利用退火反應(yīng)產(chǎn)生粘性末端的基因克隆新方法

趙婷婷 曾靜靜 王啟軍 褚茂平

利用退火反應(yīng)產(chǎn)生粘性末端的基因克隆新方法

趙婷婷 曾靜靜 王啟軍 褚茂平

目的 通過引物設(shè)計和退火反應(yīng)產(chǎn)生內(nèi)切酶的粘性末端，旨在開發(fā)一種高效、簡單、可靠的分子克隆方法。方法 選定限制性內(nèi)切酶（平末端或者粘性末端）設(shè)計3條或4條引物，同時進行兩次獨立的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），隨后把兩次PCR產(chǎn)物回收后混在一起經(jīng)過解鏈退火，再將其與雙酶切的載體質(zhì)粒進行連接反應(yīng)，最后轉(zhuǎn)化即可得到目的克隆。 結(jié)果 利用此方法成功一次性將若干靶基因（P90rsk、Nprl2、Mios、Ragc、S6k、Pkca）構(gòu)建在經(jīng)EcoRV和NotI雙酶切后的pcDNA3.1(+)載體上，經(jīng)酶切及測序驗證。 結(jié)論 該方法無需考慮靶基因內(nèi)部是否存在酶切位點，可省去PCR產(chǎn)物酶切及之后的純化回收過程，可快速并準(zhǔn)確地克隆目標(biāo)基因。

分子克隆 聚合酶鏈反應(yīng) 退火 限制性酶切位點 粘性末端

分子克隆是分子生物學(xué)實驗的常用手段之一。傳統(tǒng)的分子克隆利用限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生粘性末端以進行目標(biāo)分子和載體的特異性連接[1]。然而，這種方法具有很大的局限性：當(dāng)目標(biāo)片段含有質(zhì)粒多克隆位點上所有的限制性內(nèi)切酶時無論選哪一種限制性內(nèi)切酶都將導(dǎo)致目標(biāo)DNA片段的切割[2]；在進行多個基因克隆時，因各基因序列不同引起的限制性內(nèi)切酶的選擇不一，使得多個基因的克隆變成一個浩大的工程[2]。為了解決傳統(tǒng)克隆方法的局限性，此前研究者作出了一定的嘗試[3-14]，如利用同源重組反應(yīng)[3-4]和TA克隆方法，兩者或增加對重組酶的依賴性或極易出現(xiàn)非特異性突變及二次克隆而不被普遍使用[15-16]。

為了使得分子克隆更加簡單和快捷，并減少對限制性內(nèi)切酶的依賴，本研究設(shè)計并驗證了一種利用退火產(chǎn)生粘性末端的方法，即根據(jù)限制性內(nèi)切酶酶切所產(chǎn)生的粘性末端情況，設(shè)計針對靶基因本身的3條或者4條引物，分兩組進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）反應(yīng)，將產(chǎn)物進行退火產(chǎn)生粘性末端隨后進行傳統(tǒng)的分子克隆步驟，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 質(zhì)粒pcDNA3.1（+）由上海市免疫學(xué)研究所饋贈。cDNA文庫和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞由實驗室構(gòu)建，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（BM101-01 500μl）購于北京全式金公司，細菌培養(yǎng)基為LB的液體或固體培養(yǎng)基，氨芐青霉素（69-52-3 5g）購于上海生工生物技術(shù)有限公司。限制性內(nèi)切酶EcoRV（R0195S 4000units）、NotI（R0189S 500units）、BamHI（R0136S 10000units）購于美國 NEB公司。T4連接酶（2011A 25 000U）、PCR PrimerSTAR MaxDNA Polymerase（R045Q 50μl×25次）購于日本Takara公司。膠回收試劑盒（ID28704 50次）和質(zhì)粒抽提試劑盒（ID12362 500次）購于德國QIAGEN公司。PCR儀（BS97MyCyler）購于美國Bio-Rad公司，引物用Oligo Analyzer 1.6軟件設(shè)計生成。引物合成和基因測序分別由上海生工生物技術(shù)有限公司和上海鉑尚公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)pcDNA3.1（+）上的多克隆位點（MCS），本研究選定EcoRV和NotI，EcoRV 5′-3′序列為GAT∨ATC，酶切后為平末端；NotI5′-3′序列為GC∨GGCCGC，酶切后為粘性末端（5′-3′GGCC），目的基因為P90rsk、Nprl2、Mios、Ragc、S6k和Pkca（表1），用Oligo Analyzer軟件設(shè)計引物，每個靶基因各設(shè)計了3對引物，具體序列及退火溫度詳見表1。

表1 引物序列表

1.2.2 酶切質(zhì)粒 選用EcoRV和NotI雙酶切pcDNA3.1（+），形成平末端和粘性末端（5′-3′GGCC），1μg質(zhì)粒需要1μl酶，10×Cutsmart緩沖液2μl，其余用2次蒸餾水（ddH2O）補齊，體系20μl，37℃酶切15min～1h，酶切產(chǎn)物進行膠回收，或可加大酶切體系，-80℃保存酶切后的質(zhì)粒，可用于后續(xù)的分子克隆。

