百合S-RNase基因cDNA全長(zhǎng)克隆及表達(dá)分析

丁榕，王杰，趙和文，張克中,2,3*，崔金騰,2,3

(1.北京農(nóng)學(xué)院 園林學(xué)院，北京 102206； 2.城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；3.北京市鄉(xiāng)村景觀規(guī)劃設(shè)計(jì)工程技術(shù)研究中心，北京 102206)

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百合S-RNase基因cDNA全長(zhǎng)克隆及表達(dá)分析

丁榕1，王杰1，趙和文1，張克中1,2,3*，崔金騰1,2,3

(1.北京農(nóng)學(xué)院 園林學(xué)院，北京 102206； 2.城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；3.北京市鄉(xiāng)村景觀規(guī)劃設(shè)計(jì)工程技術(shù)研究中心，北京 102206)

[目的]克隆百合S-RNase基因cDNA全長(zhǎng)序列并進(jìn)行表達(dá)信息分析，為百合不親和機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。[方法]以東方百合(Liliumoriental)品種‘Justina’為材料，通過(guò)RACE技術(shù)克隆百合S-RNase基因的cDNA全長(zhǎng)序列；采用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)百合同一時(shí)期不同器官的S-RNase基因的表達(dá)量進(jìn)行定性分析；并通過(guò)NCBI在線工具以及ProtParam、SignalP、MEGA5對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。[結(jié)果]克隆基因全長(zhǎng)為766 bp，開放閱讀框?yàn)?72 bp，推導(dǎo)編碼223個(gè)氨基酸；其半定量分析顯示表達(dá)量由高到低的器官依次為花瓣、葉、莖、大量分泌液時(shí)的花柱、無(wú)分泌液時(shí)的花柱、鱗莖。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白為一個(gè)不穩(wěn)定的親水蛋白、存在信號(hào)肽序列，屬于分泌型蛋白。具有典型的RNase T2家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域特征，二級(jí)結(jié)構(gòu)富含環(huán)形結(jié)構(gòu)。在已知的S-RNase基因中，與野茶樹的親緣關(guān)系最近。[結(jié)論]獲得百合S-RNase基因cDNA全長(zhǎng)序列及在同一時(shí)期不同器官的S-RNase基因的表達(dá)量。

百合；S-RNase基因； 克?。?半定量

S-RNase(S-glycoprotein RNase)是一種N-糖基化的核酸酶，主要在花柱的柱頭和引導(dǎo)組織中表達(dá)，是茄科、薔薇科以及玄參科等植物自交不親和性的雌性決定因子[1]。早在1986年，首次在花煙草(Nicotianaalata)中得到一種與自交不親和有關(guān)的花柱糖蛋白的cDNA克隆[2]，隨后發(fā)現(xiàn)其是一種與真菌RNase Rh和RNase T2具有相似的結(jié)構(gòu)的核酸酶，具有能夠分解RNA的核酸酶活性，稱為S-RNase[3，4]。其酶活性能夠選擇性的降解自花花粉管中的RNA，而異花花粉管中能夠正常生長(zhǎng)[5]，并且其酶活性對(duì)于自交不親和反應(yīng)是必需的，缺失后無(wú)法產(chǎn)生對(duì)相同S基因型花粉的抑制作用[6]。其作用原理是S-RNase能夠進(jìn)入花粉管發(fā)揮自身的細(xì)胞毒素作用降解RNA，從而阻止花粉管生長(zhǎng)[7]。S-RNase基因位于S-locus,具有S 等位基因的多態(tài)性[8]。隨著研究的不斷深入，在茄科、薔薇科以及玄參科等植物中已克隆到上百個(gè)S-RNase基因，其作用原理也逐漸清晰[9，10]。

