糖腎方對糖尿病性肝損傷的保護(hù)作用*

姜雪爾 蔣媛媛 潘晶 杜月光# 章科娜 柴可夫

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053 2浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

實(shí)驗(yàn)研究

糖腎方對糖尿病性肝損傷的保護(hù)作用*

姜雪爾1蔣媛媛2潘晶1杜月光1#章科娜1柴可夫1

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053 2浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

目的：觀察糖腎方對糖尿病大鼠肝功能、肝臟病理變化及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)的變化，以探討其對糖尿病大鼠肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法：采用高糖高脂飼料聯(lián)合1%鏈脲佐菌素（STZ）30mg/kg靜脈注射復(fù)制2型糖尿病大鼠模型，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為5組（n=8）：DM模型組、糖腎方低劑量組、糖腎方中劑量組、糖腎方高劑量組及纈沙坦組。藥物干預(yù)12周，檢測空腹血糖（FBG）、甘油三酯（TG）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）等血清生化指標(biāo)；放射免疫法檢測血清胰島素（FINS）并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）；光鏡（HE染色和Masson染色）觀察肝臟病理學(xué)改變；免疫組化技術(shù)測定肝臟α-SMA蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：與正常組比較，DM模型組大鼠FBG、TG、ALT、AST、FINS、HOMA-IR均明顯升高（P＜0.05），病理變化顯示肝細(xì)胞呈明顯脂肪油滴狀空泡，局灶性肝細(xì)胞壞死，炎細(xì)胞浸潤，肝小葉間、匯管區(qū)、竇周間隙纖維增生明顯；免疫組化顯示肝星形細(xì)胞(HSC)，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)增加。經(jīng)糖腎方或纈沙坦干預(yù)后，F(xiàn)BG、TG、ALT、AST、FINS、HOMA-IR明顯降低（P＜0.05），病變減輕，α-SMA表達(dá)減少。結(jié)論：糖腎方對糖尿病大鼠的肝損傷具有顯著的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與改善胰島素抵抗和抑制肝星形細(xì)胞(HSC)的激活有關(guān)。

糖尿病性肝損 傷糖腎方 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 肝星形細(xì)胞 胰島素抵抗 大鼠

糖尿病是以慢性高血糖為特征的代謝紊亂，糖尿病慢性并發(fā)癥是糖尿病致死致殘的主要原因[1]。近年來，人們逐漸意識(shí)到糖尿病除了能引起廣為人知的心血管、腎臟、眼等并發(fā)癥外，肝臟病變也是2型糖尿病(T2DM)的主要并發(fā)癥。其中，非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）是糖尿病肝損害的最常見臨床表現(xiàn)。隨著2型糖尿病發(fā)病率升高，NAFLD亦日益增多，由其致肝硬化甚至肝細(xì)胞癌的比例逐年上升。本課題組在臨床及實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)糖腎方針對糖尿病患者及大鼠模型具有降脂、抗炎和改善血流變等作用[2-3]。本實(shí)驗(yàn)觀察糖腎方對糖尿病大鼠糖脂代謝和肝功能的影響，探討糖腎方對糖尿病肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，為其在臨床上防治糖尿病肝損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及飼料：SPF級健康雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量180±20g，7～8周齡，動(dòng)物許可證號為SCXX(滬)：2008-0016，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。常規(guī)飼料由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。高糖高脂飼料由10.0%白砂糖、10.0%熟豬油、0.5%膽固醇、10.0%蛋黃粉及69.5%基礎(chǔ)飼料組成，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院制作成型及烘焙而成。1.2實(shí)驗(yàn)用藥及試劑：糖腎方：黃芪18g，葛根、靈芝、女貞子各15g，丹參9g，大黃6g。中藥由浙江中醫(yī)藥大學(xué)門診部提供，由浙江省中醫(yī)院藥劑室煎制成含生藥1g/ml、2g/ml、4g/ml的濃縮液，4℃冰箱密封保存。纈沙坦：片劑，80mg/片，北京諾華制藥有限公司，批號：x1433。鏈脲佐菌素（STZ），由美國Sigma公司生產(chǎn)，批號B57426。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體購自Abcam公司。

1.3 糖尿病模型復(fù)制：所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，以1%鏈脲佐菌素（STZ）30mg/kg尾靜脈注射及高糖高脂飼料喂養(yǎng)，1月后檢測空腹血糖（FBG），F(xiàn)BG≥11.2mmol/L為T2DM，繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)。

