基于分子對(duì)接研究獨(dú)活寄生湯作用MMP-1、MMP-3的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)

鄭春松，陳春蓉，林平冬，吳廣文，李西海，葉蕻芝，劉獻(xiàn)祥

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350122）

·實(shí)驗(yàn)研究·

基于分子對(duì)接研究獨(dú)活寄生湯作用MMP-1、MMP-3的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)

鄭春松1，2，陳春蓉2，林平冬2，吳廣文2，李西海2，葉蕻芝1，劉獻(xiàn)祥1

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350122）

目的探索獨(dú)活寄生湯作用基質(zhì)金屬酶-1（MMP-1）和基質(zhì)金屬酶-3（MMP-3）的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。方法運(yùn)用計(jì)算機(jī)模擬之分子對(duì)接技術(shù)，研究獨(dú)活寄生湯中化合物與MMP-1、MMP-3的相互作用，從中篩選出比原配體與各自靶蛋白作用的DOCK-SCORE高的化合物。結(jié)果以MMP-1為靶點(diǎn)，篩選出獨(dú)活寄生湯的潛在活性化合物172個(gè)，主要為苷類、黃酮類、有機(jī)酸類等化合物，其中，28個(gè)化合物也能作用于靶點(diǎn)MMP-3。結(jié)論以MMP-1、MMP-3為靶點(diǎn)，計(jì)算機(jī)模擬出獨(dú)活寄生湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為172個(gè)化合物，提示其可能是通過(guò)有效成分群發(fā)揮治療骨關(guān)節(jié)炎的作用，為其骨關(guān)節(jié)炎臨床使用提供依據(jù)。

獨(dú)活寄生湯；骨關(guān)節(jié)炎；基質(zhì)金屬酶；藥效物質(zhì)基礎(chǔ)；分子對(duì)接

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA），是一種以關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變及繼發(fā)性的骨質(zhì)增生為主要病理特點(diǎn)的慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病，已成為威脅人類健康最常見(jiàn)的一種疾?。?］。已有研究表明，正常的關(guān)節(jié)軟骨是由少量的軟骨細(xì)胞和大量的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)組成，其中，細(xì)胞外基質(zhì)中主要含有膠原纖維和聚蛋白多糖等大分子物質(zhì)。在OA中，當(dāng)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解超過(guò)其合成時(shí)，會(huì)降低軟骨基質(zhì)凈含量，進(jìn)而引起關(guān)節(jié)軟骨的部分甚至完全損耗，此為關(guān)節(jié)軟骨破壞的主要病理表現(xiàn)［2-3］。OA患者關(guān)節(jié)軟骨中基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase，MMP-1）和基質(zhì)金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinase，MMP-3）表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組，其是導(dǎo)致軟骨聚蛋白多糖和膠原降解的關(guān)鍵酶［3-4］。獨(dú)活寄生湯源自唐代醫(yī)家孫思邈的《備急千金要方》，由獨(dú)活、細(xì)辛、防風(fēng)、秦艽、肉桂和桑寄生等15味藥物組成，具有祛風(fēng)濕、止痹痛、益肝腎和補(bǔ)氣血的功效［5］。將其用于OA臨床，能保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，發(fā)揮緩解疼痛的的效果［6-7］。前期課題組已經(jīng)研究表明，獨(dú)活寄生湯含藥血清可抑制IL-1β誘導(dǎo)的退變關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中MMP-1、MMP-3的表達(dá)［8］。因此，筆者運(yùn)用分子對(duì)接［9-10］，尋找獨(dú)活寄生湯作用MMP-1和MMP-3的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，從分子層面為其臨床治療OA提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料獨(dú)活寄生湯分子集；MMP-1和MMP-3靶點(diǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備本研究使用北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院計(jì)算機(jī)模擬實(shí)驗(yàn)室的Discovery Studio（DS）軟件進(jìn)行計(jì)算，分子對(duì)接的模擬過(guò)程中涉及到的參數(shù)除非特別指明，否則均為默認(rèn)值。

