缺氧對血府逐瘀膠囊促血管新生影響的研究

蔡飛，蘇曉艷，王鶴，秦崇濤，宋軍，高冬

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建福州350122；2.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京100700）

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缺氧對血府逐瘀膠囊促血管新生影響的研究

蔡飛1，蘇曉艷2，王鶴1，秦崇濤1，宋軍2，高冬1

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建福州350122；2.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京100700）

目的研究血府逐瘀膠囊在缺氧條件下對血管新生的影響。方法通過觀察血府逐瘀膠囊含藥血清在缺氧條件下對HMEC-1細(xì)胞的活力、增殖能力、黏附能力、遷移能力和體外成血管能力的影響，明確缺氧條件對藥物促血管新生作用的影響。結(jié)果缺氧條件下含藥血清在低濃度早、中期增加HMEC-1細(xì)胞活力，提高遷移及黏附能力；中、高濃度含藥血清早期促進(jìn)血管管腔形成，隨后促管腔形成作用消失。結(jié)論缺氧條件下血府逐瘀膠囊通過影響HMEC-1細(xì)胞活力、遷移、黏附能力等環(huán)節(jié)來保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管新生。

血府逐瘀膠囊；血管新生；缺氧

缺血性疾病系由各種原因?qū)е聞用}或靜脈的血流不足或中斷，致使相應(yīng)的組織和器官出現(xiàn)不同程度的缺氧缺血損傷，而產(chǎn)生臨床上相對應(yīng)的組織、器官、神經(jīng)等功能缺失的表現(xiàn)。近年來，缺血性疾病嚴(yán)重危害著人類健康，血管新生在缺血性疾病的治療和愈后中意義重大［1］。血管新生通常發(fā)生在營養(yǎng)不足或缺血缺氧等病理?xiàng)l件下，因此本實(shí)驗(yàn)意在通過在缺氧培養(yǎng)條件下，觀察血府逐瘀膠囊含藥血清對人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1活力、增殖、黏附、遷移和形成管腔的影響，探討血府逐瘀膠囊在缺氧條件下對血管新生的影響及其促血管生長的行為特征，從細(xì)胞水平明確藥物促進(jìn)血管新生的作用機(jī)制，也為血府逐瘀膠囊的臨床使用提供有力的科學(xué)理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及細(xì)胞株SPF級SD雄性大鼠40只，6周齡，體重（150±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供（NO.0037614），由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心［許可證號：SYXK（閩）2009-0001］飼養(yǎng)。HMEC-1細(xì)胞株由中科院上海藥物研究所丁健院士惠贈。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物血府逐瘀膠囊由天津宏仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，0.4 g／粒，藥品批號為A03149。用生理鹽水溶解配制成濃度為0.041 g／mL的藥液。

1.3 試劑及儀器胎牛血清（FBS，美國GIBCO公司），體外血管生成試劑盒（美國Millipore公司），循環(huán)測試DNA試劑盒（美國BD公司），MCDB-131培養(yǎng)基（美國GIBCO公司），MTT（美國Sigma公司），結(jié)晶紫細(xì)胞群落染色試劑盒（上海捷美基因公司），DMSO（北京Solarbio公司），F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司），8000系列水套三氣厭氧培養(yǎng)箱（美國Thermo scientific），IX70倒置相差顯微鏡及數(shù)碼攝像裝置（日本Olympus公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組和含藥血清制備SPF級SD雄性大鼠40只，隨機(jī)分為藥物組和空白組，每組20只。藥物組以血府逐瘀膠囊藥液灌胃，給藥劑量為每天0.41 g／kg，相當(dāng)于臨床常用劑量的2倍；空白組以等量生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃7天，2次／天，第8天灌胃后2 h腹主動脈采血，離心分離血清，56℃水浴鍋滅活，過濾除菌，分裝，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)將HMEC－1細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的MCDB-131培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)接種4 h細(xì)胞貼壁后更換含不同濃度的空白血清和含藥血清MCDB-131培養(yǎng)液，具體干預(yù)分組如下：1.25%、2.5%、5%含藥血清組與1.25%、2.5%、5%空白血清組，置于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后開展各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

