西紅花苷預(yù)處理對(duì)急性高海拔低氧下大鼠海馬組織NF-κB及血清TNF-α的影響

張曉巖，張先鈞，賈煒，蒲小燕，王海燕，梁宏，張杰(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧810016)

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西紅花苷預(yù)處理對(duì)急性高海拔低氧下大鼠海馬組織NF-κB及血清TNF-α的影響

張曉巖，張先鈞，賈煒，蒲小燕，王海燕，梁宏，張杰
(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧810016)

目的 觀察西紅花苷預(yù)處理對(duì)急性高海拔低氧條件下大鼠腦海馬組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)表達(dá)及血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平的影響。方法 將96只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組各48只，觀察組給予西紅花苷50 mg/(kg·d)肌內(nèi)注射，對(duì)照組給予等量生理鹽水肌內(nèi)注射。連續(xù)給藥3 d后運(yùn)至高海拔低氧環(huán)境，在第1、3、5、7天取材。取大鼠腦海馬組織，采用RT-PCR方法檢測NF-κB mRNA表達(dá)，免疫組化法檢測NF-κB表達(dá)；取大鼠頸動(dòng)脈組，采用ELISA法檢測血清TNF-α水平。結(jié)果 觀察組海馬組織NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)在第1、3、5天明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)；觀察組血清TNF-α水平在第1、3、5天明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論 在急性高海拔低氧條件下,西紅花苷提前干預(yù)能通過下調(diào)大鼠腦海馬組織NF-κB表達(dá)及血清TNF-α水平，減輕炎性反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)腦海馬神經(jīng)元的作用。

西紅花苷；高海拔；低氧；腦海馬組織；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；腫瘤壞死因子α；大鼠

腦組織對(duì)缺血缺氧非常敏感，低氧條件可使腦海馬神經(jīng)元存活數(shù)量下降、凋亡增加[1]。高海拔地區(qū)低氣壓和低氧分壓是一個(gè)獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境因素，嚴(yán)重影響機(jī)體正常的生理機(jī)能。急性低氧條件下，大腦急性缺氧可造成腦組織低氧損傷，引起不可逆的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。藏紅花為鳶尾科植物番紅花的干燥柱頭，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神、抗抑郁等功效。西紅花苷是藏紅花主要有效成分，是一類水溶性的類胡蘿卜素，具有較強(qiáng)的抗氧化活性[2]。大量研究證實(shí)，西紅花苷具有抗凋亡[3]、抗神經(jīng)性炎癥和神經(jīng)細(xì)胞退行性變[4]、保護(hù)缺血性腦損傷、改善學(xué)習(xí)記憶障礙[5，6]等作用。西紅花苷預(yù)處理可保護(hù)腦神經(jīng)元在低氧條件下的損傷。2016年7月，我們采用西紅花苷提前干預(yù)，觀察急性高海拔低氧條件下大鼠腦海馬組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)活性及血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平的變化，為其防治急性低氧腦損傷奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)SPF級(jí)雄性SD大鼠96只，體質(zhì)量180～200 g，由北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。西紅花苷購自Sigma公司；小鼠抗大鼠NF-κB p56一抗購自Abcam公司；山羊抗小鼠二抗及辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自武漢博士德公司；總RNA提取試劑盒、DNA MarkerⅠ、瓊脂糖購自TIANGEN公司；TNF-α ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物分組及處理 將大鼠隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組各48只，在青海省西寧市(海拔2 200 m)分別給予西紅花苷50 mg/(kg·d)、等量生理鹽水后肢肌內(nèi)注射。連續(xù)給藥3 d后運(yùn)至高海拔低氧環(huán)境(青海省果洛州甘德縣，海拔4 200 m)飼養(yǎng)。兩組于第1、3、5、7天各取12只大鼠，25%烏拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉，頸動(dòng)脈取血，3 500 r/min離心10 min，取上清液，-20 ℃保存，用于檢測血清TNF-α；然后將大鼠斷頭處死，快速取出全腦，冰上剝離海馬組織，置于液氮中保存，用于檢測NF-κB mRNA和蛋白。

