精制補中益氣顆粒對5-FU化療大腸癌移植瘤小鼠腸道損傷研究作用

劉雪東，劉麗雅，沈阿靈，彭軍，符彩選，褚劍鋒，2，林珊，林久茂，陳友琴

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122）

精制補中益氣顆粒對5-FU化療大腸癌移植瘤小鼠腸道損傷研究作用

劉雪東1，劉麗雅1，沈阿靈1，彭軍1，符彩選1，褚劍鋒1，2，林珊1，林久茂1，陳友琴1

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122）

目的研究精制補中益氣顆粒（HT185）對5-FU化療大腸癌移植瘤小鼠腸道損傷的保護作用。方法構(gòu)建大腸癌移植瘤小鼠5-FU化療腸道損傷模型，按照瘤體體積隨機分為對照組、HT185組、5-FU組、5-FU+HT185組，每組10只；每天觀察小鼠一般生活狀態(tài)；測量小鼠體重；觀察糞便質(zhì)地，根據(jù)腹瀉評分進行分級；HE（蘇木素-伊紅）染色觀察空腸組織病理形態(tài)，評估損傷程度；IHC（免疫組化）檢測TUNEL、Bax、Bcl2指標(biāo)觀察空腸組織腸腺隱窩細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果與對照組相比較，5-FU組小鼠的活動度降低、毛發(fā)枯槁、體重減輕，腹瀉嚴(yán)重；空腸組織腸絨毛斷裂、長度變短，腸道細(xì)胞、固有層水腫；TUNEL、Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl2表達(dá)下調(diào)。與5-FU組相比較，5-FU+HT185組小鼠，活動度提高、毛發(fā)光亮，腹瀉次數(shù)明顯減少；空腸組織完整性，絨毛長度、腸細(xì)胞、固有層水腫等情況明顯改善；TUNEL、Bax表達(dá)下調(diào)，Bcl2表達(dá)上調(diào)。結(jié)論HT185能夠減輕大腸癌移植瘤小鼠5-FU化療所致的腸道損傷，調(diào)節(jié)促凋亡蛋白Bax、促進抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)，可能是HT185對大腸癌移植瘤小鼠5-FU化療腸道損傷保護的作用機制之一。

大腸癌；5-氟尿嘧啶；腸道損傷；補中益氣顆粒

化療是大腸癌主要治療手段之一，化療藥物起到“細(xì)胞毒”和“促進分化”等作用，達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞、抑制癌細(xì)胞增殖和促進癌細(xì)胞分化的目的。5-氟尿嘧啶（5-FU）作為大腸癌基礎(chǔ)化療用藥［1-3］，在殺死腸癌細(xì)胞的同時，對正常組織細(xì)胞也造成了一定的損傷，如腸道絨毛損傷和腸腺隱窩細(xì)胞凋亡，影響營養(yǎng)物質(zhì)和水分的吸收，導(dǎo)致惡心、嘔吐、腹瀉等胃腸道毒副作用［4-6］。諸多的毒副反應(yīng)常成為化療藥物提高療效的主要障礙?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要以對癥治療的手段來防治化療藥物給機體帶來的毒副作用，如5-羥色胺拮抗劑、奧美拉唑制酸劑，此類藥物起到一定效果，但具有一定局限性［7-8］。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為化療藥物的毒副反應(yīng)是化療藥物對脾胃造成了損傷，補中益氣顆粒（HT185）具有補中益氣、健脾和胃，固本培元等功效，此治療原則符合5-FU引起的毒副反應(yīng)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)HT185具有減輕5-FU化療導(dǎo)致的腸道損傷的作用，但機理尚未清楚［9］。故本文基于前期研究，進一步探討HT185對5-FU化療引起的腸道損傷的保護機制，為HT185的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物精制補中益氣顆粒（紅藤，批號TCM-2561631，陜西；女貞子，批號TCM-5684912，浙江；黃芪，批號TCM-6478110，福建）；5-FU（上海市旭東海普藥場，藥品規(guī)格：250 mg／10 mL）。

1.2 實驗動物BALB／c小鼠，4～6周齡，SPF級，雄性，體重（18±22）g，購自海斯萊克動物實驗中心，許可證號為［SCXK（滬）2008-0016］。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心SPF級別實驗室，人工飼養(yǎng)，恒濕、恒溫、12 h光照／d、全天通風(fēng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后，進行后續(xù)的實驗。在實驗期間為小鼠按時提供食物、水。

1.3 實驗細(xì)胞結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26源于BALB／c小鼠（目錄號TCM37），購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

1.4 實驗試劑RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清（FBS）、青鏈霉素雙抗溶液（美國Thermo公司）；基質(zhì)膠（Becton，Dickinson and Company）；無水乙醇、多聚甲醛粉末、二甲苯（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；生理鹽水（福州海王福藥制藥有限公司）；磷酸鹽緩沖劑（PBS）、枸櫞酸鈉粉劑型抗原修復(fù)液、DAB染色液、中性樹膠封片劑（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；蘇木素／伊紅染色液（中國索萊寶科技有限公司）；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物技術(shù)有限公司）。