1.2.3 PCR擴增目的片段 提取小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）的mRNA反轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNA文庫，以此為模板同時進行2次PCR，加入的1對引物分別是X-F和X-R（X為克隆的目的基因），X-F和GGCCX-R，兩者反應(yīng)體系均為50μl，反應(yīng)擴增的條件是：98℃變性5min；98℃變性10s；退火溫度（表1）30s；72℃延伸（1kb/min依據(jù)不同基因長度），經(jīng)過30個循環(huán)，72℃延伸5min后4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，每個樣本取5μl用1%瓊脂凝膠電泳檢測PCR擴增效率，在130V電泳30min，用凝膠成像檢測，可以得到2種產(chǎn)物，一種是靶基因全長，另外一種除了保留靶基因全長在其3′末端增加了一段GGCC序列（表2、圖1）。PCR結(jié)束后，用膠回收試劑盒回收目的條帶。

表2 PCR反應(yīng)體系

1.2.4 退火 可得到2種不同的PCR產(chǎn)物，割膠回收后把2種產(chǎn)物混在一起，經(jīng)過98℃1min、52℃1min、72℃1min、25℃1min的退火程序，可得到2種不同的產(chǎn)物。

1.2.5 連接 酶切的質(zhì)粒和退火后的產(chǎn)物摩爾比介于1∶3～1∶10連接效率最高，加入連接酶和連接緩沖液，16～ 25℃連接30min～2h。

1.2.6 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α 連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α。取全部的連接產(chǎn)物加入到100μl的感受態(tài)細胞內(nèi)，于冰上放置15min，然后42℃熱擊90s，加入冰育的無抗LB培養(yǎng)基1ml，于搖床37℃轉(zhuǎn)速為220r/min孵育1h，將整個混合液鋪到含有抗生素的LB固體培養(yǎng)基，37℃孵育過夜12～16h。

1.2.7 挑取單克隆抽質(zhì)粒測序鑒定 挑選單克隆2個，接種到含有抗生素的4 ml的LB液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為220r/min，37℃培養(yǎng)箱孵育過夜12～16h，用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，后續(xù)單酶切及測序鑒定。

1.2.8 BamHI單酶切鑒定 取克隆質(zhì)粒1μg，1μl內(nèi)切酶BamHI，2×Cutsmart緩沖液5 μl，加ddH2O至10μl體系，37℃酶切15min～1h，酶切產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，130V30min。

2 結(jié)果

2.1 克隆的過程圖 見插頁圖1。

由圖1可見，選擇真核常用的載體pcDNA3.1（+）以及2個限制性酶切位點EcoRV和NotI，EcoRV 5′-3′序列為GAT∨ATC，產(chǎn)生平末端，NotI 5′-3′序列為GC∨GGCCGC，產(chǎn)生粘性末端，載體轉(zhuǎn)錄方向是從EcoRV到NotI，圖1酶切后的載體末端是GAT平末端和GGCC粘性末端。根據(jù)酶切位點和基因序列設(shè)計3條引物：引物1和2基于目的基因序列設(shè)計的引物，引物3是基于目的基因3′端加入NotI酶切粘性末端GGCC序列（圖1，引物1紅箭頭，引物2藍箭頭，引物3藍箭頭GGCC）。將引物1和引物2組合，引物1和引物3組合，進行2次獨立的以目的基因為模板，分別擴增出目的基因和目的基因3′端增有GGCC序列，1%瓊脂糖凝膠電泳跑膠并割膠回收，然后混合兩種PCR產(chǎn)物，進行如下反應(yīng)：98℃1min、52℃1min、72℃1min、25℃1min，模擬解鏈、退火和延伸過程，形成2種帶有粘性末端的產(chǎn)物，只有1種產(chǎn)物能與酶切后的載體匹配，隨之將退火后的產(chǎn)物與限制性內(nèi)切酶切后的質(zhì)粒常規(guī)連接，只有能匹配的片段才能在連接酶作用下形成完整的帶有目的片段的重組DNA，隨后把連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α，涂板于含有抗性的固體LB培養(yǎng)基，挑單克隆抽提質(zhì)粒。

2.2 BamHI單酶切鑒定重組DNA結(jié)果 從各個轉(zhuǎn)化平板上挑選2個單克隆，擴增純化抽提質(zhì)粒，因pcDNA3.1（+）和基因內(nèi)部各存在1個BamHI限制性酶切位點，故酶切重組DNA后，若是陽性結(jié)果則會有雙條帶。根據(jù)跑膠結(jié)果，只有4號泳道的P90rsk質(zhì)粒未克隆成功（圖2），挑選PCR結(jié)果正確的質(zhì)粒送測序。

