥后小鼠腎功能和聽功能損害情況。結(jié)果小鼠標(biāo)本熒光強(qiáng)度（OD）值測算結(jié)果：用藥后1天，小鼠腎臟組織中慶大霉素即達(dá)到了高水平，P<0.01；與此同時(shí)，小鼠耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)雖然檢測到明顯的紅色熒光，但是其OD值要明顯低于腎臟組織。用藥后7天，腎臟組織和耳蝸毛細(xì)胞的OD值均比對(duì)照組有極為顯著的升高（P<0.01）。對(duì)小鼠腎功能和聽力的檢測顯示，用藥后1天小鼠血液中BUN和Scr水平即有明顯升高，表明此時(shí)腎功能已受到損害；而用藥后1天小鼠ABR閾值和對(duì)照組相比卻未見顯著升高（P>0.05），表明此時(shí)聽力損害尚未顯現(xiàn)。在用藥后7天，小鼠BUN、Scr和ABR閾值水平和對(duì)照組相比均有顯著改變（P<0.01）。結(jié)論和腎功能損害相比，慶大霉素對(duì)小鼠聽覺損害具有時(shí)間上的滯后效應(yīng)，而這種時(shí)間上的延遲反應(yīng)為聽力損害的臨床干預(yù)提供了可能。

慶大霉素標(biāo)記；TexasRed；小鼠；腎臟功能；聽功能；

Supporting grants:Thiswork was supported bythe NationalNatural Science Foundation of China(NSFC;31040038),Beijing NaturalScience Foundation(5122040),thegrants from the China Postdoctoral Science Foundation(201003779,20100470103).

Competing InterestStatements:Theauthorsdeclareno competing interests.

在藥物引起的腎功能損害中，由氨基糖苷類藥物引起的腎臟毒性發(fā)病率仍占有相當(dāng)比例。氨基糖苷類藥物引起的腎損害主要為急性腎小管-間質(zhì)損壞，是以腎小管壞死、變形為主的腎臟功能下降。由于腎臟功能受到破壞導(dǎo)致腎小球?yàn)V過率下降，大量代謝產(chǎn)物儲(chǔ)留，從而引起體內(nèi)出現(xiàn)一系列病理反應(yīng)，對(duì)全身各個(gè)器官造成不同的損傷。近年來人們注意到，在氨基糖苷類藥物引起的腎功能損害過程中，患者聽功能也常伴有不同程度的損害，表明此類藥物對(duì)腎臟和耳蝸兩種器官的損害具有一定的關(guān)聯(lián)性[1,2]。然而，目前尚沒有氨基糖苷類藥物對(duì)上述兩種器官損害之間相互關(guān)系的報(bào)道。本研究中，我們采用帶熒光標(biāo)記的慶大霉素對(duì)成年C57小鼠進(jìn)行腹腔注射，分別在用藥后前、用藥后1天和7天觀察腎臟組織和耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)慶大霉素的攝取量，同時(shí)檢測上述時(shí)間點(diǎn)上動(dòng)物的腎功能和聽力水平，從而明確慶大霉素在上述兩種器官內(nèi)的攝取情況以及對(duì)器官功能的損害，并比較兩者在時(shí)間上的前后關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及藥物暴露

實(shí)驗(yàn)采用鼠齡6周的C57小鼠,雌雄不限，體重分布在15～17g，購自維通利華公司。動(dòng)物入組要求聽力及腎臟功能正常。動(dòng)物隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、用藥后1天和7天組。每組各6只，共計(jì)18只（36個(gè)耳蝸及腎臟器官）。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物采用100mg/ kg劑量慶大霉素腹腔注射，對(duì)照組采用相同體積生理鹽水腹腔注射。本實(shí)驗(yàn)操作和動(dòng)物使用方案得到首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本獲取

1.2.1 腎臟組織、尿液、血液標(biāo)本

分別收集對(duì)照組、用藥后1天組和7天組動(dòng)物尿液，在獲取腎組織時(shí)先于腹主動(dòng)脈收集血液標(biāo)本。生理鹽水灌流腎臟后取腎組織，保存于-80°C冰箱，4%多聚甲醛固定以制作切片。尿素氮（BUN）檢測試劑盒和肌酐（Scr）檢測試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司），全自動(dòng)生化分析儀（美國泰爾康公司）。

1.2.2 耳蝸基底膜制備

頸椎脫臼法處死小鼠，斷頭后取出顳骨，迅速分離耳蝸，開放圓窗和卵圓窗，用細(xì)針在蝸尖鉆孔，4%多聚甲醛經(jīng)圓窗、卵圓窗進(jìn)行灌流，于4%多聚甲醛中固定過夜。解剖顯微鏡下于0.1mM PBS液中從底回剝除蝸殼，分離耳蝸基底膜頂回，清除前庭膜及蓋膜

