辣椒兩種雄性不育系中可溶性蛋白質及可溶性糖的變化關系

黃 巍繆 武

（1.湖南省蔬菜研究所， 長沙 410125； 2. 湖南興蔬種業(yè)有限公司， 長沙 410125；3.湖南湘研種業(yè)有限公司， 長沙 410100）

辣椒兩種雄性不育系中可溶性蛋白質及可溶性糖的變化關系

黃 巍1,2繆 武3

（1.湖南省蔬菜研究所， 長沙 410125； 2. 湖南興蔬種業(yè)有限公司， 長沙 410125；3.湖南湘研種業(yè)有限公司， 長沙 410100）

了解辣椒兩種雄性不育系在花粉敗育過程中可溶性蛋白質及可溶性糖的變化規(guī)律，以期為辣椒雄性不育系不育機理的研究提供參考。以辣椒細胞核雄性不育（GMS）G06-77-2AB及細胞核質互作雄性不育（CMS）系C06-77-2A為材料，用Lowry法和蒽酮法對蛋白質和糖進行測定并分析比較。結果表明：辣椒兩種不同類型不育系花蕾發(fā)育的各個時期，可溶性蛋白質的含量不論是細胞核質互作不育系（C06-77-2A）還是細胞核雄性不育系（G06-77-2A）均明顯低于其可育系（G06-77-2B），但是兩種不育系之間沒有明顯規(guī)律可循?；ɡ侔l(fā)育的各個時期，兩種不同類型不育系可溶性糖含量均低于可育系，細胞核質互作不育系（C06-77-2A）明顯低于細胞核雄性不育系（G06-77-2A）。兩種雄性不育系在花蕾發(fā)育的各個時期，可溶性蛋白質和可溶性糖含量均低于可育系，兩種不育系間無明顯規(guī)律可循。

辣椒；CMS；GMS；可溶性蛋白質；可溶性糖

AbstractThe changes of the soluble protein and soluble sugar in the process of pollen abortion of the two-type male sterile lines were understood in this study so as to provide reference for the research of sterile mechanism of male sterile line in hot pepper. With a pepper genic male sterile (GMS) line G06-77-2 AB and a caryoplasm interaction male sterile (CMS) line C06-77-2 A as materials, Lowry method and anthrone method were used for the measure and comparison of the protein and sugar. The results showed that, in each development period of buds of the two types of pepper male sterile line, either the CMS line (C06-77-2A) or the GMS line (G06-77-2A) had the soluble protein content of buds signifcantly lower than its fertile line (G06-77-2B), but there was no clear rule to fnd between the two types of male sterile lines. And the soluble sugar content of buds of the two sterile lines was signifcantly lower than that of its fertile line, and the soluble sugar content of the CMS line (C06-77-2A) was signifcantly lower than that of the GMS line (G06-77-2A). The two types of male sterility had soluble protein and soluble sugar content lower than the fertile line at various stages of fower bud development, and there was no clear rule between the two sterile lines.

Key wordshot pepper; CMS; GMS; soluble protein; soluble sugar

蛋白質和糖是細胞組成中的重要物質，對小孢子的發(fā)生過程極為重要。劉齊元等[1]研究表明：雄性不育煙草花蕾中的可溶性蛋白質含量都比其相應保持系的低，而且隨著花蕾的發(fā)育，這種差距還有擴大的趨勢。鄧明華等[2]研究表明：辣椒隨著花蕾的發(fā)育，不育系中花蕾蛋白質的含量在大花蕾和中花蕾時期均低于小花蕾時期，而保持系花蕾中蛋白質的含量則在大花蕾時期明顯高于中花蕾和小花蕾時期。謝冰等[3]在對辣椒核型雄性不育小孢子發(fā)育時期發(fā)現(xiàn)，可溶性蛋白質含量從小孢子母細胞期以后不育系明顯低于可育系。劉齊元等[1]研究表明：煙草雄性不育系花蕾中可溶性糖含量在小花蕾和中花蕾時期比其相應的保持系略高，而在大花蕾階段則又都比其相應的保持系略低，表現(xiàn)出一致的趨勢。郭麗娟等[4]對茄子雄性不育系的可溶性糖、淀粉、氨基酸分析研究表明：隨著花蕾的發(fā)育，不育系可溶性糖高于保持系。鄧明華等[2]研究辣椒花蕾的發(fā)育過程中，不育系大花蕾時期的可溶性糖含量明顯低于前兩期，而保持系可溶性糖含量一直呈上升趨勢。