百合(Lilium)是在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用的鮮切花和園林花卉，兼具食用、藥用等用途。目前，關(guān)于百合品種S 基因的研究極少，亟待突破[11]。在本課題組對(duì)于東方百合‘Justina’未分泌粘液的雌蕊與分泌大量粘液的雌蕊的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中，S-RNase基因在分泌大量粘液的雌蕊中相對(duì)表達(dá)量較大，表明對(duì)于百合這一類具有不親和性的物種來(lái)說(shuō)，S-RNase基因?qū)τ诎俸喜挥H和機(jī)制具有重要作用。關(guān)于該基因?qū)ψ越徊挥H和性與雜交不親和性的機(jī)理是否存在聯(lián)系還尚未明確，需要進(jìn)一步研究。本研究的主要目的在于克隆該基因，并進(jìn)行表達(dá)量分析，為后續(xù)的工作打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

植物材料為北京農(nóng)學(xué)院東大地球根花卉大棚常規(guī)栽培管理的東方百合(Liliumoriental)品種‘Justina’。

3′-RACE-Full Length cDNA Kit試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、瓊脂糖凝膠切膠回收試劑盒、pMD19-T Vector連接試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞等均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 百合S-RNase基因cDNA序列全長(zhǎng)克隆

在‘Justina’開花前一天去雄、套袋；有大量分泌液時(shí)，快速摘取花柱；液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。采用Trizol法分別提取RNA，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得的S-RNase基因序列，設(shè)計(jì)3′內(nèi)、外引物(表1)，進(jìn)行3′cDNA末端擴(kuò)增反應(yīng)。通過(guò) DNAMAN軟件將3′RACE測(cè)序序列與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得序列進(jìn)行拼接，利用ORF Finder對(duì)拼接結(jié)果進(jìn)行分析，得到一個(gè)包括起始密碼子和終止密碼子在內(nèi)的672 bp的最大開放閱讀框架，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)其他物種的S-RNase基因比對(duì)長(zhǎng)度相符且相似性很高，說(shuō)明這段核苷酸序列為該基因的全長(zhǎng)序列。設(shè)計(jì)擴(kuò)增完整ORF框的特異性引物F1、R1(表1)進(jìn)行進(jìn)行全長(zhǎng)驗(yàn)證的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

表1 PCR 擴(kuò)增所用引物及其序列

1.3 百合S-RNase基因的半定量表達(dá)分析

‘Justina’開花前一天去雄、套袋；在無(wú)分泌液時(shí)快速摘取花柱(BL1)、花瓣、葉、莖、鱗莖；在有大量分泌液時(shí)，快速摘取花柱(BL2)，均液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。采用Trizol法分別提取RNA，以18S rRNA作為內(nèi)參基因，由引物F1、R1(表1)，進(jìn)行半定量表達(dá)分析。

1.4 百合S-RNase基因的生物信息學(xué)分析

通過(guò)ORF Finder(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/gorf/orFig.cgi)尋找S-RNase基因的開放閱讀框架、將核酸序列翻譯成氨基酸序列；BLAST 工具進(jìn)行同源性分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)；Protein在線數(shù)據(jù)庫(kù)搜索S-RNase氨基酸序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=)；CDD在線工具進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)；Expasy在線系統(tǒng)Protparam(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)預(yù)測(cè)S-RNase基因的基本理化性質(zhì)在線程序預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)：PredictProtein(http://www.predictprotein.org/)；運(yùn)用Signalp4.1(http: //www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)對(duì)S-RNase基因氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析；運(yùn)用MAGA 5.2對(duì)S-RNase基因進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合S-RNase基因cDNA序列克隆

以東方百合‘Justina’有大量分泌液時(shí)的花柱為試驗(yàn)材料，提取總RNA；以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得的S-RNase基因序列為基礎(chǔ)，進(jìn)行3′RACE，得到400 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1,A)，測(cè)序結(jié)果顯示該片段實(shí)際長(zhǎng)度為362 bp；轉(zhuǎn)錄組測(cè)得序列和3′RACE所得序列拼接結(jié)果通過(guò)ORF Finder分析找到672 bp 的完整開放閱讀框，進(jìn)行全長(zhǎng)克隆驗(yàn)證，得到約750 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1,B)，測(cè)序結(jié)果顯示該片段實(shí)際長(zhǎng)度為766 bp，符合預(yù)期結(jié)果。

