小豆SSR—PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選

趙雅楠 王穎 張東杰 姜多

摘要：為探索適宜小豆SSR-PCR反應(yīng)的最佳條件以篩選具有多態(tài)性的SSR引物，采用L16（45）正交設(shè)計(jì)優(yōu)化影響小豆SSR-PCR反應(yīng)的5個(gè)因素（Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq用量、引物濃度、模板DNA用量），利用優(yōu)化后的 SSR-PCR 體系，以10份小豆種質(zhì)為模板，對(duì)80對(duì)小豆（50對(duì)）和綠豆（30對(duì)）的SSR引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，得出小豆SSR-PCR的最佳反應(yīng)體系（20 μL）：Mg2+濃度2.5 mmol/L，dNTPs濃度1.0 mmol/L，Taq活性1.5 U，引物濃度 0.6 μmol/L，模板DNA用量30 ng。利用優(yōu)化后的體系在小豆和綠豆引物中篩選出31對(duì)條帶清晰、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好的SSR引物，有效擴(kuò)增率為38.75%。小豆SSR-PCR優(yōu)化體系的建立及多態(tài)性引物的篩選為進(jìn)一步開(kāi)展小豆遺傳育種研究奠定了基礎(chǔ)，為小豆遺傳多樣性分析和遺傳圖譜庫(kù)構(gòu)建等研究提供了技術(shù)參數(shù)和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：小豆；綠豆；SSR-PCR；體系優(yōu)化；引物篩選；有效擴(kuò)增率；遺傳育種

中圖分類(lèi)號(hào)： S521.03文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）11-0033-05[HS）][HT9.SS]

小豆（Vigna angularis）是豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papilionaceae）菜豆族（Phaseoleae）豇豆屬（Vigna）的栽培豆種，富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、粗纖維、維生素等營(yíng)養(yǎng)素及三菇皂苷、無(wú)機(jī)鹽等有效成分，具有清熱除濕、消腫解毒等功效，是一種深受歡迎的醫(yī)食同源作物[1]。然而小豆一直被視為小宗作物，基礎(chǔ)性研究相對(duì)比較薄弱，特別是分子標(biāo)記技術(shù)研究相對(duì)滯后，在小豆遺傳多樣性分析、遺傳育種及種質(zhì)創(chuàng)新等研究領(lǐng)域面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）是一類(lèi)以 1～6 個(gè)堿基為基元的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，廣泛分布于植物基因組中[2]。SSR分子標(biāo)記因其多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)逐漸成為植物遺傳分析中的重要標(biāo)記技術(shù)之一，廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建[3]、種質(zhì)資源鑒定[4]、新品種選育[5]等研究中。目前，小豆SSR標(biāo)記技術(shù)主要集中在QTL定位[6]、遺傳多樣性分析[7]等研究領(lǐng)域，而關(guān)于小豆SSR-PCR反應(yīng)體系建立與優(yōu)化及多態(tài)性引物篩選方面鮮有報(bào)道。本研究利用L16（45）正交設(shè)計(jì)探究影響小豆SSR-PCR反應(yīng)的5個(gè)因素（Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq活性、引物濃度、模板DNA用量）的最優(yōu)條件，同時(shí)運(yùn)用優(yōu)化后的體系進(jìn)行引物篩選，旨在建立高效、穩(wěn)定的小豆SSR-PCR反應(yīng)體系，為小豆遺傳多樣性分析、遺傳育種及群體遺傳學(xué)探究奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1.2SSR引物

試驗(yàn)所選用的80對(duì)SSR引物主要來(lái)源于2個(gè)部分：從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布的小豆SSR引物中選擇50對(duì)進(jìn)行合成，另外30對(duì)引物從小豆近緣作物綠豆SSR引物中選擇并合成。選用引物X57（F：5′-CACACTTCAAGGAACCTCAAG-3′，R：5′-GTAGGCAACCTCCATTGAAC-3′）為PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化試驗(yàn)的固定引物。80對(duì)引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3主要試劑及儀器

