雙水相萃取荒漠肉蓯蓉總黃酮及其抗氧化活性

肖星輝，張向前，李桂芳，李予霞

（石河子大學生命科學學院，新疆石河子832003）

雙水相萃取荒漠肉蓯蓉總黃酮及其抗氧化活性

肖星輝，張向前，李桂芳，李予霞*

（石河子大學生命科學學院，新疆石河子832003）

采用乙醇-鹽雙水相萃取法研究荒漠肉蓯蓉總黃酮的萃取工藝及其體外抗氧化性。采用正交試驗法對荒漠肉蓯蓉總黃酮的提取工藝進行了優(yōu)化；通過對羥基自由基和DPPH·的清除率對其抗氧化活性進行評價?；哪馍惾乜傸S酮最佳提取工藝條件：料液比為1∶50（g/mL），提取溶劑為50%的乙醇溶液，提取時間為3.5 h，提取溫度為90℃，此條件下肉蓯蓉中總黃酮平均得率可達到（13.04±0.06）%；最佳雙水相分離體系為EtOH-K2HPO4，分離條件為70% EtOH、0.2 g/mL K2HPO4、荒漠肉蓯蓉提取液體積分數14%；雙水相萃取工藝對荒漠肉蓯蓉總黃酮的富集倍數為2.85；荒漠肉蓯蓉總黃酮對DPPH·和·OH的最高清除率分別91.8%和35.9%，表明荒漠肉蓯蓉總黃酮對DPPH·的清除效果強于·OH，具有較好的抗氧化活性。

荒漠肉蓯蓉；黃酮；正交試驗；EtOH-K2HPO4體系；抗氧化活性

肉蓯蓉（cistanche）為列當科（Orobanchaceae）多年生草本植物，多生于藜科（Chenopodiaceae）梭梭屬（Haloxylon）植物梭梭（鹽木）（Haloxylon ammodendron）和白梭梭（Haloxylon persicum）的根部，具有很強的抗旱、抗寒、耐鹽堿特性。新疆荒漠肉蓯蓉素有沙漠人參的美譽[1]。隨著生物衰老學說及自由基生命科學的發(fā)展，黃酮也因其具有強的抗氧化性和強的清除自由基的能力而受到廣泛的重視，是一種在醫(yī)藥、食品等領域具有廣泛開發(fā)前景的天然抗氧化劑，許多富含黃酮類化合物的植物、中草藥資源被開發(fā)利用出來[2-4]。前期研究表明，肉蓯蓉具有抗衰老、抗氧化、增強免疫力等功能。為綜合開發(fā)利用肉蓯蓉資源，對新疆荒漠肉蓯蓉中總黃酮提取工藝、純化及體外抗氧化活性進行了研究，以期為進一步提取純化新疆荒漠肉蓯蓉黃酮做出參考，也為進一步探討其藥理活性、資源保護和中藥制劑等綜合利用提供試驗依據。

1 材料

1.1 試劑與原料

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美國sigma公司；蘆丁（批號：100080-200707）：中國食品藥品檢驗研究院；L-（+）-抗壞血酸（VC）、2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）：國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純級。

荒漠肉蓯蓉：新疆古爾班通古特沙漠各沙區(qū)。

1.2 儀器

UV-2700紫外分光光度計：島津儀器有限公司；真空干燥箱：上海實驗儀器廠；SHB-A（Ⅲ）循環(huán)式真空泵：天津天有利科技有限公司；ANKEGL-20G-2型離心機：上海安亭科學儀器廠；電子天平：德國賽多利斯集團；恒溫水浴鍋：上海博訊公司；N-1100S-W旋轉蒸發(fā)儀：深圳賽普儀科技有限公司；Thermo fisher離心機：賽默飛世爾科技公司。

2 試驗方法

2.1 荒漠肉蓯蓉總黃酮的測定[5]

樣品荒漠肉蓯蓉中黃酮得率測定：準確移取1.0mL的樣品液于比色管中測定吸光度。根據標準回歸方程：Y=0.1091X-0.0091，計算黃酮質量?？傸S酮得率按如下公式計算：

黃酮得率/%=CV/M×100

式中：C為提取液濃度，g/mL；V為提取液原始體積，mL；M為所取荒漠肉蓯蓉粉末質量，g。

2.2 正交試驗優(yōu)化總黃酮提取工藝條件

根據正交試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上，每個因素選取3個對總黃酮得率影響較大的水平，建立L9（34）試驗組合，以總黃酮得率為評價指標，對各因素的3個水平進行編碼（見表1），優(yōu)化古爾班通古特沙漠中荒漠肉蓯蓉總黃酮的提取工藝。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