1.3 海馬組織NF-κB mRNA檢測 采用RT-PCR方法。采用TRIzol法提取海馬組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴(kuò)增引物由上海生工生物工程有限公司合成。NF-κB p56上游引物5′-TGCCTCCAGTGAGAAGAACA-3′,下游引物5′-GCACCAGAAGTCCAGGGTTA-3′,引物長度302 bp；β-actin上游引物5′-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3′,下游引物5′-CAACACAGCCTGGATGGCTA-3′,引物長度480 bp。反應(yīng)體系：模板2 μg，引物各1 μL，Mix 25 μL，用ddH2O補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min，4 ℃ 1 h，共30個(gè)循環(huán)。取反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，BIO-RAD凝膠成像儀拍攝圖片，Quantity one軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以NF-κB p56與內(nèi)參β-actin的比值計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。

1.4 海馬組織NF-κB蛋白檢測 采用免疫組化法。將大鼠海馬組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，冠狀面切片，常規(guī)烤片、脫蠟、水化及抗原修復(fù)。加入3% H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗3遍；5%胎牛血清封閉10 min，甩去余液；加一抗，37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3遍；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3遍。DAB顯色，自來水沖洗干凈后過蒸餾水；蘇木素復(fù)染，自來水沖洗，脫水透明，樹膠封片。在顯微鏡下找到海馬CA1區(qū)，400倍下留取照片。以神經(jīng)細(xì)胞核或胞質(zhì)呈棕黃色為陽性細(xì)胞，每張取3個(gè)視野，用Leica QWinV3圖像分析軟件測IOD值。

1.5 血清TNF-α檢測 采用ELISA法。將動(dòng)脈血上清液按100 μL/孔加入相應(yīng)孔中，室溫孵育2 h。然后洗板5次，加入生物素化抗體工作液100 μL/孔，室溫孵育1 h。洗板5次，后加入酶結(jié)合物工作液100 μL/孔，避光室溫孵育20 min。后洗板5次，再滴加入顯色劑100 μL/孔，避光室溫孵育20 min。最后加入終止液50 μL/孔，混勻后即刻測量A450值。

2 結(jié)果

2.1 兩組海馬組織NF-κB mRNA表達(dá)比較 觀察組第1、3、5、7天海馬組織NF-κB mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.11±0.03、0.12±0.02、0.20±0.02、0.23±0.02，對(duì)照組分別為0.35±0.02、0.34±0.03、0.28±0.02、0.24±0.03，觀察組第1、3、5天明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)。對(duì)照組第5、7天NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于第1、3天(P均<0.05)，觀察組第5、7天NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量高于第1、3天(P均<0.05)。

2.2 兩組海馬組織NF-κB蛋白表達(dá)比較 觀察組第1、3、5、7天海馬組織NF-κB蛋白的IOD值分別為758.04±38.83、774.98±37.81、1 642.01±272.57、1 893.57±254.06，對(duì)照組分別為3 507.46±317.96、3 432.57±446.68、2 688.62±246.95、2 053.08±226.13，觀察組第1、3、5天NF-κB相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(P均<0.05)。

2.3 兩組血清TNF-α水平比較 見表1。觀察組第1、3、5天血清TNF-α水平均低于對(duì)照組(P均<0.05)。對(duì)照組第5、7天血清TNF-α水平低于第1、3天(P均<0.05)。觀察組第1、3、5天血清TNF-α水平呈逐漸上升趨勢，但均低于對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(P均<0.05)。