A: 3′-RACE擴(kuò)增結(jié)果；B:cDNA PCR 擴(kuò)增結(jié)果圖1 百合S-RNase基因擴(kuò)增結(jié)果A. Amplification results of3′-RACE, B.Amplification results of cDNAFig.1 Amplification results of Lilium S-RNase注: M: 2000 DNA markerNote: M: 2000 DNA marker

2.2 百合S-RNase基因的半定量表達(dá)分析

以‘Justina’無(wú)分泌液時(shí)快速摘取花柱(BL1)、花瓣、葉、莖、鱗莖及有大量分泌液時(shí)的花柱(BL2)為材料，各取材1 g,18S rRNA作為內(nèi)參基因，進(jìn)行半定量表達(dá)分析。結(jié)果表明(圖2)，S-RNase在BL1、BL2、花瓣、葉、莖中均有不同程度的表達(dá)，而在鱗莖中沒有表達(dá)。其中，花瓣表達(dá)水平最高，葉次之，BL1最低。S-RNase基因在不同器官的表達(dá)水平具有空間差異性。S-RNase基因在BL2表達(dá)量較BL1高，說(shuō)明該基因?qū)τ诖迫锏氖诜劭赡苡兄匾饔谩?/p>

圖2 半定量RT-PCR電泳結(jié)果Fig.2 The test of semi-quantitative RT-PCR

2.3 百合S-RNase基因及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

通過(guò)ORF Finder在線工具推導(dǎo)百合S-RNase基因共編碼223個(gè)氨基酸(圖3)，其中起始密碼子ATG位于31～33 bp處，終止密碼子TAA位于699～702 bp處。通過(guò)CDD在線工具進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)其具有兩種RNase T2家族蛋白的特征結(jié)構(gòu)域CAS (conserved amino acid)模體。通過(guò)SignalP 4.1進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析，其為分泌蛋白，可能在跨膜運(yùn)輸中起到信號(hào)識(shí)別作用；剪切位點(diǎn)位于20～21位氨基酸，成熟肽始于第20位氨基酸。ProtParam預(yù)測(cè)蛋白基本質(zhì)理化性質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量為24 870.8 Da，理論等電點(diǎn)pI為4.87，是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白；Protscale預(yù)測(cè)整個(gè)蛋白為親水蛋白；通過(guò)PredictProtein在線程序進(jìn)行百合S-RNase蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，螺旋(H)比例為28.70%；折疊(E)比例為13%；環(huán)形結(jié)構(gòu)(L)比例為58.30%。

圖3 百合S-RNase cDNA序列及其氨基酸序列Fig.3 S-RNase gene cDNA sequence of Lilium and the deduced amino acid 注：?jiǎn)⑹久艽a子(ATG)、終止密碼子(TAA)用紅色邊框標(biāo)注,黃色區(qū)域?yàn)镃AS模體，藍(lán)色字體為其信號(hào)肽序列Note：The start codon (ATG) and the stop codon (TAA) were marked by red box.The CAS motifs were marked by yellow colors.The signal peptide were marked by blue font

因?yàn)镾-RNase是茄科、薔薇科以及玄參科等植物自交不親和性的雌性決定因子，所以在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中分別找到了茄科植物8條S-RNase基因序列、薔薇科植物14條S-RNase基因序列、玄參科金魚草僅有的1條S-RNase基因序列，以及除茄科、薔薇科以及玄參科以外的僅有的羅漢果、野茶樹各一條序列，共選取了S-RNase基因的氨基酸序列25條。利用MEGA 5.2 軟件，對(duì)百合S-RNase基因的推導(dǎo)氨基酸序列與選取的25條氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