SSR-PCR反應(yīng)所用的Mg2+、dNTPs、Taq、Buffer、標(biāo)準(zhǔn)分子量（marker）及植物基因組DNA提取試劑盒（plant genomic DNA kit），均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。TBD-3000核酸蛋白檢測(cè)儀，購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；ABI VeritiTM 96孔梯度PCR儀，購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；DYCP-31BN瓊脂糖電泳槽，購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；Power Pac HC電泳儀，購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；Tanon-6200凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取及檢測(cè)

每份材料取室溫種植10～15 d的植株嫩葉，液氮研磨成粉，試劑盒提取DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，核酸檢測(cè)儀檢測(cè)模板DNA用量與純度，然后將其稀釋成30 ng/μL，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2SSR-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L16（45）正交設(shè)計(jì)探究Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq活性、引物濃度及模板DNA用量的最佳水平。選擇X57為固定引物，正交試驗(yàn)因素及水平如表2所示，設(shè)計(jì)方案如表3所示，除表中變化因素外，每組試驗(yàn)體系還含有2 μL 10×Buffer，用ddH2O補(bǔ)足20 μL。

1.2.3SSR-PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸12 min，4 ℃保存。每個(gè)處理取6 μL PCR產(chǎn)物，與6×DNA Loading按6 ∶[KG-*3]1體積比混勻后在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，以L(fǎng)ow MW DNA marker-A為對(duì)照，在成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.2.4SSR引物篩選

利用B0000725小豆樣品及已優(yōu)化的體系初篩來(lái)自小豆（50對(duì)）和綠豆（30對(duì)）的80對(duì)SSR引物，然后以B0000326等10份來(lái)自4個(gè)省份的小豆樣品DNA為模板，用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳復(fù)篩成功擴(kuò)增的引物，選擇擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富的SSR引物用于后期小豆SSR分子標(biāo)記遺傳多樣性等研究。

2結(jié)果與分析

2.1DNA的提取

利用植物基因組DNA提取試劑盒（plant genomic DNA kit）提取小豆的DNA，D260 nm/D280 nm值在1.68～1.82之間，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示條帶清晰，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象（圖1），表明模板DNA提取效果較好，濃度較高，可滿(mǎn)足后續(xù)SSR分析需求。

2.2SSR-PCR正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析

采用L16（45）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示，16個(gè)處理均成功擴(kuò)增，說(shuō)明該正交設(shè)計(jì)中各因素的水平基本合理，沒(méi)有偏離最適范圍。平行比較16組處理可知，4、5、6、9、11、12號(hào)處理擴(kuò)增效果較差， 條帶較弱；2、3、8、10、13、14號(hào)處理

條帶較好，其中條帶最清晰、穩(wěn)定性最好且雜帶較少的是14號(hào)，賦值為16，而條帶最模糊，產(chǎn)量最少的是4號(hào)，賦值為1。按照這種方法進(jìn)行2次獨(dú)立打分統(tǒng)計(jì)，取平均值，并求出各因素同一水平下的得分Ai、平均值ki及極差R，ki表示不同水平下各因素對(duì)該體系的影響程度，ki越大，表示水平越好；極差R值越大，表示該因素對(duì)PCR體系的影響越大。由表4可知，Mg2+濃度對(duì)SSR-PCR反應(yīng)體系的影響最大，其次是Taq活性，其后依次是引物濃度、模板DNA用量，dNTPs濃度影響最小。

2.3SSR-PCR正交試驗(yàn)方差分析

為減少試驗(yàn)誤差，增加結(jié)果的準(zhǔn)確性，彌補(bǔ)直觀分析中極差不能客觀估計(jì)誤差的不足，本研究對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表5所示，Mg2+濃度、Taq活性、引物濃度對(duì)反應(yīng)體系的影響達(dá)到極顯著水平（P<0.01），模板DNA用量對(duì)反應(yīng)體系的影響達(dá)到顯著水平（P<0.05），而dNTPs濃度對(duì)反應(yīng)體系的影響未達(dá)到顯著水平（P>0.05），這與極差分析結(jié)果一致，充分說(shuō)明誤差對(duì)本試驗(yàn)的影響較小，本試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