本試驗以辣椒細胞核雄性不育系G06-77-2AB及細胞核質互作雄性不育系C06-77-2A為試材，尋找其花蕾發(fā)育各個時期可溶性蛋白質及糖的含量變化規(guī)律，并與其可育系G06-77-2B進行比較，從而為辣椒雄性不育系不育機理的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料為高辣椒紅色素細胞核雄性不育系G06-77-2A，細胞核質互作雄性不育系C06-77-2A及兩個不育系的保持系G06-77-2B (G06-77-2B既是細胞核雄性不育系G06-77-2A的可育株，也是細胞核質互作雄性不育系C06-77-2A的保持系)。材料均通過了多代選育，農(nóng)藝學性狀相似，其育性穩(wěn)定，遺傳背景清楚。

1.2 方法

1.2.1 田間栽培與管理 材料于2013年9月下旬播種于海南三亞試驗基地，前茬水稻，辣椒采用條播，每667 m2施氮、磷、鉀含量均為16%的俄羅斯復合肥50 kg，菜餅50 kg、磷50 kg及鉀肥10 kg作底肥。10月下旬定植，椒苗6 ～ 7葉真葉，定植7 d后每667 m2追施挪威復合肥5 kg。田間管理和病蟲害防治同一般大田辣椒。材料于翌年1月中下旬陸續(xù)現(xiàn)蕾，1月25 ～ 30日初花。

1.2.2 辣椒兩種雄性不育系C06-77-2A及G06-77-2AB花蕾分級 根據(jù)花蕾大小和外部形態(tài)特性將試驗各材料花蕾分為8個等級，如表1所示，以期研究花蕾外部形態(tài)與小孢子發(fā)育時期的關系。

表1 辣椒不同級別花蕾形態(tài)特征與小孢子發(fā)育的關系

1.2.3 蛋白質含量測定 采用Lowry法[5]進行蛋白質含量測定。

試驗方法：花蕾雄蕊鮮樣經(jīng)液氮研磨后，采用0.02 M的磷酸液提取。含量測定采用Lowry法[5]進行，其原理是首先在堿性溶液中形成銅 — 蛋白質復合物，然后這一復合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin - 酚試劑），產(chǎn)生鉬藍和鎢藍的深藍色復合物，這種深藍色復合物在745 ～ 750 nm處有最大的吸收峰，顏色的深淺（吸收值大?。┡c蛋白質濃度成正比?？筛鶕?jù)750 nm處的光吸收值大小，計算蛋白質含量。

①溶液A的配制：100 mL，稱量0.5 g CuSO4?5H2O、1 g Na3C6H5O7?2H2O，加超純水至100 mL，高壓鍋滅菌后，室溫保存。

②溶液B的配制：1 L，稱量20 g Na2CO3、4 g NaOH，加超純水至1 L，高壓鍋滅菌后，室溫下長期保存。

③溶液C的配制：51 mL，用微量移液槍取1 mL溶液A，用量筒量取50 mL溶液B，混勻后即可使用。注意該試劑只能使用一天，過期失效，必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