根據(jù) Kubo 等研究[12，13]以及S-RNase基因氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果顯示(圖4)，茄科植物可依次分為C1、C2、HVa、HVb、C3、C4、C5，5 個(gè)保守區(qū)(C1～C5)和 2 個(gè)高變區(qū)(HVa、HVb)；薔薇科植物可依次分為C1、C2、HV、C3、C4、C5，五個(gè)保守區(qū)(C1～C5)和一個(gè)高變區(qū)(HV)；東方百合以及金魚草、羅漢果、野茶樹等有明顯的C1、C2、C3區(qū)以及高變區(qū)，無(wú)明顯的C4及C5區(qū)域，并且茄科植物與薔薇科植物的C4區(qū)明顯不同。

采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，基于1 000次重復(fù)以Bootstrap驗(yàn)證進(jìn)行分析。結(jié)果顯示(圖5)，所有樣本被分為A和B 2個(gè)大區(qū)域，薔薇科均植物被分到A區(qū)域，茄科植物均被分到B區(qū)域，與植物科屬分類相同。薔薇科李屬植物均被分在A-1區(qū)，梨屬植物與蘋果屬植物沒有完全分開，被共同分在A-2區(qū)，其中，梨屬西洋梨與蘋果屬植物親緣關(guān)系較近，被分在同一分支。在雙子葉植物中，東方百合與野茶樹親緣最近，與薔薇科、茄科植物較遠(yuǎn)。玄參科金魚草與茄科植物親緣關(guān)系較近。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)以東方百合‘Justina’的有大量分泌液時(shí)的花柱為材料，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組得到的序列，克隆到一個(gè)具有完整編碼區(qū)的S-RNase基因，并對(duì)基因序列及編碼蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其具有典型的RNase T2家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域特征，屬于RNase T2家族[14]。經(jīng)信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析，其為分泌蛋白，與授粉過(guò)程中從花柱傳導(dǎo)細(xì)胞中分泌至胞外基質(zhì)并能夠進(jìn)入花粉管細(xì)胞的功能有關(guān)[15]。 S-RNase 的高變區(qū)是花柱特異性識(shí)別花粉SFB的區(qū)域，與自交不親和反應(yīng)的特異性有關(guān)[16]。S-RNase的保守區(qū)可分為五個(gè)區(qū)域(C1～C5)，其中C1、C4和C5區(qū)是疏水區(qū)，與蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)；C2和C3區(qū)是親水區(qū)，與蛋白的催化活性有關(guān)[17]，與RNase T2保守區(qū)相同，是S-RNase 的活性區(qū)域。在比對(duì)結(jié)果中，茄科植物與薔薇科植物的C4區(qū)不同，并且東方百合等也無(wú)明顯的C4區(qū)域，這說(shuō)明C4區(qū)域具有明顯的科間特征。因目前東方百合等植物的S-RNase基因克隆結(jié)果太少，其C4、C5區(qū)域還需更多序列進(jìn)行比對(duì)分析。可利用基因突變[18]或基因沉默[19]等技術(shù)，可以對(duì)信號(hào)肽區(qū)域的核酸序列進(jìn)行干擾，使其無(wú)法進(jìn)入花粉管細(xì)胞，或者對(duì)活性區(qū)域進(jìn)行干擾，使其喪失核糖核酸酶活性，也應(yīng)用于高變區(qū)，從而進(jìn)行自交不親和性的分子調(diào)控。

圖4 百合 S-RNase 與其它物種的氨基酸序列比對(duì)圖Fig.4 Sequence alignment of amino acid of the Lilium S-RNase and and other species

圖5 百合S-RNase基因與其它物種的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Sequence alignment of amino acid of the Lilium S-RNaseand and other species注：支持率低于50的隱去Note：approval rating below 50 hides