2.3 乙醇-無機鹽雙水相體系分離純化總黃酮

采用濁度法[6]，繪制無機鹽（Na2CO3、K2CO3、草酸鈉、（NH4）2SO4、K2HPO45種鹽作為試驗用無機鹽）雙水相體系相圖。

荒漠肉蓯蓉總黃酮的萃取與純化：將提取的肉蓯蓉粗黃酮配置成一定濃度的黃酮溶液（黃酮含量0.15 g）加入到已知無機鹽/乙醇的雙水相體系中，充分振蕩，靜置1 h左右，記錄上下相的體積，分別測出上下相的黃酮濃度，進而計算出相比R，分配系數K，萃取率Y。計算公式：

式中：Va是上相體積，mL；Vb是下相體積，mL。

式中：Ca是上相黃酮濃度，mg/mL；Cb是下相黃酮濃度，mg/mL。

式中：Y為萃取率，%；K為分配系數；R為相比。

2.4 驗證試驗及總黃酮純化倍數的測定

稱取荒漠肉蓯蓉粗提物2.00 g，按最佳工藝條件進行雙水相萃取，讀取上、下相體積，分析上、下相中肉蓯蓉總黃酮的量，計算R、K和Y。取乙醇相（上相）揮干溶劑，得黃酮浸膏。分別精密稱取3份醇提浸膏，配置成一定質量濃度的供試液，測定黃酮，計算萃取后黃酮的純化倍數。

2.5 抗氧化性試驗

按照正交試驗確定的荒漠肉蓯蓉總黃酮提取最佳條件進行提取，提取液離心（4 000 r/min）10 min，取上清液，經雙水相分離純化液回收乙醇溶劑后濃縮干燥即得荒漠肉蓯蓉總黃酮粗提物。配制適宜質量濃度溶液進行抗氧化活性試驗。DPPH·清除率的測定和羥自由基清除率的測定參照文獻[7-9]。計算公式如下：

式中：A1為溶劑與樣液混合液的吸光度；A2為樣液與DPPH·反應后的吸光度；A3為溶劑與DPPH混合液的吸光度。

式中：Ax為樣品組吸光度；A1為對照組吸光度；A0為空白組吸光度。

3 結果與分析

3.1 正交試驗法提取荒漠肉蓯蓉總黃酮最佳工藝結果分析

稱取干燥的荒漠肉蓯蓉粉末2.0 g于錐形瓶中，按正交表安排（表1）進行試驗，提取液過濾，減壓濃縮至20 mL，濃縮液用30%的乙醇定容至50 mL，即為總黃酮提取液。從中取1 mL樣品按照2.1中的測定方法對其進行處理和測量，結果分析見表2、表3。

表2 正交試驗設計及結果分析Table 2 The experimental results of orthogonal test

表3 顯著性檢驗（方差分析）Table 3 Significance test（ANOVA）

從各因素的顯著性水平差異看出，荒漠肉蓯蓉總黃酮得率的影響次序是：提取溫度＞提取時間＞乙醇濃度＞料液比，且對總黃酮得率的影響都達到了極顯著水平（P＜0.001）；通過各因素間的交互作用及其對多糖得率影響的相關性分析得知：溫度與時間對總黃酮的得率有非常顯著的影響，提取溫度與時間也具有一定的相關性（P＜0.001）；乙醇濃度與提取時間的相關性（P＜0.05）小于上述兩種組合的交互作用，這一結論與方差分析一致。從而說明：影響荒漠肉蓯蓉提取的決定因素為提取溫度和回流的時間。最佳提取工藝為A3B3C2D3，即提取溫度為90℃，料液比為1∶50（g/mL），乙醇濃度為50%，回流時間為3.5 h。經驗證，該條件下荒漠肉蓯蓉總黃酮得率為（13.04±0.06）%，均高于單因素提取所獲總黃酮得率。

3.2 雙水相總黃酮提純工藝的確立

3.2.1 5種鹽相圖的繪制和分相能力的考察

室溫下構建了5種鹽—雙水相體系（EtOH與Na2CO3、K2CO3、NaOOCCOONa、（NH4）2SO4、K2HPO4的雙水相體系），并繪制了5種鹽與無水乙醇形成的雙水相相圖，結果如圖1所示。

圖1 5種鹽—乙醇形成的雙水相體系圖Fig.1 Aqueous two-phase system of five kinds of salt ethanol

由圖1可知，5種鹽—乙醇皆可以形成雙水相體系，通過各綜合因素分析：K2HPO4分相能力強，且分相范圍大、穩(wěn)定，分配系數也大，黃酮幾乎都分布于上相。在此基礎上篩選最佳EtOH/K2HPO4雙水相體系。