1.5 實驗儀器CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）；電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；YWY781B醫(yī)用微波爐（浙江臨安愛迪儀器廠）；生物組織石蠟包埋機、生物組織脫水機（湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)（LAS V4.1）；DM4000B顯微鏡、石蠟切片機（德國徠卡儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 藥品的配制①5-FU注射液的配制：用生理鹽水稀釋5－FU配制成濃度為10 mg／mL的藥液，充分混勻后備用。②精制補中益氣顆粒溶液制備：將紅藤、黃芪、女貞子分別打碎成藥粉，過篩，按2∶1∶1比例混合，置于蒸餾瓶中浸泡30 min，冷凝回流1 h／次，共2次。紗布過濾、去渣，離心5000轉(zhuǎn)／min，20 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，恒溫水浴鍋蒸浸膏，真空干燥成顆粒劑備用。用生理鹽水溶解顆粒劑配制成濃度為1240 mg／mL的藥液，超聲溶解后高壓滅菌，恢復(fù)室溫后備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)將CT26細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% FBS、100 μg／mL鏈霉素和100 U／mL青霉素的RPIM-1640培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞單層貼壁長至80%～90%匯合度時，用0.25%含EDTA胰蛋白酶進行消化，按1∶3傳代于培養(yǎng)瓶中。

2.3 建立動物移植瘤模型、動物分組及給藥待鼠源性結(jié)腸癌CT26細(xì)胞處于對數(shù)生長期時制備成單細(xì)胞懸液，以2×106／mL細(xì)胞濃度與基質(zhì)膠進行1∶1混合，按0.2 mL／只的細(xì)胞數(shù)，于BALB／c小鼠右側(cè)腋窩皮下處接種。待瘤體體積增至200～300 mm3，按瘤體體積大小隨機分為對照組、HT185組、5-FU組、HT185＋5-FU組，每組10只。5-FU注射液按小鼠體重100 mg／kg腹腔注射給藥；HT185溶液按小鼠體重12.4 g／kg灌胃給藥（按臨床成人劑量換算）；對照組小鼠分別給予等量的生理鹽水灌胃和腹腔注射。各組于分組當(dāng)天開始給藥進行干預(yù)，HT185溶液灌胃1次／d（0.1 mL／10 g），連續(xù)給藥18 d，5-FU于分組后第1、8、15 d腹腔各注射1次。

2.4 標(biāo)本采集小鼠于最后1次給藥后禁食不禁水12 h，予頸椎脫臼法處死，在距離幽門下端15 cm處取2 cm長度空腸組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h后，更換70%無水乙醇，進一步梯度脫水、透明，石蠟包埋備用。

2.5 觀察指標(biāo)

2.5.1 小鼠一般生活狀態(tài)給藥期間每天觀察小鼠活動狀況、毛發(fā)的光澤度等一般生長狀況，并對小鼠體重進行稱量。

2.5.2 小鼠腹瀉情況及等級評分每天觀察小鼠糞便質(zhì)地并及時記錄，參照Liu ZZ［7］等級評分標(biāo)準(zhǔn)進行小鼠的腹瀉情況等級評分。

2.5.3 腸黏膜損傷程度蘇木素-伊紅染色法鏡下觀察各組小鼠腸組織病理形態(tài)學(xué)改變。用Leica DM4000B顯微鏡對病理圖像進行采集分析，并根據(jù)Macpherson and Pfeiffer腸組織病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)［8］，進行小鼠空腸組織損傷程度的等級評分。

2.6 腸腺隱窩細(xì)胞凋亡TUNEL法檢測各組小鼠空腸組織腸腺隱窩細(xì)胞凋亡情況。用Leica DM4000B顯微鏡進行病理圖像采集，采用陽性率進行半定量分析。

2.7Bax和Bcl2表達(dá)采用免疫組化（IHC）觀察Bax和Bcl2在各組空腸組織中表達(dá)的變化。用Leica DM4000B顯微鏡進行病理圖像采集，采用陽性率進行半定量分析。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料用（x±s）表示，2組間的數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組間的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析檢驗；計數(shù)資料采用確切概率法進行檢驗分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 小鼠一般生活狀況比較對照組、HT185組小鼠生長情況較好，均喜活動，活動敏捷，皮毛光亮。較對照組相比，5-FU組小鼠皮毛枯槁，活動少，經(jīng)常群聚，動作比較遲鈍。較5-FU組小鼠相比，5-FU＋HT185組小鼠仍喜活動，動作靈敏度尚可，皮毛光澤度較好。實驗結(jié)果表明，HT185藥物對小鼠的一般生活狀態(tài)無毒副反應(yīng)，但明顯能夠改善大腸癌5-FU化療小鼠的生活質(zhì)量。

3.2 小鼠體質(zhì)量比較HT185對5-FU組小鼠體重減輕無明顯改善作用，見表1。

表1 4組小鼠體質(zhì)量變化比較（x±s）

3.3 小鼠腹瀉癥狀評分比較較對照組和單獨HT185藥物組比，5-FU組小鼠腹瀉次數(shù)明顯增多，聯(lián)合組小鼠腹瀉次數(shù)較5-FU組明顯減少。HT185對5-FU所致的腹瀉有明顯的改善作用。見表2。