圖2 重組質(zhì)粒的BamHI單酶切結(jié)果（M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～2：Mios；3～4：P90rsk；5～6：Pkca；7～8：S6k；9～10：Ragc：11～12：Nprl2。結(jié)果顯示只有4號重組DNA未能將基因構(gòu)建在pcDNA3.1（+），其余均是雙條帶，表示克隆構(gòu)建成功）

2.3 基因測序結(jié)果 見圖3。

圖3 目的基因測序結(jié)果（a:Mios；b:P90rsk；c:Nprl2；d:Pkca；e:Ragc；f:S6k）

由圖3可見，根據(jù)構(gòu)建的載體上有EcoRV的GAT序列以及設(shè)計的引物信息，可以很容易定位到插入的基因片段，Pubmed搜索到全基因序列，依次比對即可。圖3方括號括出GAT+5′引物，測序結(jié)果顯示送測的克隆完全正確。圖3挑選其中一個正確測序結(jié)果顯示，序列中沒有堿基突變、堿基缺失、堿基插入。

3 討論

傳統(tǒng)將目的基因進行PCR的產(chǎn)物酶切產(chǎn)生粘性末端的方法常會遇到兩大問題：第一，克隆單基因時受到基因內(nèi)所含限制性內(nèi)切酶的限制，往往因為基因片段太長會使得包含限制性內(nèi)切酶的數(shù)量和種類也隨之增大，當(dāng)基因含有目標(biāo)載體多克隆位點上所有的限制性內(nèi)切酶時，傳統(tǒng)的克隆方法即用限制性內(nèi)切酶切割PCR產(chǎn)物產(chǎn)生粘性末端的方法將不能實現(xiàn)基因克隆的目的；第二，當(dāng)需要同時克隆多個基因時，因為各個基因序列不一引起的限制性內(nèi)切酶的選擇不一，使得多個基因（即使是幾個基因）的克隆變成一個浩大的工程，費時費力，而且不一定都能夠成功拿到重組質(zhì)粒。基于此，通過將粘性末端設(shè)計在引物上，通過PCR產(chǎn)物的退火來產(chǎn)生實驗所需要的粘性末端，將所有需要克隆的目的基因均一化，不再考慮基因內(nèi)部所包含的限制性內(nèi)切酶的多少，只需設(shè)計前向和后向引物即可。在多基因同時克隆時，退火產(chǎn)生粘性末端的方法所具有的優(yōu)勢使得多基因單一化，即用同一個模式克隆所有需要的基因：只需要選擇質(zhì)粒多克隆位點上任意兩個限制性內(nèi)切酶，將質(zhì)粒進行酶切回收，為隨后的連接反應(yīng)作好準(zhǔn)備。將對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切出的粘性末端序列加到每一個需要克隆的基因引物上，統(tǒng)一進行PCR擴增目標(biāo)基因與膠回收，然后將成對的PCR產(chǎn)物進行4min的退火反應(yīng)，即可進行連接，大大降低了克隆的工作量，使得克隆乃至批量克隆成為一件簡單的事情。

退火反應(yīng)也有不足的地方，即1個基因的克隆至少需要3條引物，選擇的限制性內(nèi)切酶所切出的末端都是粘性末端則需要4條引物，相較于傳統(tǒng)分子克隆，增加了引物合成的成本。不過隨著生物合成技術(shù)越來越成熟，合成引物的費用也在逐漸減少，退火產(chǎn)生粘性末端的方法將會是花費少、不費時的克隆選擇。

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A new method for gene clone producing cohesive terminals by annealingreaction

ZHAO Tingting,ZENG Jingjing,WANG Qijun,et al.Department of Pediatrics,the Second Affiliated Hospital/Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027,China

Molecular cloning Polymerase chain reaction Annealing Restriction site Cohesive end

2017-05-05）

（本文編輯：馬雯娜）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.14.2017-1035

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LZ17H250001）

325027 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院/育嬰兒童醫(yī)院兒科（趙婷婷、曾靜靜、褚茂平）；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院、上海市免疫學(xué)研究所（王啟軍）

褚茂平，E-mail：chmping@hotmail.com

【 Abstract】 Objective To develop a new effective gene clone method by designing three or four primers to produce cohesive terminals. Methods Two independent PCRs were run based on these designed primers,mixed the two PCR products together,and then went through denaturation and annealing.After that,the mixed products were ligated with the digested vector and the ligation products were transformed into DH5α competent cells. Results The target genes(P90rsk,Nprl2,Mios,Ragc, S6k,Pkca)were constructed on vector pcDNA3.1(+),which were digested with EcoRVand NotI.The constructedgenes were verified by single restriction digestion and sequencing. Conclusion The developed method overcomes the limitation ofrestriction endonuclease sites present in the target genes and can also omit the digestion process of the PCR products and subsequent purification.