2.4不同水平下各因素對(duì)小豆SSR-PCR擴(kuò)增的影響

2.4.1Mg2+濃度對(duì)小豆SSR-PCR擴(kuò)增的影響

作為T(mén)aq的輔助因子，Mg2+主要通過(guò)影響Taq活性間接影響 SSR-PCR 擴(kuò)增效果[8]。Mg2+濃度過(guò)低會(huì)抑制Taq活性， 影響催化效果，擴(kuò)增條帶較弱；濃度過(guò)高則會(huì)增強(qiáng)Taq活性，產(chǎn)生非特異性條帶，導(dǎo)致錯(cuò)配率增加。通過(guò)極差和方差分析可知，Mg2+濃度對(duì)小豆SSR-PCR擴(kuò)增的影響最大。由圖3可知，當(dāng)Mg2+濃度在1.0～2.0 mmol/L范圍內(nèi)時(shí)，評(píng)分平均值逐漸降低，擴(kuò)增效果不佳；當(dāng)Mg2+濃度在2.0～2.5 mmol/L時(shí)，評(píng)分平均值逐漸增大，并在2.5 mmol/L時(shí)達(dá)到最高值，因此本試驗(yàn)選擇最佳Mg2+濃度為2.5 mmol/L。

2.4.2Taq活性對(duì)小豆SSR-PCR擴(kuò)增的影響

Taq在 SSR-PCR反應(yīng)中起催化作用，是決定PCR擴(kuò)增效果的正相關(guān)因素，其活性受諸多因素的影響。作為對(duì)Mg2+敏感的依賴(lài)性酶，Taq對(duì)擴(kuò)增效果的影響主要表現(xiàn)在條帶數(shù)量及亮度方面[9]。由圖4可知，Taq活性與評(píng)分平均值的關(guān)系波動(dòng)較大，總體呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)， 在Taq活性為 1.5 U 時(shí)

評(píng)分達(dá)到最高，因此本試驗(yàn)選擇Taq最佳活性為1.5 U。

2.4.3引物濃度對(duì)小豆SSR-PCR擴(kuò)增的影響

引物是決定SSR-PCR特異性的關(guān)鍵因素，與模板DNA互補(bǔ)結(jié)合特異程度直接決定PCR產(chǎn)物的特異性，引物濃度過(guò)高會(huì)增加引物二聚體的合成概率，引發(fā)錯(cuò)配或非特異性擴(kuò)增，背景加深，難以辨別特異性條帶；引物濃度過(guò)低則使擴(kuò)增效率降低，不能與模板DNA完全結(jié)合，使擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量減少[10]。由圖5可知，引物濃度在0.4～0.6 μmol/L范圍內(nèi)時(shí)，評(píng)分平均值逐漸上升，當(dāng)濃度大于0.6 μmol/L時(shí)，評(píng)分平均值逐漸降低，因此本試驗(yàn)選擇0.6 μmol/L為最佳引物濃度。

2.4.4模板DNA用量對(duì)小豆SSR-PCR擴(kuò)增的影響

充足的模板DNA是保證SSR-PCR擴(kuò)增成功的基礎(chǔ)，模板DNA用量過(guò)高會(huì)影響Mg2+發(fā)揮作用，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，甚至導(dǎo)致擴(kuò)增失?。挥昧窟^(guò)低則會(huì)降低擴(kuò)增效率和產(chǎn)量，出現(xiàn)條帶太弱的情況。由圖6可知，當(dāng)模板DNA用量在20～30 ng范圍

內(nèi)時(shí)，評(píng)分平均值逐漸增大，當(dāng)其濃度大于30 ng時(shí)，評(píng)分平均值呈下降趨勢(shì)，因此選擇30 ng為模板DNA的最佳用量。