百合S-RNase基因的半定量表達(dá)分析結(jié)果顯示，S-RNase基因在BL2(大量分泌液花柱)表達(dá)量較BL1(無(wú)分泌液的花柱)高，說(shuō)明該基因?qū)τ诖迫锏氖诜劭赡苡兄匾饔谩６诔ㄖ酝獾钠渌煌鞴俳M織中也有不同程度的表達(dá)，這說(shuō)明S-RNase基因在百合中除參與雌蕊的授粉外可能還起到其它功能。RNase T2家族蛋白廣泛存在于生物體內(nèi)，能夠在植物落葉、損傷和侵染反應(yīng)過(guò)程中表達(dá)。已有研究表明，RNase T2家族還具有與核酸酶活性無(wú)關(guān)的其他功能[20]。

本試驗(yàn)以東方百合‘Justina’的有大量分泌液

時(shí)的花柱為材料，成功克隆了S-RNase基因cDNA全長(zhǎng)序列，并分析了S-RNase基因在同一時(shí)期不同器官的表達(dá)量，為今后深入探討百合的不親和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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(編輯：馬榮博)

Clone and expression analysis of the full-length cdna sequences ofS-RNaseinLilium

Ding Rong1, Wang Jie1, Zhao Hewen1, Zhang Kezhong1,2,3*, Cui Jinteng1,2,3

(1.CollegeofLandscape,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China; 2.BeijinglaboratoryofUrbanandruralecologicalenvironment,Beijing102206,China; 3.BeijingEngineeringResearchCenterofrurallandscapeplanninganddesign,Beijing102206,China)

[Objective]The clone and the expression analysis of the full length sequence of LiliumS-RNasegene which would made a foundation for discovering the molecular regulation of incompatibility in Lilium.[Methods]The full cDNA sequence ofS-RNasewas isolated from a style of Lilium oriental ‘Justina’ by RACE. Semi-quantitative RT-PCR technology was used to analyse the expression of different organs of theS-RNasegene in the same period. Bioinformatic analysis was used by the online tools of National Center for Biotechnology Information and ProtParam, SignalP, MEGA5.[Results]The result showed that the full length of theS-RNasegene was 766 bp, with an open reading frame of 672bp, which encoded a protein with 223 amino acids. The semi-quantitative expression showed that its expression order from higher to lower were petals, leaves, stems, BL2, BL1, bulbs. It was predicted that thisS-RNaseprotein was a hydrophilic proteins with a signal peptide，which belonging to the secrete protein. This protein had a typical conserved domains of RNase T2 family. The secondary structure was rich in loop structure. The relationship analysis showed that Camellia sinensis was closest with Lilium among the knownS-RNasegene.[Conclusion]The full length sequence ofLiliumS-RNasegene was obtained and the expression of different organs of theS-RNasegene in same period were analysed by semi-quantitative RT-PCR technology.

Lilium,S-RNasegene, Cloning, Semi quantitative RT PCR

2017-03-07

2017-06-10

丁榕(1992-)，女(漢)，山東濰坊人，碩士研究生，研究方向：園林植物與觀賞園藝

*通信作者：張克中，教授，碩士生導(dǎo)師，Tel:01080797210; E-mail: zkzzxd@vip.sina.com

北京市教育委員會(huì)2015年科技計(jì)劃面上項(xiàng)目(KM201510020011)；北京市屬高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(IDHT20150503)；科技創(chuàng)新服務(wù)能力建設(shè)-協(xié)同創(chuàng)新中心-林果業(yè)生態(tài)環(huán)境功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心(2011協(xié)同創(chuàng)新中心)(市級(jí))(PXM2017_014207_000043)；北京農(nóng)學(xué)院學(xué)位與研究生教育改革與發(fā)展項(xiàng)目(5056516004/026)

S682.29

A

1671-8151(2017)09-0649-07