表1 各組血清TNF-α水平比較

注：與對(duì)照組同期比較，*P<0.05；與同組其他時(shí)間比較，#P<0.05。

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)在高海拔低氧的特殊環(huán)境中形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能將會(huì)發(fā)生很大變化，而海馬神經(jīng)細(xì)胞極易受到低氧環(huán)境的損傷，其中多種促炎癥因子發(fā)揮了極其重要的作用。西紅花作為傳統(tǒng)藏藥材，主治“心憂郁積，氣悶不散，瘀血”。近年來，其在高原環(huán)境對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用逐漸引起人們重視。西紅花苷是藏紅花最主要的活性成分，具有明顯的抗氧化活性，能夠抑制活性氧的產(chǎn)生，是一種神經(jīng)細(xì)胞的強(qiáng)抗氧化劑[8，9]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，西紅花苷可以通過增加海馬組織胰島素樣生長因子1表達(dá)，增強(qiáng)高海拔低氧條件下大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[7]。

NF-κB是與炎癥及凋亡有關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子，活化后促使機(jī)體效應(yīng)細(xì)胞大量釋放促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致組織發(fā)生過度炎癥反應(yīng)和組織損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10]。NF-κB可以被多種刺激因素(如應(yīng)激、炎癥、氧自由基、低氧、紫外線等)激活，其主要作用是調(diào)控編碼多種細(xì)胞因子參與免疫、炎癥、細(xì)胞凋亡等生理和病理過程中的基因表達(dá)調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κB與NF-κB抑制蛋白(IκB)結(jié)合成p65蛋白/p50的異源二聚體或p65的同型二聚體，并以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞的胞質(zhì)中。IκB和NF-κB以蛋白-蛋白相互作用，并掩蓋NF-κB/Rel蛋白的核定位信號(hào)，使NF-κB無法向細(xì)胞核內(nèi)移動(dòng)。而當(dāng)細(xì)胞受缺氧刺激時(shí)，IκB激酶(IKK)在氧化應(yīng)激過程中被激活，可能通過IKKγ/NF-κB必需調(diào)節(jié)蛋白(NEMO)與磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶(AKT)途徑交聯(lián)而使ATM磷酸化，從而誘導(dǎo)NF-κB磷酸化，觸發(fā)IκB多泛素化，并通過降解泛素-蛋白酶，導(dǎo)致NF-κB被活化，p65/p50與IκB解離而轉(zhuǎn)入核內(nèi)與特異的啟動(dòng)子結(jié)合，從而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[11,12]。NF-κB誘導(dǎo)眾多細(xì)胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α等高表達(dá)。研究[13]發(fā)現(xiàn)，腦缺血能激活NF-κB，繼而促進(jìn)多種炎癥因子及凋亡基因的表達(dá)。本研究將大鼠用西紅花苷預(yù)處理后運(yùn)至高海拔低氧環(huán)境，觀察大鼠腦海馬CA1區(qū)NF-κB p56表達(dá)，發(fā)現(xiàn)觀察組NF-κB p56蛋白和mRNA表達(dá)在第1、3、5天均低于對(duì)照組。這說明西紅花苷預(yù)處理能夠在第1、3、5天明顯下調(diào)急性低氧條件下大鼠海馬組織中NF-κB表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α是較早釋放的具有多種生物學(xué)效應(yīng)的重要促炎細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)過程中可激活細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)白細(xì)胞介素和花生四烯酸代謝產(chǎn)物、氧自由基等合成，TNF-α在腦組織中被激活呈現(xiàn)高表達(dá)，具有神經(jīng)毒性，可以加速神經(jīng)細(xì)胞的死亡[14]。NF-κB能夠增強(qiáng)TNF-α基因轉(zhuǎn)錄，在某些細(xì)胞和組織中，NF-κB與TNF-α具有密切關(guān)系[15]。NF-κB是機(jī)體對(duì)TNF-α產(chǎn)生生理性反應(yīng)得到的重要中介物，NF-κB激活后可以誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，急性低氧條件可刺激TNF-α水平上升，而觀察組血清TNF-α水平在第1、3、5天明顯低于對(duì)照組。提示西紅花苷預(yù)處理能夠明顯下調(diào)急性低氧條件下大鼠血清TNF-α的表達(dá)。第7天兩組表達(dá)接近，可能是由于觀察組失去藥效導(dǎo)致。

綜上所述，急性高海拔低氧條件可明顯增加大鼠腦海馬組織NF-κB表達(dá)，提高血清TNF-α水平，導(dǎo)致海馬神經(jīng)損傷；而西紅花苷預(yù)處理可下調(diào)NF-κB活化與TNF-α表達(dá)，這可能是西紅花苷減輕腦急性低氧損傷的機(jī)制之一。

[1] Yuan X, Guo X, Deng Y, et al. Chronic intermittent hypoxia-induced neuronal apoptosis in the hippocampus is attenuated by telmisartan through suppression of iNOS/NO and inhibition of lipid peroxidation and inflammatory responses[J]. Brain Res, 2015,30(1596):48-57.