2.4.5dNTPs濃度對(duì)小豆SSR-PCR擴(kuò)增的影響

dNTPs是SSR-PCR反應(yīng)的直接原料之一，dNTPs濃度過(guò)高雖然可以提高反應(yīng)速率，但會(huì)與Taq形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，抑制其與Mg2+結(jié)合，非特異性條帶增多[11]；dNTPs濃度較低則會(huì)使擴(kuò)增條帶減少。由圖7可知，dNTPs濃度在0.5～2.0 mmol/L范圍內(nèi)時(shí)，評(píng)分平均值呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)dNTPs濃度為 1.0 mmol/L [CM（20*2/3]時(shí)評(píng)分平均值達(dá)到最高水平，因此本試驗(yàn)選擇[CM）]

1.0 mmol/L 為dNTPs最佳濃度。

2.5引物篩選

利用分別來(lái)自?xún)?nèi)蒙古自治區(qū)、黑龍江省、吉林省及遼寧省的10份不同小豆種質(zhì)DNA及優(yōu)化得到的反應(yīng)體系對(duì)80對(duì)SSR引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，選擇目標(biāo)區(qū)域內(nèi)條帶清晰、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好的核心引物用于后期小豆SSR研究。如圖8所示，從50對(duì)小豆引物中篩選得到22對(duì)多態(tài)性引物，從30對(duì)綠豆引物中篩選得到9對(duì)多態(tài)性引物，共計(jì)31對(duì)，多態(tài)性比率為38.75%。

3討論與結(jié)論

SSR分子標(biāo)記因其多態(tài)性豐富、可重復(fù)性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)已成為遺傳研究中比較成熟的標(biāo)記技術(shù)之一，在作物基因標(biāo)記、輔助育種、親緣關(guān)系鑒定等研究中應(yīng)用廣泛[12]。而PCR反應(yīng)是SSR標(biāo)記中的重要環(huán)節(jié)，其中多個(gè)因素及各因素間的相互作用均會(huì)對(duì)SSR標(biāo)記產(chǎn)生影響，PCR擴(kuò)增敏感性、特異性、產(chǎn)量等都可能因Mg2+濃度、dNTPs濃度、模板DNA用量、Taq活性、引物濃度的不同而產(chǎn)生變化。因此，優(yōu)化SSR-PCR體系，使反應(yīng)中的各個(gè)因子達(dá)到最佳水平，并利用優(yōu)化后的組合進(jìn)行多態(tài)性引物篩選是基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行作物遺傳育種研究的基礎(chǔ)。

通常優(yōu)化SSR-PCR體系都是采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)或正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。單因素分析處理較多，且不能兼顧各因素之間的相互作用，即在單因素試驗(yàn)中得到的各個(gè)因素的最佳水平組合擴(kuò)增效果不一定最好。而正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是在全面試驗(yàn)中選擇部分有代表性的處理組合，具有均衡分散性和整齊可比性的特點(diǎn)，能夠充分考慮各因素水平之間的交互作用，簡(jiǎn)單、便捷、高效，利用較少次數(shù)試驗(yàn)得到較佳的試驗(yàn)結(jié)果，可有效解決SSR-PCR優(yōu)化所需試驗(yàn)量與實(shí)際可行試驗(yàn)次數(shù)之間的矛盾，利用有限的試驗(yàn)量全面掌握事物的內(nèi)在規(guī)律是一種較理想的SSR-PCR優(yōu)化途徑[13]。本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響小豆SSR-PCR反應(yīng)的5個(gè)因素進(jìn)行4個(gè)水平的優(yōu)化，最終得到SSR-PCR的最佳反應(yīng)條件：總體系20 μL，Mg2+濃度為2.5 mmol/L，dNTPs濃度為1.0 mmol/L，Taq活性為1.5 U，引物濃度為0.6 μmol/L，模板DNA用量為30 ng，這與大豆[14]、蕓豆[15]、水稻[16]、玉米[17]等作物已報(bào)道的 SSR-PCR 體系有所不同，說(shuō)明SSR-PCR體系因物種不同而存在差異，在選用PCR試驗(yàn)方法時(shí)要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，以形成適合物種研究的技術(shù)平臺(tái)。此外，試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)受一定主觀因素的影響，建立一套客觀、明確的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)有助于小豆SSR-PCR體系的準(zhǔn)確建立和該優(yōu)化方法的廣泛應(yīng)用，因此在接下來(lái)的試驗(yàn)中應(yīng)對(duì)其進(jìn)一步完善。