3.2.2 最佳提取黃酮的EtOH/K2HPO4雙水相體系的確立

雙水相萃取是一種新型的黃酮類化合物的分離純化方法。在雙水相中，當H2O與EtOH體積比一定時，鹽越多，下相的體積越大，鹽的量達到一定時會析出晶體；而當鹽和EtOH的質量一定時，水過多就形不成雙水相體系，水過少易析出晶體[10]，所以需要確定適當H2O、鹽與EtOH的體積比，結果見圖2。

圖2 不同雙水相體系對黃酮萃取率的影響Fig.2 Effect of different aqueous two phase systems on the extraction rate of total flavonoids

由圖2（A）可知，當φ乙醇=80%時，隨著K2HPO4量的加入，相比隨之降低，下相的體積增大，萃取率也略呈下降趨勢。K2HPO4的加入量為5 g時，萃取率達到最大，但分配系數不穩(wěn)定。由圖2（B）可知，當φ乙醇=70%時，隨著K2HPO4的增加，分配系數增大，相比下降，對萃取率的影響也不是太大，K2HPO4的加入量為10 g時，萃取率達到最大為99.07%。由圖2（C）可知，K2HPO4的加入量對黃酮萃取率的影響較大，且隨鹽量的增加總體呈現下降趨勢。由圖2（D）可知，在φ乙醇=50%時，隨著K2HPO4質量的增加，黃酮萃取率呈現下降趨勢，且影響相對較大?？傮w分析，各體系（乙醇和水的體積比一定的情況下）相比是隨著鹽濃度的增加而逐漸變小，即鹽的增加會導致下相的體積增大，相比減小[10]。故以黃酮的萃取率及提純工藝為目標對各因素進行綜合分析后，擬確定提取荒漠肉蓯蓉總黃酮的最佳雙水相萃取體系為：φ乙醇=70%，K2HPO4量為10.0 g，在此體系中，分配系數為24.66，相比為4.33，萃取率達99.07%。

3.3 驗證試驗及純化倍數結果

精密稱取3份荒漠肉蓯蓉粗提品（用10 mL水溶解，含黃酮0.15 g），按試驗獲得的最佳萃取工藝條件即φ乙醇=70%，ρ（K2HPO4）=0.2 g/mL，在此雙水相體系中萃取荒漠肉蓯蓉總黃酮，測定上、下相中黃酮含量，計算R、K和Y，試驗結果如表4所示。

表4 驗證試驗結果Table 4 The results of validation test

試驗結果表明在最佳萃取工藝條件下，兩相中總黃酮的分配系數平均值為24.62（n=3，RSD=0.66%），乙醇相中黃酮的最大萃取率可達99.08%（n=3，RSD= 0.18%）。

按照最佳工藝條件萃取荒漠肉蓯蓉總黃酮，測定雙水相萃取前后粗品中總黃酮的量，試驗結果顯示萃取前后粗品中總黃酮的含有量分別為（13.04±0.06）%（n=3，RSD=1.23%）和（37.16±0.31）%（n=3，RSD=1.31%），萃取后粗品中總黃酮的含有量是萃取前的2.85倍。

3.4 荒漠肉蓯蓉黃酮的抗氧化活性

荒漠肉蓯蓉總黃酮粗提物對自由基的清除試驗結果見圖3。

圖3 荒漠肉蓯蓉總黃酮對自由基的清除效果Fig.3 The clearance ability of total flavonoids of Cistanche deserticola Y.C.Ma to DPPH·and hydroxyl free radical

試驗結果表明，在0～5.2 mg/mL范圍內，荒漠肉蓯蓉黃酮對DPPH自由基和·OH具有極好的清除能力，隨著肉蓯蓉黃酮質量濃度的增加，清除作用增強，具有一定的量效關系，但均低于VC的抑制效果，這一結果與歐陽杰[11]結果一致。從圖中可以看出，荒漠肉蓯蓉總黃酮對于清除DPPH自由基的能力遠遠大于·OH基的能力，表明荒漠肉蓯蓉總黃酮對不同自由基的清除能力不同。荒漠肉蓯蓉總黃酮質量濃度大于2.56 mg/mL時，隨著質量濃度的增加對DPPH自由基清除能力影響逐漸減弱不大，此時的清除率為73.32%，清除率最高可達91.8%；對·OH的清除能力最大可35.9%，此時荒漠肉蓯蓉黃酮的質量濃度為5.12 mg/mL。