1.3 慶大霉素-TexasRed結(jié)合物

含有慶大霉素的溶液（慶大霉素干粉購自Sig?ma,MO,USA，干粉溶解于100mM K2CO3中，形成終濃度50mg/m l濃度的溶液）與Texas Red（得克薩斯紅，購自Molecular Probes,OR,USA）在4°C條件下充分混合反應(yīng)數(shù)日，混合物經(jīng)過純化，去除未結(jié)合的慶大霉素和Texas Red,得到實(shí)驗(yàn)用慶大霉素-Texas Red結(jié)合物（GTTR）。在實(shí)驗(yàn)中用4.4m l慶大霉素溶液（50mg/m l）和0.6mlTexas Red ester (TR)混合形成最終300：1比例（GT:GTTR）的混合液用于本實(shí)驗(yàn)中慶大霉素的熒光標(biāo)記[3-5]。

1.4 聽功能測試

聽功能測試采用Wu等人測試方法[6]。對(duì)照組和用藥后1天組、7天組動(dòng)物行雙耳ABR閾值測試（Click），重復(fù)率20次／秒，記錄ABR，平均疊加次數(shù)1024，掃描時(shí)間10ms，濾波帶寬80-3000 Hz。記錄電極置于顱頂，參考電極置于刺激側(cè)耳垂，地線接鼻尖，耳機(jī)距小鼠外耳道口3厘米。

1.5 激光共聚焦顯微鏡成像

將耳蝸基底膜鋪片置于激光共聚焦顯微鏡（Leica TCSSP2 AOBS，德國）下，60×油浸物鏡觀察，所選擇的藍(lán)色和紅色激發(fā)光波長分別為488nm和567nm。對(duì)所觀察區(qū)域的內(nèi)毛細(xì)胞從上而下進(jìn)行掃描，分別對(duì)標(biāo)本的各層圖像進(jìn)行連續(xù)觀察。本實(shí)驗(yàn)中，小鼠耳蝸標(biāo)本掃描層距為2.0μm，小鼠腎臟切片標(biāo)本激光共聚焦顯微鏡觀察方法與前述基本相同，腎臟組織切片掃描層距亦設(shè)為2.0μm。標(biāo)本熒光標(biāo)記強(qiáng)度（OD）計(jì)算：本研究采用Image-Pro Plus software包來計(jì)算標(biāo)本熒光強(qiáng)度值[7]。首先測算儀器紅色熒光的最大強(qiáng)度值并將該數(shù)值設(shè)定為1.0[8-10]，之后將測得的各標(biāo)本數(shù)值與該最大強(qiáng)度值比較（標(biāo)本熒光強(qiáng)度值/熒光強(qiáng)度最大值），得到各組標(biāo)本熒光強(qiáng)度相對(duì)值，本實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)標(biāo)本均在相同倍數(shù)物鏡下隨機(jī)取3個(gè)相同大小視野測算其OD值[10]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠耳蝸毛細(xì)胞和腎臟組織攝入慶大霉素的比較

本實(shí)驗(yàn)采用紅色熒光標(biāo)記慶大霉素，在小鼠經(jīng)腹腔注射藥物到達(dá)腎臟和耳蝸兩個(gè)器官后，通過激光共聚焦顯微鏡下可以觀察紅色熒光的分布和強(qiáng)度，進(jìn)而可以估算藥物進(jìn)入上述器官的情況。本研究中，對(duì)照組耳蝸和腎臟組織中幾乎未見紅色熒光，而在用藥后7天，小鼠耳蝸毛細(xì)胞和腎臟組織中均可見較強(qiáng)的熒光（圖1）。

圖1 慶大霉素在小鼠腎臟組織和耳蝸毛細(xì)胞的蓄積情況對(duì)比Fig.1 Comparisons of accumulated gentam icin in cochlearhair cellsand renal tissueofmice.圖1左上圖為對(duì)照組小鼠耳蝸毛細(xì)胞的慶大霉素?zé)晒鈽?biāo)記情況，圖中顯示幾乎沒有紅色熒光出現(xiàn)，白色箭頭指示為內(nèi)毛細(xì)胞，標(biāo)尺：10um；左下圖為用藥后7天耳蝸毛細(xì)胞熒光標(biāo)記慶大霉素的情況，可見在外毛細(xì)胞、內(nèi)毛細(xì)胞區(qū)域有明顯的紅色熒光出現(xiàn)。右上圖為對(duì)照組小鼠腎臟組織切片，圖片中無紅色熒光出現(xiàn)，白箭頭指示為腎小管，短箭頭指示了腎小管上皮細(xì)胞。右下圖為小鼠用藥7天后的腎臟組織標(biāo)本，圖中顯示紅色熒光標(biāo)記的慶大霉素大量積蓄于腎臟組織。Fig.1 Upper left panel shows negative uptake of gentam icin in cochlear hair cells of controlmice.White arrow indicates inner hair cells(IHC),bar:10um;Lower left panel show s a representative image of fluorescent gentamicin accumulated in cochlear hair cells at d7 after treatment.Red fluorescent can be found significantly at all hair cells.Upper right panel shows negative uptake of gentamicin in renal tissue of control m ice,white arrow indicates renal tubule and arrowhead indicates renal tubular epithelial cells,lower right panel shows a dramatic increase of uptake of gentam icin in renal tissue of miceatd7 after treatment.