1.4 分組及給藥：將成模大鼠隨機(jī)分成DM模型組、糖腎方低、中、高劑量組、纈沙坦組，同時(shí)設(shè)正常對照組，每組8只。糖腎方低、中、高劑量組分別以糖腎方濃縮劑6.5g·kg-1·d-1、13g·kg-1·d-1和26g·kg-1·d-1灌胃；纈沙坦組給予纈沙坦混懸液25mg·kg-1·d-1灌胃。正常對照組和DM模型組均以生理鹽水4ml灌胃，每日1次，連續(xù)12周，根據(jù)體重變化改變給藥劑量。

1.5 標(biāo)本的采集：各組大鼠末次給藥后禁食不禁水24h，稱量體重。采用戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉，行腹主動(dòng)脈采血，4℃，4000r/min，10min離心，收集血清，用于檢測生化指標(biāo)以及胰島素含量。處死大鼠，摘取肝臟，稱重。取肝組織，部分固定于10%甲醛緩沖液，用于病理形態(tài)的檢測；部分快速冷凍于液氮，然后置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?，用于相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.6 血清生化指標(biāo)及胰島素含量測定：采用全自動(dòng)生化分析儀測定空腹血糖（FBG）、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）。血清胰島素（FINS）含量采用ELISA技術(shù)，其步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行；計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=FBG× FINS/22.5。

1.7 肝組織病理變化：肝臟組織常規(guī)固定脫水、透明、包埋、切片，分別行蘇木素-伊紅（HE）染色和Masson特殊染色，光鏡下觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)改變。

1.8 肝臟組織中α-SMA蛋白的表達(dá)檢測：采用免疫組織化學(xué)Envision二步法：切片常規(guī)脫蠟水化；煮沸修復(fù)抗原；3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化酶；滴加I抗(工作濃度為1:100)，4℃孵育過夜。滴加Envision工作液，37℃孵育30min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水透明，中性樹脂封片。以PBS代替I抗作陰性對照，胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性反應(yīng)，每張切片在高倍鏡視野下隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，人工計(jì)數(shù)視野下陽性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清生化指標(biāo)及胰島素抵抗指數(shù)改變：與正常對照組比較，DM模型組大鼠FBG、ALT、AST、TG、FINS和HOMA-IR明顯升高(P＜0.05）；與DM模型組比較，纈沙坦組和糖腎方各干預(yù)組FBG水平下降，其中糖腎方高劑量組下降明顯(P＜0.05），AST、ALT、TG、FINS和HOMA-IR水平明顯下降(P＜0.05）；與纈沙坦組比較，糖腎方干預(yù)組的HOMA-IR水平下降更明顯。見表1和表2。

表1 血清中FBG、FINS和HOMA-IR水平比較（±s,n=8）

表1 血清中FBG、FINS和HOMA-IR水平比較（±s,n=8）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05,**P＜0.01；與DM模型組比較，#P＜0.05,##P＜0.01。

HOMA-IR 19.13±2.50 98.94±9.14**66.01±7.39##75.16±6.11##72.61±3.95##57.74±7.57##組別正常對照組DM模型組纈沙坦組糖腎方低劑量組糖腎方中劑量組糖腎方高劑量組FBG(mmol/L) 9.25±0.98 27.83±0.06**27.44±0.90 26.84±0.80 26.90±0.70 25.20±0.20#FINS(mU/L) 44.47±4.99 70.95±6.81**59.65±4.83##61.00±3.62##61.37±3.34##53.23±6.08##

表2 血清中TG、AST和ALT水平比較（±s,n=8）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05,**P＜0.01；與DM模型組比較，#P＜0.05,##P＜0.01。

ALT(U/L) 44.8±4.2 199.5±95.3*107.5±31.8#128.5±32.9#130.1±20.1#128.4±40.0#組別正常對照組DM模型組纈沙坦組糖腎方低劑量組糖腎方中劑量組糖腎方高劑量組TG(mmol/L) 0.22±0.06 3.56±0.84**1.90±0.71##2.37±0.98#2.11±0.74##1.77±0.75##AST(U/L) 127.5±22.0 174.8±98.6*92.5±20.1#113.1±40.3#107.6±24.8#100.7±37.1#

2.2 各組大鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué)改變：HE染色顯示，正常對照組大鼠肝小葉輪廓清晰完整，肝細(xì)胞形態(tài)正常；DM模型組大鼠肝細(xì)胞呈明顯脂肪變，局灶性壞死，壞死區(qū)和匯管區(qū)可見程度不一的炎癥細(xì)胞浸潤，部分細(xì)胞核變型和核偏位。Masson染色顯示，正常組大鼠肝組織內(nèi)血管壁、竇周間隙可見少量膠原纖維,模型組可見竇周間隙以及門管區(qū)、小葉間纖維增生明顯。經(jīng)糖腎方或纈沙坦干預(yù)后，大部分肝細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯減少甚至消失，炎性細(xì)胞明顯減少，膠原纖維均減少，糖腎方高劑量組減少最顯著，基本消失。

