錦鯉胚胎發(fā)育過程中幾種代謝酶活性及丙二醛含量的變化

史東杰 梁擁軍 饒青 朱莉飛 張升利

摘要：以錦鯉胚胎為研究對象，分別在受精初期、卵裂期、囊胚期、原腸期、胚體及器官形成期、出膜前期取樣，測定魚卵受精初期及胚胎發(fā)育不同時期超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性及丙二醛含量。結果顯示，錦鯉魚卵受精初期超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性及丙二醛含量均較低，隨著胚胎發(fā)育，酶活性及丙二醛含量均呈現(xiàn)上升趨勢。當發(fā)育至原腸期時，酶活性及丙二醛含量均顯著升高（P<0.05）；當胚胎發(fā)育至出膜前期時，酶活性及丙二醛含量繼續(xù)上升，且顯著高于以前各時期（P<0.05）。此時期，超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）活性及丙二醛（MDA）含量分別為受精初期的1.78、3.62、23.41、1.92倍。

關鍵詞：超氧化物歧化酶；磷酸酶；丙二醛；胚胎發(fā)育；錦鯉

中圖分類號： S917文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）11-0120-03[HS）][HT9.SS]

魚類在殼內的發(fā)育階段稱為胚胎發(fā)育，該階段是魚類個體發(fā)育最為關鍵的時期。在魚類早期發(fā)育生物學中，通常將魚類的胚胎發(fā)育分為受精期、卵裂期、囊胚期、原腸期、胚體及器官形成期、出膜前期等多個時期。魚類的細胞分化和組織、器官發(fā)育等均在胚胎發(fā)育過程中開始發(fā)生，因此魚類胚胎發(fā)育過程中生理代謝十分活躍[1]。同時，整個胚胎發(fā)育過程中只有卵殼的保護，易受到外界環(huán)境的破壞，因此需要較強的抗菌和免疫能力。酶是機體活細胞產生的一種生物催化劑，生命活動中的各類代謝化學反應、免疫反應均為酶促反應，因而特定酶的催化能力代表了機體特定動能的發(fā)育情況。超氧化物歧化酶（SOD）是一種重要的抗氧化酶，是機體清除超氧陰離子自由基的首要物質，它可對抗和阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并可及時修復和保護細胞。酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）是非特異性磷酸單酯水解酶，分別在酸性和堿性環(huán)境下起催化作用，在動物DNA、RNA、蛋白質、脂類及機體免疫等代謝過程中起著重要的調控作用。丙二醛（MDA）含量通常被認為可反映機體脂質過氧化程度的指標，并具有毒性。因此，SOD、ACP、AKP這3種酶活性及MDA含量的變化可以反映動物機體生理生態(tài)變化、免疫機能及健康狀況[2-5]。本研究以錦鯉（Cyprinus carpio L.）為研究對象，旨在通過研究錦鯉胚胎發(fā)育過程中SOD、ACP、AKP這3種酶活性及MDA含量的變化規(guī)律，探討魚類胚胎發(fā)育過程和代謝調控機理。

1材料與方法

1.1受精卵采集

通過人工催產、干法受精，獲得受精卵，隨機分為3組，約1 000粒/組，置于含有500 mL試驗用水的培養(yǎng)皿（直徑 20 cm，高3 cm）中孵化。魚卵剛受精時立即取樣，然后用顯微鏡連續(xù)觀察受精卵，在以下各取樣點進行取樣，取樣點分別為：受精初期、卵裂期、囊胚期、原腸期、胚體及器官形成期、出膜前期，每個取樣點采集魚卵或胚胎約100粒（個）/皿，用濾紙吸干水，置于離心管中，-80 ℃保存待測。試驗用水為經過曝氣的自來水，水溫為（18±1）℃，pH值7.4，溶解氧≥5 mg/L，每24 h換水約1/2。胚胎發(fā)育過程中，及時清除未受精卵、死卵及異常發(fā)育的胚胎。

1.2樣品制備與測定

樣品制備參照孔祥會等的方法[6]進行。粗提液蛋白定量參照Bradford的測定方法[7]進行，標準蛋白為牛血清白蛋白（BSA，購于AMRESCO公司）。超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）的活性及丙二醛（MDA）的含量，均采用北京澳聯(lián)雅實驗設備中心的試劑盒進行，具體測定方法參照試劑盒說明書。

1.3數據統(tǒng)計與分析

試驗數據用平均值±標準差（x[TX-*5]±s）（n=6，3個平行，2個重復）表示。采用SPSS 17.0軟件進行數據統(tǒng)計和分析，用多重比較法進行組間差異顯著性分析，顯著水平為0.05。

2結果與分析

在顯微鏡下觀察，水溫為（18±1）℃、pH值為7.4、DO（溶氧量）≥5 mg/L 等的條件下，受精卵在受精192 min發(fā)育至16胞期，305 min發(fā)育至囊胚晚期、1 263 min發(fā)育至原腸晚期、2 418 min 發(fā)育至心跳形成期、3 512 min發(fā)育至出膜前期。試驗過程中，各取樣點涵蓋了胚胎發(fā)育從受精至剛孵化出仔魚整個過程。