采用此方法，我們分別獲得了對(duì)照組、用藥后1天和用藥后7天各組的OD值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物在用藥后1天即在腎臟組織中出現(xiàn)較高的積蓄量(P< 0.01)，用藥7天后積蓄量進(jìn)一步升高（表1）。

表1 熒光標(biāo)記慶大霉素在小鼠腎臟中的蓄積量Table1 Accumulation of fluorescentgentam icin in renal tissue ofmice

我們采樣同樣方法分別檢測小鼠耳蝸毛細(xì)胞攝取慶大霉素的情況，結(jié)果顯示在用藥后1天耳蝸毛細(xì)胞的OD值也有明顯升高，但是熒光強(qiáng)度的均值遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及相同時(shí)間點(diǎn)腎臟組織內(nèi)的水平，說明藥物進(jìn)入腎臟組織的速度和強(qiáng)度均明顯高于耳蝸組織。用藥后7天，小鼠耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積量顯著提升，但是仍不及相同時(shí)間點(diǎn)腎臟組織的藥物蓄積程度（表2）。

表2 熒光標(biāo)記慶大霉素在小鼠耳蝸毛細(xì)胞區(qū)域中攝取量Table2 Uptakeof fluorescentgentamicin in cochlear hair cellsofm ice.

2.2 用藥后小鼠腎臟功能與耳蝸功能評(píng)估

我們分別檢測對(duì)照組、用藥后1天組和用藥后7天組小鼠腎臟功能的血液標(biāo)本BUN和Scr的水平，結(jié)果顯示，用藥后1天小鼠血液標(biāo)本中上述指標(biāo)水平即明顯升高，用藥后7天，小鼠上述指標(biāo)進(jìn)一步升高（表3）。

表3 慶大霉素對(duì)小鼠腎功能的影響(mmoL/L)Table 3 Gentam icin induced functionaldisruption of kidneyinmice(mmoL/L)

在使用慶大霉素前后的各時(shí)間點(diǎn)我們也檢測了小鼠聽力水平，結(jié)果顯示用藥后1天小鼠ABR閾值和對(duì)照組相比并無顯著升高（表4，P>0.05）；用藥后第7天，可以檢測到ABR閾值的顯著增高（表4，P<0.05），本結(jié)果說明，和腎功能損害相比，小鼠聽功能損害出現(xiàn)的時(shí)間相對(duì)延遲。

表4 慶大霉素對(duì)小鼠聽力的影響（Click,dBSPL）Table 4 Gentam icin induced hearing impairment inm ice (Click,dB SPL)

3 討論

慶大霉素等氨基糖苷類藥物是引起腎損害的常見原因之一，然而其毒理作用尚未完全明確。有研究報(bào)道，在藥物引起的急性腎功能損害中，由氨基糖苷類藥物引起的腎臟毒性發(fā)病率仍然較高[11]。氨基糖苷類藥物引起的腎損害主要為腎小管-間質(zhì)損壞，以腎小管損害為主。當(dāng)腎功能受損時(shí)，血液中BUN水平升高，如果損害進(jìn)一步加重，Scr水平也隨之上升。這種損害的程度和腎臟組織攝入慶大霉素的速度和量有直接關(guān)系[12]。關(guān)于慶大霉素的腎臟毒性機(jī)制，有研究認(rèn)為可能通過使組織氧化活性產(chǎn)物增加而引起了腎組織損害[13]。對(duì)于慶大霉素?fù)p害小鼠聽力的機(jī)制已有較多研究，目前的研究結(jié)果涉及耳蝸內(nèi)多個(gè)部位，包括毛細(xì)胞纖毛、毛細(xì)胞本身、以及聽神經(jīng)的損害等，在這些損害發(fā)生時(shí)往往導(dǎo)致了聽力的下降[2,14-17]。有研究討論了這種損傷條件對(duì)耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞下部傳入神經(jīng)突觸的影響，認(rèn)為這可能是氨基糖苷類抗生素?fù)p害聽力的另外一個(gè)部位[18]。進(jìn)一步的研究證明耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸更易受到氨基糖類抗生素的影響，進(jìn)而導(dǎo)致突觸可塑性的變化，導(dǎo)致聽力受損[19-22]。