2 方法

2.1 配體和靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)處理從《中藥原植物化學(xué)成分手冊(cè)》、北京大學(xué)中草藥有效成分三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)［10-13］，收集獨(dú)活寄生湯化學(xué)成分566個(gè)，利用ISIS／Draw 2.5和DS軟件，繪制其化學(xué)結(jié)構(gòu)，選用MMFF力場(chǎng)優(yōu)化，保存為sd文件，建立獨(dú)活寄生湯配體分子數(shù)據(jù)集。根據(jù)OA的發(fā)病機(jī)制［14］和治療靶數(shù)據(jù)庫(kù)［15］，確定與延緩軟骨退變密切相關(guān)的靶點(diǎn)MMP-1和MMP-3。在RCSB Protein Data Bank上［16］，下載MMP-1和MMP-3的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其代碼分別為3AYK和4G9L，見(jiàn)圖1。

圖1MMP-1、MMP-3的結(jié)構(gòu)

2.2 分子對(duì)接和打分在DS LigandFit模塊進(jìn)行獨(dú)活寄生湯分子集配體與OA靶點(diǎn)的對(duì)接工作［17］。其步驟為：①M(fèi)MP-1和MMP-3結(jié)構(gòu)去溶劑、去原配體、加氫處理后，用其結(jié)合的已知原配體活性化合物來(lái)確定活性位點(diǎn)；②使用Monte Carlo方法對(duì)獨(dú)活寄生湯的化學(xué)成分配體進(jìn)行構(gòu)象采樣、Dreiding力場(chǎng)下進(jìn)行打分，保留得分最高的構(gòu)象；③對(duì)對(duì)接成功的獨(dú)活寄生湯配體化合物按DOCKSCORE高低進(jìn)行排序，篩選出比原配體與各自靶蛋白作用的DOCK-SCORE高的化合物，視為獨(dú)活寄生湯中的活性成分［9，18］，即獨(dú)活寄生湯作用于MMP-1和MMP-3的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 結(jié)果

在DS LigandFit模塊中，配體和靶點(diǎn)的作用遵循能量互補(bǔ)、幾何互補(bǔ)以及化學(xué)環(huán)境互補(bǔ)等原則，尋找各自最佳的DOCK-SCORE。以蛋白結(jié)構(gòu)中已知的原配體活性化合物的DOCK-SCORE為閾值，發(fā)現(xiàn)獨(dú)活寄生湯潛在的活性成分172個(gè)，其中與MMP-1和MMP-3結(jié)合較好的化合物分別為172和28個(gè)，見(jiàn)表1和表2。結(jié)果顯示以MMP-1、MMP-3為靶點(diǎn)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)主要由苷類、黃酮類和有機(jī)酸類成分組成。

表1 以MMP-1為靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

4 討論

方劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是指中藥復(fù)方中發(fā)揮治療作用的化學(xué)成分，是闡明方劑藥效作用的關(guān)鍵［19］。而且，其有效成分是通過(guò)與體內(nèi)的生物靶點(diǎn)相互作用而產(chǎn)生藥效的，藥物-受體結(jié)合時(shí)，存在靜電、范德華力、氫鍵和疏水等相互作用。這些性質(zhì)可用分子模擬方法來(lái)計(jì)算［20］。分子對(duì)接計(jì)算作為最常用的分子模擬方法之一，它是將配體化合物置于受體活性位點(diǎn)，遵循幾何互補(bǔ)、能量互補(bǔ)以及化學(xué)環(huán)境互補(bǔ)的原則，來(lái)實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)配體與受體相互作用的好壞，從中找到配體與受體之間最佳的結(jié)合模式，該方法在中醫(yī)藥研究中已有很多成功的應(yīng)用。如曾茂貴等［21］利用分子對(duì)接LigandFit和Ligplot軟件研究扶正抑瘤復(fù)方中槲皮素、木犀草素、芹菜素與大豆黃素對(duì)環(huán)氧化酶-2的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素、木犀草素、芹菜素均有氫鍵作用，而大豆黃素沒(méi)有，從而揭示含有間二苯酚結(jié)構(gòu)的化合物更有可能對(duì)環(huán)氧化酶-2起作用。此外，龍偉等［22-24］也成功應(yīng)用分子對(duì)接技術(shù)揭示了黃連解毒湯、青風(fēng)藤、白芷的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。中藥復(fù)方是天然組合化學(xué)庫(kù)，如果應(yīng)用“中藥到活性成分”的傳統(tǒng)途徑來(lái)研究中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，常常會(huì)出現(xiàn)篩選時(shí)間較長(zhǎng)、假陽(yáng)性的干擾、漏篩的缺點(diǎn)［25－26］。因此，本文將獨(dú)活寄生湯看作組合化合物庫(kù)，運(yùn)用分子對(duì)接研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