表2 4組小鼠腹瀉癥狀評分比較（x±s）

3.4HT185對5-FU引起空腸組織損傷的影響

3.4.1 采用HE染色觀察小鼠空腸組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及損傷程度評分的影響，與對照組HT185組比，5-FU組小鼠空腸組織腸絨毛斷裂、長度變短，腸細(xì)胞、固有層水腫。較5-FU組比，5-FU＋HT185組小鼠空腸組織腸絨毛完整性、絨毛長度，腸細(xì)胞、固有層水腫等情況明顯改善。見圖1、2。

圖1 4組小鼠空腸組織病理形態(tài)圖（HE染色）

圖2 空腸組織絨毛長度與腸腺隱窩深度比值比較

3.4.2 小鼠空腸組織病理學(xué)評分比較見表3。

表3 4組小鼠空腸組織病理學(xué)評分比較（x±s）

3.5 空腸腺隱窩細(xì)胞凋亡數(shù)量見圖3、4。

圖3 HT185對5-FU引起空腸腺隱窩細(xì)胞凋亡數(shù)量的影響（×400）

3.6 空腸腺隱窩細(xì)胞Bax和Bcl2表達(dá)見圖5、6和圖7、8。

圖4 4組小鼠空腸腺隱窩細(xì)胞凋亡數(shù)量比較

4 討論

本研究結(jié)果表明，5-FU組小鼠活動減少、體質(zhì)量減輕、腹瀉、腸道腺隱窩細(xì)胞數(shù)量減少，與臨床大腸癌患者化療的腸道毒副反應(yīng)基本一致。蘇木素-伊紅染色結(jié)果進一步表明，5-FU組小鼠空腸組織腺體排列不規(guī)則、腸絨毛斷裂、腸道細(xì)胞水腫、固有層水腫和炎性細(xì)胞浸潤。

圖5 Bax在4組小鼠空腸腺隱窩細(xì)胞的表達(dá)（IHC，×400）

圖7 Bcl2在4組小鼠空腸腺隱窩細(xì)胞的表達(dá)（IHC，×400）

愈來愈多的臨床研究和基礎(chǔ)實驗研究表明，中草藥聯(lián)合化療藥在腫瘤治療方面的應(yīng)用具有獨特優(yōu)勢，特別是在提高化療藥物療效、降低化療藥物引起的毒副反應(yīng)、提高患者化療期間及化療后的生活質(zhì)量［9-16］等方面具有顯著的特點，這也體現(xiàn)了中西醫(yī)結(jié)合治療疾病的特色，發(fā)揮中、西醫(yī)各自的優(yōu)勢和長處，兩者聯(lián)合可減輕單純應(yīng)用化療藥給機體帶來的不可逆損傷。

圖6 4組小鼠空腸腺隱窩細(xì)胞Bax表達(dá)比較

圖8 4組小鼠空腸腺隱窩細(xì)胞Bcl2表達(dá)比較

HT185是臨床經(jīng)驗方，由紅藤、黃芪、女貞子三種中藥材按2∶1∶1比例組成［17］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，紅藤清熱解毒、消腫散結(jié)、活血散瘀、通經(jīng)止痛；黃芪益氣固本、扶正祛邪；女貞子滋補肝腎、明目烏發(fā)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，紅藤具有抗炎、抗腫瘤、免疫抑制等藥理作用［18］；黃芪具有調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)等藥理作用［19］；女貞子具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用［20］。研究結(jié)果提示，HT185與5-FU聯(lián)合應(yīng)用，不僅顯著改善5-FU化療后小鼠活動度、毛發(fā)色澤等一般生活狀況，而且能夠顯著改善5-FU化療引起的腸道絨毛損傷和抑制腸腺隱窩細(xì)胞的凋亡。5-FU所致的腸道損傷、固有層的水腫、炎癥浸潤等免疫損傷機制還有待于進一步研究。

本實驗結(jié)果表明，5-FU干預(yù)后，腸腺隱窩細(xì)胞發(fā)生大量凋亡，且抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)明顯下降，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)明顯升高。較5-FU組比較，精制補中益氣顆粒干預(yù)后，腸腺隱窩細(xì)胞的大量凋亡情況明顯的得到了改善，且能夠明顯的上調(diào)Bcl2的表達(dá)和明顯下調(diào)Bax的表達(dá)。故精制補中益氣顆粒對5-FU化療大腸癌移植瘤小鼠的腸道損傷具有保護作用。由此，為其用于大腸癌化療患者的輔助治療提供了實驗基礎(chǔ)。

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R285.5

B

1000-338X（2017）03-0054-04

2017-02-27

福建省百千萬人才工程（750020006）

劉雪東（1988—），男，2014級中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)專業(yè)碩士研究生。

彭軍（1969—），男，醫(yī)學(xué)博士，研究員，博士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)藥分子機制研究。E-mail：pjunlab@hotmail.com