本研究結(jié)果表明，在使用慶大霉素腹腔注射后第1天，小鼠腎臟組織攝取的標(biāo)記慶大霉素藥物即達(dá)到了很高水平。相比較而言，耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞盡管也有明顯的慶大霉素積蓄，但是程度上尚不及腎臟組織的水平，這表明慶大霉素對(duì)腎臟組織和腎功能的影響具有‘時(shí)間早、程度重’的特點(diǎn)。這可能與耳蝸器官和全身血液循環(huán)之間存在血迷路屏障結(jié)構(gòu)有關(guān)，這種屏障結(jié)構(gòu)的存在延遲和減少了耳毒性藥物進(jìn)入內(nèi)耳的速度和數(shù)量。另一方面，本研究結(jié)果同時(shí)也說明，在應(yīng)用慶大霉素后1天，動(dòng)物耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞就出現(xiàn)了明顯的藥物蓄積，盡管此時(shí)ABR閾值尚未出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的升高，但是聽覺感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損害可能已經(jīng)發(fā)生。本研究中，小鼠在藥物使用后第7天聽力水平顯著損害，說明慶大霉素對(duì)小鼠聽功能的損害在藥物使用后存在一個(gè)持續(xù)增強(qiáng)的過程。本研究中使用的動(dòng)物為C57小鼠，這種小鼠有年齡相關(guān)性聽力損失現(xiàn)象[6,17]，但是本研究中小鼠為6周鼠齡的動(dòng)物，衰老因素尚不能對(duì)本研究結(jié)果造成影響。

本研究一個(gè)顯著的特點(diǎn)是同時(shí)對(duì)慶大霉素進(jìn)入小鼠腎臟和耳蝸的速度及數(shù)量進(jìn)行了標(biāo)記和比較，我們發(fā)現(xiàn)慶大霉素腎功能損害的時(shí)間要先于聽功能損害，這似乎可以理解為慶大霉素對(duì)小鼠聽覺損害有一定的滯后效應(yīng)，這種時(shí)間上的延后期也可能為臨床治療和干預(yù)保留了機(jī)會(huì)。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)尚未涉及此種條件下聽功能保護(hù)或治療的研究，更進(jìn)一步的研究結(jié)果還需要在今后的實(shí)驗(yàn)中去探索和挖掘。

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An ExperimentalStudy of Correlations Between Gentam icin Induced Renal Trauma and Hearing Impairment

SUN KeBing1,LIU Ke2
1DeaprtmentofNephrology,AerospaceCenter Hospitalof Beijing
2DepartmentofOtolaryngology,Head and Neck Surgery,Beijing Friendship Hospital,CapitalMedicalUniversity

SUNKeBing,Email:sunkebing1978@163.com;

ObjectiveTo explore time and quantity properties of Texas Red labeling gentam icin entry into renal tissue and cochlear hair cells inm ice,aswellas secondary renal injury and hearing loss.M ethods18 adultC57m ice(6 wksold)were random ly divided into three groups.Two groups

daily intraperitoneal injection of gentamicin labeled w ith Texas Red at 100mg／kg for 1 and 7days,respectively.The third group only received the same volume of 0.9%saline for control.Laser confocalobservations combined w ith Image-Pro Plus softwarewere employed to estimate time and quantity of uptake gentamicin in both renal tissue and cochlear hair cells.Further,BUN,Scr,and auditory brainstem responses(ABR)threshold were examined to estimate the functional state of kidney and cochlea after gentamicin exposure.ResultsSignificant increase of OD value at d1was found in renal tissue compared w ith thatof control (P<0.01);Significant,but lower increase of OD value atd1 was identified in cochlear hair cells compared w ith control(P<0.05);Sim ilar remarkable enhancement of OD were found at d7 in both renal tissue and cochlear hair cells.Moreover,significant increase of BUN and Scrwere detected at d1(P<0.05),however,no significantABR(click)threshold elevation was found at d1 after treatment(P<0.05).Dramatic increases of BUN,Scr,and ABR threshold have been found at d7 compared w ith controls(P<0.01).ConclusionsAm inoglycoside induced hearing impairment showed delay reaction compared w ith am inoglycoside induced rapid injury in renal tissue.The time delaymay provide a possibility of clinical invention foram inoglycoside induced hearing loss.

Labeling Gentamicin;TexasRed;M ice;Renal Function;Hearing Function;

R764

A

1672-2922（2017）03-334-5

2017-04-25審核人：郭維維）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.03.012

國家自然科學(xué)基金（31040038）、北京市自然基金（5122040）、中國博士后科學(xué)基金（201003779,20100470103）

孫克冰，本科，主治醫(yī)師，研究方向:腎病的發(fā)生機(jī)制和干預(yù)

孫克冰和柳柯為并列第一作者

孫克冰，Email:sunkebing1978@163.com