2.4MTT實(shí)驗(yàn)按0.5×104個／mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分組干預(yù)后，置缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每孔加入5 mg／mL的MTT溶液20 μL，置于原培養(yǎng)條件4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，置于主波長為570 nm、參比波長為630 nm的酶標(biāo)儀中，測定各孔的吸光度值（OD值）。每組設(shè)為6個平行孔，重復(fù)3次。

2.5 細(xì)胞周期檢測按5×105個／mL接種于直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，分組干預(yù)后，置缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，根據(jù)循環(huán)測試DNA試劑盒說明書操作。使用FACSCAN流式細(xì)胞儀檢測處于S期細(xì)胞所占比例，ModiFit軟件分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)按2×105個／mL細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分組干預(yù)后，置缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，胰酶消化收集，稀釋至2× 104個／mL的細(xì)胞密度，毎孔100 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，原培養(yǎng)條件培養(yǎng)1 h后，棄培養(yǎng)液，按照結(jié)晶紫細(xì)胞群落染色試劑盒說明書操作，固定15 min，染色20 min，晾干后拍照，計數(shù)黏附的細(xì)胞。每組設(shè)有6個平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)按2×105個／mL細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分組干預(yù)后，置缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。①在Transwell室孔中加入培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h；②取出缺氧培養(yǎng)箱中細(xì)胞，棄原培養(yǎng)液，消化收集成單細(xì)胞懸液，稀釋為2×105個／mL的細(xì)胞懸浮液；③將細(xì)胞懸浮液按100 μL／室加入至培養(yǎng)1 h后的Transwell小室，置缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，取出Transwell小室，按結(jié)晶紫細(xì)胞群落染色試劑盒說明書操作，計數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)量。每組設(shè)有3個小室，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 體外成血管實(shí)驗(yàn)按2×105個／mL細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分組干預(yù)后，置缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，按體外血管生成試劑盒說明書操作后，置于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，拍照，計數(shù)管腔形成數(shù)。設(shè)3個平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件分析處理，計量資料用（x±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 缺氧對細(xì)胞活力影響比較缺氧條件下低濃度含藥血清短時間能顯著增加細(xì)胞活力，見表1。

表1 缺氧對細(xì)胞活力影響比較（x±s，n＝6）

3.2 缺氧對細(xì)胞增殖能力比較缺氧條件下，藥物對細(xì)胞增殖沒有影響，見表2。

3.3 缺氧對細(xì)胞遷移情況比較在缺氧條件下，藥物低濃度早期促進(jìn)細(xì)胞遷移，中濃度先抑制后促進(jìn)細(xì)胞遷移，而高濃度中期促進(jìn)細(xì)胞遷移，最終作用消失，見表3。

3.4 缺氧對細(xì)胞黏附情況比較在缺氧條件下，中濃度藥物促進(jìn)細(xì)胞黏附，高濃度抑制細(xì)胞黏附，見表4。

表2 缺氧對細(xì)胞增殖能力比較（x±s，n＝3）

表3 缺氧對細(xì)胞遷移情況比較（x±s，n＝6）

表4 缺氧對細(xì)胞黏附情況比較（x±s，n＝6）

3.5 缺氧對細(xì)胞體外血管腔形成能力比較在缺氧環(huán)境下，中、高濃度血府逐瘀膠囊能夠在作用較早期促進(jìn)血管管腔形成，隨后促管腔形成作用消失，見表5。