④溶液D的配制：20 mL，吸取10 mL Folin -酚試劑、10 mL超純水，混勻后即可使用，該試劑可在冰箱中長期保存。

⑤標準蛋白質溶液的配制：用電子天平稱量2.5 mg牛血清白蛋白，加超純水100 mL，配制成25 μg/mL的溶液，貯藏于冰箱中備用。

⑥標準曲線的制作：取14只1.5 mL離心管分成兩組，分別加入0、10、20、40、60、80、100 μL標準蛋白質溶液，用超純水補足至1 mL，加入500 μL溶液C混勻，于20 ～ 25℃浴鍋中放置10 min，再加入50 μL溶夜D ，立即振蕩搖勻，在20 ～25℃浴鍋保溫30 min，然后放置在室溫下，待生成的顏色穩(wěn)定后，在紫外可見光分光光度計上，測定750 nm處的OD值。取兩組測定的平均值，以蛋白質濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線。

⑦樣品測定：取0.1 mL樣品的可溶性蛋白質提取液（用0.02 M的磷酸緩沖液），同時以0.1 mL水為對照，按上述制作標準曲線的步驟，依次加入500 μL溶液C，保溫，再加入50 μL溶液D，再保溫，待顏色穩(wěn)定后測750 nm處的OD值。根據(jù)OD值，在標準曲線圖上算出樣品的可溶性蛋白質含量。

1.2.4 可溶性糖含量測定 采用蒽酮法[6]進行可溶性糖含量測定。

制作標準曲線：取6支大試管，按表2所示配置一系列不同濃度的葡萄糖溶液。在每支試管中立即加入蒽酮試劑0.5 mL，再用酸式滴定管加入濃硫酸5 mL，搖勻，反應10 min，在620 nm波長下比色。以標準葡萄糖濃度做橫坐標，以消光值做縱坐標，作出標準曲線。

表2 不同濃度葡萄糖溶液的配制

將辣椒材料剪碎至2 mm以下，準確稱取1 g，放入50 mL錐形瓶中，加沸水25 mL，在水浴中加蓋煮沸10 min，冷卻后過濾，濾液收集在50 mL量瓶中，水洗后定容至刻度。取1 mL待測樣，加入1 mL蒸餾水，混勻，加入0.5 mL蒽酮試劑，再加入5 mL濃硫酸，搖勻。10 min后在620 nm下測其消光值，并從標準曲線上查出葡萄糖的含量。

2 試驗結果

2.1 辣椒兩種不育系類型不育系和可育系中蛋白質含量比較

雄性不育系C06-77-2A、G06-77-2AB不同發(fā)育時期的花蕾中可溶性蛋白含量的測定見圖1。圖1結果表明：細胞核質互作不育系C06-77-2A隨著花蕾的發(fā)育，可溶性蛋白質呈不斷降低的趨勢，基本呈直線關系，且一直低于保持系G06-77-2B的水平；而G06-77-2A及G06-77-2B花蕾中可溶性蛋白含量的變化趨勢則表現(xiàn)出先降低，然后升高，再降低的趨勢，第一個拐點出現(xiàn)在花蕾時期4時，第二個拐點出現(xiàn)在花蕾時期6時，且細胞核不育系G06-77-2A可溶性蛋白質含量一直低于可育系G06-77-2B，并且從花蕾時期2開始，達到顯著水平。

兩種類型雄性不育系之間比較，在花蕾時期4之前，細胞核質互作不育系C06-77-2A可溶性蛋白質含量下降的速度遠遠快于細胞核雄性不育系G06-77-2A，前者下降3.2倍，后者下降僅1.8倍；花蕾時期4之后，G06-77-2A可溶性蛋白質含量緩慢升高，接近時期5的時候，含量再次超過了C06-77-2A，最后兩者變化趨于平穩(wěn)（圖1）。