2.1超氧化物歧化酶活性的變化

由圖1可知，錦鯉胚胎發(fā)育過程中SOD活性變化呈現(xiàn)出上升的趨勢。在受精初期，SOD的活性最低，為（48.252±2.43）U/mg；發(fā)育至囊胚期、原腸期時分別為（50.309±2.14）、（53.251±2.32）U/mg，差異不顯著（P>0.05）；由原腸期經胚體及器官形成期，至出膜前期SOD活性顯著上升（P<0.05），在出膜前期達到最高，為（85.981±3.25）U/mg，為受精初期的1.78倍。

2.2酸性磷酸酶、堿性磷酸酶的活性變化[JP2]

由圖2可知，錦鯉胚胎發(fā)育過程中ACP、AKP活性的變化均呈現(xiàn)出上升趨勢，并具有協(xié)同性。[JP]在受精初期，ACP、AKP的活性最低，分別為（1.158±0.024）、（0.026±0.013）U/g；[JP]當發(fā)育至原腸期時，酶活性明顯增強，分別為（2.679±0031）、（0.042±0.005） U/g，[CM（12*2]與之前各時期相比差異顯著[CM）]

（P<0.05）；當發(fā)育至胚體及器官形成期時，ACP、AKP的活性分別上升至（2.738±0.025）、（0.048±0.008）U/g，但與原腸期相比差異不顯著（P>0.05）；當發(fā)育至出膜前期時，酶活性繼續(xù)上升，且顯著高于以前各個時期（P<0.05），此時期ACP、AKP的活性分別為受精初期的3.62、23.41倍。

2.3丙二醛含量的變化

由圖3可知，錦鯉胚胎發(fā)育過程中MDA的含量呈現(xiàn)出逐漸增多的趨勢。受精初期MDA含量最低，為（8.023±0.42）nmol/mg，從受精初期發(fā)育至卵裂期、囊胚期MDA含量無顯著性變化（P>0.05）；當發(fā)育至原腸期時MDA含量為（10.295±0.56）nmol/mg，顯著增多（P<0.05）；當發(fā)育至出膜前期時，MDA含量繼續(xù)上升至（15.436±0.81）nmol/mg，且顯著高于以前各個時期（P<0.05），為受精初期的192倍。

3討論

胚胎發(fā)育過程中各種酶的作用極為復雜，其活性變化也受到多種因子的影響，尤其是胚胎發(fā)育后期要經歷神經管、脊索、肌節(jié)、尾芽、心臟等的形成。同時，胚胎運動、胚胎孵化等均需要大量的生理代謝和信息傳導。在本研究中，超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性在錦鯉胚胎發(fā)育過程中持續(xù)協(xié)同增加，主要是滿足胚胎發(fā)育的需要。

Swain等認為魚類主要通過卵子母源性抗體傳遞給子代[8-9]。并有研究顯示，生命早期發(fā)育過程中免疫力也可由自身的合子基因表達[10]。熊鏵龍等在研究普安銀鯽（Carassius auratus）胚胎發(fā)育中，抗氧化酶活性變化時，發(fā)現(xiàn)在普安銀鯽早期發(fā)育中，超氧化物歧化酶在成熟卵子中就具有活性，說明普安銀鯽胚胎發(fā)育中超氧化物歧化酶是由母體傳遞而來，并非胚胎合子基因的合成[11]。Kumano等對海鞘（Halocynthia roretzi）胚胎中堿性磷酸酶活性的研究顯示，胚胎中雖然含有少量母源性堿性磷酸酶，但是在胚胎內胚層發(fā)育時堿性磷酸酶主要來源于堿性磷酸酶基因的表達[12]。在本研究中，首次取樣點為受精初期，即在魚卵剛受精時立即取樣，可見樣品中應含有受精卵和成熟卵子，通過生化測定超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶均具有活性，因為剛受精立即取樣，胚胎合子基因還未進行充分的表達、合成，所以初步判斷錦鯉胚胎發(fā)育過程中超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶可由母體帶來，屬于母源性酶類。隨著錦鯉胚胎的持續(xù)發(fā)育，以上3種酶活性逐漸增加，這種變化趨勢與王書平等對金魚（Carassius auratus）胚胎[13]、孔祥會等對金魚胚胎[14]、熊鏵龍等對普安銀鯽的研究[11]基本相似。在本研究中，以胚胎發(fā)育至原腸期為節(jié)點，除超氧化物歧化酶外，其余2種酶活性均顯著上升（P<0.05），是否有合子基因開始表達，還有待進一步研究。當胚胎發(fā)育至出膜前期時，酶活性繼續(xù)上升，且顯著高于以前各個時期（P<0.05），此時期超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性分別為受精初期的1.78、3.62、23.41倍，這時可能是有合子基因表達參與代謝的結果。因為在胚胎發(fā)育至出膜前期時，卵黃囊中貯存的蛋白質、脂質等營養(yǎng)物質已經基本耗盡，這時酶活性的增強可能是由于合子基因表達的結果。