表5 缺氧對細(xì)胞體外血管腔形成能力比較（x±s，n＝18）

4 討論

血府逐瘀湯是清代醫(yī)家王清任活血化瘀法最具代表性的方劑。該方由桃仁、紅花、生地、當(dāng)歸等11味中藥組成，血府逐瘀膠囊是按照該藥物組成而生產(chǎn)的膠囊制劑，目前在臨床上被廣泛用于各種缺血性疾病的防治［2］，如冠心病、缺血性腦血管病、動脈粥樣硬化等，還用于輔助治療腫瘤［3］。早期藥理學(xué)研究表明，血府逐瘀湯可改變血液凝固性和血液流變性，具有舒張血管、降低血管阻力、改善毛細(xì)血管通透性、保護(hù)心肌細(xì)胞等多種藥理作用［4］。因此，我們在此基礎(chǔ)上開展的系列研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的血府逐瘀湯通過NO誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移至缺血區(qū)，發(fā)揮促血管新生的作用，改善了局部缺血壞死的狀況，避免了患肢出現(xiàn)肌肉萎縮［5］。而本實(shí)驗(yàn)從體外細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下血府逐瘀膠囊可以增加HMEC-1細(xì)胞活性，提高細(xì)胞遷移、黏附和體外血管腔形成能力，通過多環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)血管新生，為血府逐瘀膠囊治療缺血性疾病的臨床運(yùn)用提供了細(xì)胞水平的作用機(jī)制以及更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本課題組前期開展了一系列血府逐瘀湯在常氧條件下促血管生長的實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)缺氧條件的研究，進(jìn)一步肯定了藥物促血管新生的作用，而且更全面豐富了藥物影響血管生長的認(rèn)識。通過比較本實(shí)驗(yàn)缺氧條件與前期非缺氧條件的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果［6-7］，我們發(fā)現(xiàn)缺氧條件下1.25%藥物血清作用24 h、48 h可增強(qiáng)細(xì)胞活力，而常氧條件下藥物增強(qiáng)細(xì)胞活力僅發(fā)生在2.5%濃度作用48 h。另外，缺氧條件下1.25%藥物血清作用24 h、2.5%濃度作用48 h、72 h和5%濃度作用48 h，均可促進(jìn)細(xì)胞遷移，而常氧條件下含藥血清促進(jìn)細(xì)胞遷移發(fā)生在2.5%、5%濃度作用48 h，說明藥物在缺氧條件下對細(xì)胞活性和遷移的促進(jìn)作用出現(xiàn)在更低濃度和更早的作用時間。缺氧條件下2.5%和5%含藥血清僅在干預(yù)24 h出現(xiàn)短暫的促血管形成的作用，而常氧條件下藥效時間點(diǎn)推遲到48 h，且高濃度5%含藥血清干預(yù)72 h會抑制血管形成，表現(xiàn)出短暫促血管生長以及對血管生長的雙向調(diào)節(jié)作用。上述結(jié)果提示藥物只能短暫地促血管生長，且其作用方式與生理?xiàng)l件的變化密切相關(guān)。

另外研究發(fā)現(xiàn)缺氧會造成細(xì)胞凋亡率增加［8-10］，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)壞死，活性降低［11］，并可抑制細(xì)胞增殖［8，11］。石曉明等［12］還發(fā)現(xiàn)低氧處理ECV304細(xì)胞24 h、48 h、72 h，處于G0／G1期的細(xì)胞均顯著增加，S期細(xì)胞明顯減少，在抑制細(xì)胞增殖的同時還抑制細(xì)胞遷移和體外形成血管腔［13］。在大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行缺氧處理也發(fā)現(xiàn)相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［14］。這些實(shí)驗(yàn)說明缺氧會抑制細(xì)胞的活力，增殖、遷移、黏附及管腔形成能力，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果血府逐瘀膠囊增強(qiáng)細(xì)胞的活力，促進(jìn)細(xì)胞遷移、黏附和管腔的形成，并消除缺氧對細(xì)胞增殖的抑制作用，從側(cè)面說明了血府逐瘀膠囊在缺氧條件下對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，顯示出血府逐瘀膠囊用于各種缺血性疾病的防治的優(yōu)點(diǎn)。目前對于缺氧與血管新生的研究顯示，在缺氧條件下VEGF［15-16］、腺苷［17］、HIF、趨化因子等調(diào)控因子及其介導(dǎo)的如：Notch／Dll4、cAMP-PKA-CREB等信號通路都與血管新生密切相關(guān)，但是在缺氧條件下血府逐瘀膠囊促血管新生作用機(jī)制是否也與這些因素相關(guān)，還需要我們進(jìn)一步深入研究，以加深藥物對血管新生調(diào)控作用的認(rèn)識。

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R285.5

B

1000-338X（2017）03-0051-03

2017-03-06

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81173431）

蔡飛（1991—），男，2014級中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)專業(yè)碩士研究生。

高冬（1967—），女，教授，主要從事血管新生研究。E-mail：gd1026@yahoo.com