2.2 辣椒兩種不育系類型不育系和可育系中可溶性糖含量比較

辣椒兩種不育系類型不育系和可育系可溶性糖含量隨花蕾發(fā)育而變化，如圖2所示。首先，兩種不育系類型與其相應的可育系，整個花蕾發(fā)育過程中可溶性糖含量先上升，然后下降，均在花蕾時期4即減數(shù)分裂后期出現(xiàn)第1個拐點，含量達到最高，之后均略有下降，但是可育系G06-77-2B在花蕾時期7后出現(xiàn)第2個拐點，含量略有上升，兩種不育系均一直緩慢下降，直到花粉成熟。其次，可育系G06-77-2B明顯高于細胞核質互作不育系C06-77-2A，差異顯著；可育系G06-77-2B各時期較細胞核不育系G06-77-2A高，但沒有達到顯著差異。對兩種不育系進行比較后發(fā)現(xiàn)，細胞核雄性不育系G06-77-2A整個花蕾發(fā)育過程中，可溶性糖均高于細胞核質互作不育系C06-77-2A，經(jīng)統(tǒng)計分析，差異達到顯著水平。

圖1 辣椒C06-77-2A與G06-77-2AB花蕾中可溶性蛋白含量

圖2 辣椒C06-77-2A與G06-77-2AB花蕾中可溶性糖含量

3 討論

3.1 不育系中可溶性蛋白含量變化趨勢

在生物界大多數(shù)遺傳信息最終表現(xiàn)為蛋白質，植物界小孢子形成和花粉發(fā)育各個時期都有特異的蛋白質合成。本研究中發(fā)現(xiàn)，在辣椒兩種不同類型不育系花蕾發(fā)育的各個時期，花蕾的可溶性蛋白質的含量，無論是細胞核質互作不育系（C06-77-2A），還是細胞核雄性不育系（G06-77-2A）均明顯低于其可育系（G06-77-2B)；但是兩種不育系之間沒有明顯規(guī)律可循。如果把花蕾的可溶性蛋白質含量輸入DPS分析軟件，進行成對數(shù)據(jù)的t測驗，則兩種不同類型雄性不育系與其可育系之間，花蕾的可溶性蛋白質含量也存在顯著性差異，差異達5%顯著水平，但是兩種不育系之間差異沒有達到顯著水平。

3.2 不育系中可溶性糖含量變化趨勢

花蕾中的可溶性糖含量也與可溶性蛋白質含量有相似的趨勢，花蕾的各個時期，兩種不同類型不育系可溶性糖含量均低于可育系，細胞核質互作不育系（C06-77-2A）明顯低于細胞核雄性不育系（G06-77-2A）。如果把可溶性糖含量輸入DPS分析軟件，進行成對數(shù)據(jù)的t測驗，則兩種不同類型雄性不育系與其可育系之間，兩種不育系可溶性糖方面，細胞核雄性不育系（G06-77-2A）與細胞核質互作不育系（C06-77-2A）差異達到1%的顯著水平；細胞核質互作不育系（C06-77-2A）與可育系（G06-77-2B）之間也存在極顯著差異，差異也達1%顯著水平，但是細胞核雄性不育系（G06-77-2A）與可育系（G06-77-2B）之間差異不是很顯著。

[1] 劉齊元，朱肖文，劉飛虎，舒文英，崔愛花，趙婷. 煙草雄性不育花蕾發(fā)育過程中幾種物質含量的變化[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學學報，2007，29（3）：336-340

[2] 鄧明華，鄒學校，周群初，劉志敏，文錦芬. 辣椒細胞質雄性不育系與保持系生化特性研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，2002，28（6）：492-494

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Relationship between Two Male Sterile Lines and Changes of Soluble Protein and Soluble Sugar in Hot Pepper

HUANG Wei1,2MIAO Wu3
（1. Hunan Institute of Vegetables, Changsha 410125, China; 2. Hunan Xingshu Seed Industry Co., Ltd., Changsha 410125, China; 3. Hunan Xiangyan Seed Industry Co., Ltd., Changsha 410100, China）

2017-05-28

黃?。?978-），男，助理研究員，主要從事蔬菜品種選育及新品種推廣