在本研究中，錦鯉魚卵受精初期丙二醛含量最低，說明抗氧化能力較強。但是，隨著胚胎發(fā)育，丙二醛含量逐漸增多，說明胚胎發(fā)育過程中持續(xù)發(fā)生一定的氧化應激反應。當胚胎發(fā)育至原腸期時，丙二醛含量顯著增多（P<0.05），為激烈的氧化應激反應所致，此時應為胚胎免疫力和抗氧化能力較弱的時期，此時期一定要增強胚胎管理，才可提高胚胎孵化率和成活率。當發(fā)育至出膜前期時，卵黃囊內的營養(yǎng)物質基本耗盡，機體需要更為旺盛的生理代謝來滿足發(fā)育的需要，此時期應為產生活性氧自由基最多的時期，同時出膜過程中仔魚與水體直接接觸，水體環(huán)境因子也可刺激其產生一定的氧化應激反應，從而導致丙二醛含量上升，這就可以解釋本研究所產生的結果。這與熊鏵龍等對普安銀鯽胚胎[11]、Elena-Díaz等對鱘魚（Acipenser sturio Linnaeus）胚胎的研究結果[15]一致。同時，說明出膜期為受精卵孵化又一關鍵時期，在此時期一定要強化管理，避免胚胎受到各種因素的干擾，同時要保持適宜的水質條件，以保持胚胎正常的發(fā)育進程，切不可延長孵化時間。

4結論

本研究顯示，在錦鯉胚胎發(fā)育過程中超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性逐漸升高，說明錦鯉胚胎生理代謝逐漸旺盛，信息傳導增多，酶活性持續(xù)協(xié)同增加，主要是滿足胚胎發(fā)育的需要。丙二醛含量逐漸增多，說明胚胎發(fā)育過程中持續(xù)發(fā)生一定的氧化應激反應。當胚胎發(fā)育至原腸期、出膜前期時，丙二醛含量均顯著上升，所以這2個時期是胚胎發(fā)育免疫能力較弱的時期，一定要強化管理，避免胚胎受到各種因素的干擾。

參考文獻：

[1]何滔. 條石鯛早期發(fā)育及相關酶活性的研究[D]. 北京：中國科學院研究生院中國科學院大學，2011：93-94.

[2]Dimitrova M T，Tishinova V，Velchava V. Combined effect of zinc and lead on the hepatic superoxide dismutase-catalase system in carp（Cyprinus carpio）[J]. Comp Biochen Physiol，1994，108（94）：43-46.

[3]閆海燕，曾令兵，羅宇良，等. 氰戊菊酯對鯉SOD活性和MDA含量以及肝腎細胞形態(tài)的影響[J]. 華中農業(yè)大學學報，2012，31（4）：499-505.

[4]劉麗平，薛暉，葛筱琴，等. 復方中草藥對青蝦肌肉和肝胰臟中幾種非特異性免疫因子的影響[J]. 淡水漁業(yè)，2007，37（6）：11-14.

[5]王卓，么宗利，林聽聽，等. 碳酸鹽堿度對青海湖裸鯉幼魚肝和腎SOD、ACP和AKP酶活性的影響[J]. 中國水產科學，2013，20（6）：1212-1218.

[6]孔祥會，王書平，江紅霞，等. 金魚胚胎發(fā)育過程中免疫相關酶活性及丙二醛含量的變化[J]. 中國水產科學，2011，18（6）：1293-1298.

[7]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，72：248-254.

[8]Swain P，Nayak S K. Role of maternally derived immunity in fish[J]. Fish & Shellfish Immunology，2009，27（2）：89-99.

[9]李彩娟，許鄭超，張振早，等. 赤眼鱒仔魚饑餓試驗和不可逆點研究[J]. 揚州大學學報（農業(yè)與生命科學版），2016，37（3）：65-70.[ZK）]

[10]賴德 C C，泰勒 C B. 生物學研究概說（同工酶）[M]. 北京：科學技術出版社，1987：35-54.

[11]熊鏵龍，姚俊杰，安苗，等. 普安銀鯽胚胎發(fā)育中抗氧化酶活性及外源維生素C的作用[J]. 水產科學，2014（10）：631-634.

[12]Kumano G，Nishida H. Maternal and zygotic expression of the endoderm-specific alkaline phosphatase gene in embryos of the ascidian，Halocynthia roretzi[J]. Developmental Biology，1998，198（2）：245-252.

[13]王書平，孔祥會，江紅霞，等. 金魚胚胎發(fā)育過程中磷酸酶活性的變化[J]. 水產科學，2011，30（7）：405-408.

[14]孔祥會，王書平，江紅霞，等. 金魚胚胎發(fā)育過程中免疫相關酶活性及丙二醛含量的變化[J]. 中國水產科學，2011，18（6）：1293-1298.

[15]Elena-Diaz M，F(xiàn)urne M，Trenzado C E，et al. Antioxidant defences in the first life phases of the sturgeon Acipenser naccarii[J]. Aquaculture，2010，307（1/2）：123-129.[ZK）][HT][HJ][FL）]