[2] Tamaddonfard E, Farshid AA, Asri-Rezaee S, et al. Crocin improved learning and memory impairments in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Iran J Basic Med Sci, 2013,16(1):91-100.

[3] Mehri S, Abnous K, Mousavi SH, et al. Neuroprotec-tive effect of crocin on acrylamide-induced cytotoxicity in PC12 cells[J]. Cell Mol Neurobiol, 2012,32(2):227-235.

[4] Deslauriers AM, Afkhami-Goli A, Paul AM, et al. Neuroinflammation and endoplasmic reticulum stressare coregulated by crocin to prevent demyelination and neurodegeneration[J]. J Immunol, 2011,187(9):4788-4799.

[5] Rajaei Z, Hosseini M, Alaei H. Effects of crocin on brain oxidative damage and aversive memory in a 6-OHDA model of Parkinson′s disease[J]. Arq Neuropsiquiatr, 2016,74(9):723-729.

[6] 張曉巖,喻靜,張先鈞,等.西紅花苷-1對(duì)急性低氧條件下大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬SIRT1表達(dá)的影響[J].中草藥,2013,44(10):1314-1317.

[7] 李鳳輝,張先鈞,賈煒,等．西紅花苷對(duì)高海拔低氧條件下大鼠腦海馬IGF-1表達(dá)的影響[J].青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015,36:10-14.

[8] Lamoke F, Mazzone V, Persichini T, et al. Amyloid β peptide-in- duced inhibition of endothelial nitric oxide production involves oxi-dative stress-mediated constitutive eNOS/HSP90 interaction anddisruption of agonist-mediated Akt activation[J]. Neuroinflammation, 2015,12:84-98.

[9] Bandegi AR, Rashidy-Pour A, Vafaei AA, et al. Protective effects of crocus sativus L. Extract and crocin against chronic-stress induced oxidative damage of brain, liver and kidneys in rats[J]. Adv Pharm Bull, 2014,4:493-499.

[10] Chen L, Feng L, Wang X, et al. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor is involved in inflammation by negatively regulating the NF-κB pathway[J]. Sci Rep, 2015,5:8133.

[11] Zhang J, Zhang M, Sun B, et al. Hyperammonemia enhances the function and expression of P-glycoprotein and Mrp2 at the bloodbrain barrier through NF-kappaB[J]. J Neurochem, 2014,131(6):791-802.

[12] 羅冰峰,尹強(qiáng),王榮,等.缺氧對(duì)多藥耐藥相關(guān)蛋白2表達(dá)及調(diào)控機(jī)制的影響[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2017,42(1):98-107.

[13] 劉海興,徐嘉,徐欣,等.活脈通絡(luò)飲對(duì)大鼠腦缺血再灌注腦組織NF-κB和IL-1β表達(dá)的影響[J].解剖科學(xué)進(jìn)展,2014,20(1):24-27.

[14] 蔡軍,李定剛.烏司他丁的藥理學(xué)研究臨床應(yīng)用[J].中華臨床醫(yī)藥雜志,2003,12(4):106-107.

[15] Okamoto T, Yamagishi S, Inagaki Y, et al. Angiogenesis induced by advanced glycation end products and its prevention by cerivastatin[J]. FASEB J, 2002,16(14):1928-1930.

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260685)；青海省科技廳項(xiàng)目(2016-ZJ-708)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.009

R282.5

A

1002-266X(2017)26-0032-03

2016-12-05)