4 討論

本研究根據傳統(tǒng)中藥藥劑的制備方法，利用回流法提取荒漠肉蓯蓉黃酮類有效成分，并進行純化及抗氧化活性測定，旨在為今后研發(fā)肉蓯蓉制劑的質量和療效奠定基礎[12]。試驗結果如下：

1）采用正交試驗法優(yōu)化了回流提取新疆荒漠肉蓯蓉總黃酮的工藝，最佳提取工藝條件為提取溫度為90℃，料液比為1∶50（g/mL），乙醇濃度為50%，回流時間為3.5 h。在此條件下，荒漠肉蓯蓉總黃酮得率為（13.04±0.06）%，均高于單因素提取所獲總黃酮得率。影響荒漠肉蓯蓉總黃酮得率大小的因素主次順序為：提取溫度＞提取時間＞乙醇體積分數＞料液比，其中提取時間與提取溫度因素之間的交互作用顯著，對荒漠肉蓯蓉總黃酮得率影響較大。

2）試驗結果表明利用乙醇—鹽雙水相體系萃取純化荒漠肉蓯蓉中的總黃酮是可行的。乙醇-K2HPO4雙水相體系萃取荒漠肉蓯蓉總黃酮的最佳工藝條件為：φEtOH=70%，ρ（K2HPO4）=0.2 g/mL。粗提物加入量為0.15 g，混合后形成雙水相，相比為4.31，分配系數為24.62，上相中最大萃取率達99.08%。雙水相萃取后荒漠肉蓯蓉總黃酮純度提高了2.85倍，純度達37.16%。說明EtOH/K2HPO4雙水相萃取體系分離純化荒漠肉蓯蓉具有一定的選擇性。

3）荒漠肉蓯蓉總黃酮可以有效清除DPPH自由基和·OH，且量效關系顯著，其清除DPPH自由基的能力高于·OH；對DPPH自由基清除率最高可達91.8%，·OH的清除率只有35.9%。

黃酮類化合物的分離提純對醫(yī)藥及食品工業(yè)是十分重要的，組成雙水相的一些無機鹽對生物活性物質無傷害，因此不會引起生物物質失活或變性。本研究發(fā)現，雖然黃酮的萃取率高，但其純度不高，原因是雙水相不具有特異性和專一性[12]，在肉蓯蓉中含有其他的一些易溶于乙醇的物質進入有機相，而導致黃酮的純度降低，所以對于提高黃酮的純度還需要進一步探究。

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Aqueous Two-phase Extraction of Total Flavonoids from Cistanche deserticola Y.C.Ma and the Antioxidant Activity of the Extracts

XIAO Xing-hui，ZHANG Xiang-qian，LI Gui-fang，LI Yu-xia*
（College of Life Science，Shihezi University，Shihezi 832003，Xinjiang，China）

Aqueous two-phase extraction was applied to extract the total flavonoids in Cistanche deserticola Y. C.Ma and the antioxidant ability of the extracts in vitro was also investigated．Orthogonal tests were employed to optimize the extraction technology．The antioxidant ability of the extraction solution was evaluated according to its scavenging activity and reducing power for DPPH·and·OH．The optimal feed liquid ratio，the ratio between ethanolandwater,extractiontimeandextractiontemperaturewere1∶50（g∶mL）,50%ethanolsolution,3.5hours and and extraction temperature 90℃,respectively.The concentration of total flavonoids in Cistanche deserticola Y.C.Ma could reach（13.04±0.06）%.The best aqueous two-phase separation system was EtOH-K2HPO4.The optimal ratio between ethanol and water,mass concentration of potassium hydrogen phosphate anhydrous and volume fraction of flavonoids extract were 0.7（mL∶mL）,0.2 g/mL and 14%，respectively．The concentration of the total flavonoids in Cistanche deserticola Y.C.Ma was enriched 2.85 times with aqueous two-phase extraction．The highest scavenging rates of total flavonoids of DPPH·and·OH were 91.8%and 35.9%respectively,indicating that the total flavonoids scavenging effect of DPPH·on free radical was stronger than that of·OH.

Cistanche deserticola Y.C.Ma;total flavonoids;orthogonal experiment;the system of EtOH-K2HPO4; antioxidant ability

2016-12-15

國家自然科學基金項目“古爾班通古特沙漠荒漠肉蓯蓉種質資源遺傳多樣性研究”（31460070）

肖星輝（1995—），男（漢），本科生，研究方向：生化與分子生物學的研究。

*通信作者：李予霞（1970—），女，副教授，研究方向：藥物資源的開發(fā)研究。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.002