表2 以MMP-3為靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

OA的特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)行性破壞，而MMPs的表達(dá)異常，會(huì)降解關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，引起關(guān)節(jié)軟骨腫脹，抵抗外力作用下降，進(jìn)而造成關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)行性破壞［1，27］。其中，MMP-1和MMP-3在OA退變軟骨中高表達(dá)，前者可使Ⅱ型膠原變性裂解，后者對(duì)蛋白聚糖有高度的裂解變性，還可激活前者，加速膠原的降解，使軟骨降解退變加劇［27-28］，提示MMP-1和MMP-3在關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)行性破壞中起到重要作用。而且，治療肝腎虧虛、風(fēng)濕痹阻痹證最常用且有效的古方獨(dú)活寄生湯已經(jīng)證實(shí)能介導(dǎo)Wnt／β-catenin-BMP信號(hào)通路，能延緩關(guān)節(jié)軟骨的退行性病變［7，29］。由此本研究以MMP-1和MMP-3為靶點(diǎn)，以獨(dú)活寄生湯為研究對(duì)象，借助分子對(duì)接平臺(tái)，開(kāi)展獨(dú)活寄生湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。表1和表2顯示獨(dú)活寄生湯中黃酮類（扁蓄苷、異槲皮苷等）、苷類（大葉苷D、地黃苷A等）、有機(jī)酸（綠原酸、京尼平苷酸等）等化合物能與MMP-1、MMP-3有很好的作用。有些化合物活性文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道［30］，如綠原酸對(duì)高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起的膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的保護(hù)作用等。因此，獨(dú)活寄生湯作用于MMP-1和MMP-3的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為苷類、黃酮類和有機(jī)酸等組成的有效成分群，是未來(lái)我們開(kāi)展獨(dú)活寄生湯治療OA的重點(diǎn)研究對(duì)象。

總之，本實(shí)驗(yàn)從“活性成分到中藥”的反向途徑出發(fā)，建立了獨(dú)活寄生湯的化學(xué)成分分子數(shù)據(jù)集，以MMP-1和MMP-3為靶點(diǎn)來(lái)建立OA軟骨退變的虛擬藥理模型，借助分子對(duì)接平臺(tái)，研究了獨(dú)活寄生湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。但該實(shí)驗(yàn)也存在2個(gè)不足：①由于現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)方中藥材的成分研究的局限，造成有些藥材的成分不全，進(jìn)而無(wú)法闡釋各組成藥材在獨(dú)活寄生湯復(fù)方中所各自起到的作用；②由于本研究的靶點(diǎn)僅局限于軟骨退變，進(jìn)而無(wú)法揭示獨(dú)活寄生湯中對(duì)于OA的治療起著關(guān)鍵性作用的化合物分子。后續(xù)本課題組將根據(jù)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)獨(dú)活寄生湯中各藥材成分的陸續(xù)報(bào)道，進(jìn)一步完善其配體分子數(shù)據(jù)集，也會(huì)增加OA的靶點(diǎn)數(shù)目，開(kāi)展獨(dú)活寄生湯治療OA的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究［31］，無(wú)疑有助于解決以上問(wèn)題。

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R285.5

B

1000-338X（2017）03-0037-03

2017-03-23

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015J01338），福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目（JA14152）

鄭春松（1982—），男，醫(yī)學(xué)博士，主要從事骨關(guān)節(jié)炎研究。