SSR-PCR反應(yīng)體系中，Taq活性會(huì)對(duì)條帶清晰度及數(shù)量產(chǎn)生影響，而Mg2+作為T(mén)aq的激活劑可調(diào)控其活性，進(jìn)而影響擴(kuò)增的特異性和忠實(shí)性。模板DNA用量過(guò)低會(huì)被雜帶影響，用量過(guò)高則會(huì)產(chǎn)生拮抗作用，導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。引物濃度會(huì)對(duì)反應(yīng)的特異性及定位效果產(chǎn)生影響。dNTPs則通過(guò)控制反應(yīng)速率來(lái)影響SSR-PCR反應(yīng)體系。由試驗(yàn)結(jié)果可知，Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq活性、引物濃度、模板DNA用量對(duì) SSR-PCR 體系有不同程度的影響，其中Mg2+濃度、Taq活性及引物濃度對(duì)反應(yīng)體系的影響達(dá)到極顯著水平（P<0.01），DNA模板用量對(duì)反應(yīng)體系的影響達(dá)到顯著水平（P<0.05），而dNTPs濃度對(duì)反應(yīng)體系的影響未達(dá)到顯著水平（P>005）。前人關(guān)于上述5個(gè)因素對(duì)SSR-PCR反應(yīng)體系影響程度的排列順序并不完全一致，表明各因素對(duì)反應(yīng)體系的影響作用因物種的差異而不甚相同。王耀文等認(rèn)為，引物濃度對(duì)苦蕎SSR-PCR反應(yīng)體系的影響最大[18]；而何仁鋒等則認(rèn)為，在藥用菊花SSR-PCR反應(yīng)體系中Taq活性是關(guān)鍵影響因素[19]；王志勇等對(duì)狗牙根SSR-PCR體系優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，Mg2+濃度對(duì)反應(yīng)體系影響最大[20]；麥靜等研究也發(fā)現(xiàn)，Mg2+濃度和引物濃度對(duì)厚樸SSR-PCR體系影響達(dá)極顯著水平[21]，本研究結(jié)果與之相似。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，dNTPs濃度對(duì)小豆SSR-PCR反應(yīng)體系的影響不大，當(dāng)dNTPs濃度為0.5～2.0 mmol/L時(shí)對(duì)反應(yīng)影響不顯著，這可能是因?yàn)镻CR反應(yīng)對(duì)dNTPs濃度的要求不高，滿(mǎn)足反應(yīng)需求即可。

SSR引物一般分為根據(jù)物種序列自主開(kāi)發(fā)和通用近緣作物引物2種途徑。引物開(kāi)發(fā)必須以基因組序列已知為前提，且操作繁瑣、工作量較大、費(fèi)用高，而近緣作物轉(zhuǎn)移法為引物開(kāi)發(fā)提供了新的思路。近緣作物間具有不同程度的基因同源性，因此SSR引物往往在不同作物間具有一定的通用性，將一種引物開(kāi)發(fā)較成熟作物的SSR引物通用于其近緣作物來(lái)獲得SSR位點(diǎn)的方法不僅可以減少工作量、降低費(fèi)用，還可以為不同作物間遺傳關(guān)系的研究提供理論依據(jù)[22]。本研究將30對(duì)綠豆SSR引物通用于小豆進(jìn)行擴(kuò)增，篩選得到9對(duì)適宜小豆SSR分析的引物，證明綠豆SSR引物適用于小豆，利用近緣物種間SSR引物具有通用性的特點(diǎn)進(jìn)行遺傳研究的思路是可取的，這既為小豆SSR多態(tài)性引物的篩選提供便利，同時(shí)也為小豆的遺傳學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。但本研究中獲得的小豆SSR引物數(shù)量較少且多態(tài)性水平較低，不能滿(mǎn)足后期小豆SSR標(biāo)記研究的需要，因此在接下來(lái)的研究中要繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)小豆SSR引物篩選的工作，為小豆遺傳育種、種質(zhì)資源研究等夯實(shí)基礎(chǔ)。

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