2.3各組大鼠肝臟組織α-SMA蛋白表達(dá)的變化：免疫組化結(jié)果顯示：與正常對照組比較，DM模型組大鼠肝組織的狄氏間隙可見有棕褐色顆粒的陽性細(xì)胞，提示肝星形細(xì)胞被激活；經(jīng)糖腎方或纈沙坦干預(yù)12周后，陽性細(xì)胞明顯減少，陽性細(xì)胞數(shù)目計(jì)數(shù)結(jié)果見圖1。

圖1 肝臟組織α-SMA蛋白表達(dá)（±s,n=8）

3 討論

研究顯示，至2011年全世界糖尿病患者約有3.66億人，每年約有460萬人死于糖尿病及其并發(fā)癥。世界衛(wèi)生組織預(yù)測到2030年糖尿病將成為世界第七大致死病因[4]。除了糖尿病腦病、腎病、周圍神經(jīng)性病變、視網(wǎng)膜病變等常見并發(fā)癥外，近年來研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者終末期肝病的死亡率高于心血管疾病[5]。亦有研究顯示糖尿病與原發(fā)性肝癌發(fā)病存在相關(guān)性，能增加原發(fā)性肝癌（PHC）患病風(fēng)險(xiǎn)[6]。

糖尿病肝損傷的病理改變主要表現(xiàn)為非酒精性脂肪肝?。∟AFLD），NAFLD包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化。本研究結(jié)果顯示，DM模型組大鼠肝臟肝細(xì)胞呈明顯脂肪變，局灶性壞死，壞死區(qū)和匯管區(qū)可見炎癥細(xì)胞浸潤，肝纖維化明顯，說明糖尿病大鼠已出現(xiàn)脂肪性肝炎，但未見肝硬化，這可能與時(shí)間較短有關(guān)。目前，NAFLD的發(fā)病機(jī)制普遍認(rèn)可是由胰島素抵抗和氧化應(yīng)激組成的“二次打擊”理論[7]。初次打擊：當(dāng)由于肥胖、高脂血癥、糖尿病等代謝性疾病的前提下，糖脂代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致肝臟過多攝取游離脂肪酸（FFAs）、增快機(jī)體攝入脂質(zhì)分解速率和促進(jìn)肝臟內(nèi)合成甘油三酯（TG），造成高胰島素血癥和胰島素抵抗（IR），從而導(dǎo)致肝臟內(nèi)脂質(zhì)過多蓄積，形成單純肝細(xì)胞脂肪變性；二次打擊：在初次打擊的前提下，F(xiàn)FA的脂毒性、線粒體功能障礙和大量細(xì)胞因子（瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素等）作用，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而激活相關(guān)炎性細(xì)胞因子，引起NASH。在二次打擊的基礎(chǔ)上，炎性細(xì)胞因子激活肝星形細(xì)胞（HSC）和合成大量細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），形成肝纖維化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)DM模型組大鼠存在明顯胰島素抵抗。

肝纖維化作為糖尿病肝病晚期的發(fā)病基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)特別是間質(zhì)膠原的沉積。近年研究表明，HSC是肝內(nèi)膠原及其他細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源，HSC活化是各種病因?qū)е吕w維化的主要發(fā)病機(jī)制。其中，當(dāng)發(fā)生肝損傷時(shí)，在炎性和細(xì)胞因子作用下，處于靜止?fàn)顟B(tài)的HSC被激活，表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）并分泌大量ECM，對肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用，臨床上常以α-SMA作為HSC的陽性蛋白標(biāo)志物。本研究免疫組化結(jié)果顯示，相比較于正常組，模型組α-SMA陽性顆粒明顯升高，提示HSC被大量激活。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，糖尿病并發(fā)癥的基本病機(jī)為瘀濁互阻，氣陰兩虛。消渴日久，治不得法，傷陰耗氣，痰瘀互結(jié)于肝絡(luò)可致糖尿病肝病。糖腎方在臨床實(shí)踐證實(shí)能有效治療糖尿病腎病，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)對糖尿病并發(fā)癥均有明顯保護(hù)作用，且對T2DM大鼠模型具有較好的降糖、降脂、抗炎和改善血流變等功效［2-3］，根據(jù)“肝腎同源”中醫(yī)理論，推測糖腎方對糖尿病肝病治療也有一定療效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)糖腎方治療后血清FBG、TG、AST、ALT顯著降低，HOMA-IR水平明顯下降；病理形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞形態(tài)多數(shù)恢復(fù)正常，脂肪變肝細(xì)胞、炎性細(xì)胞和膠原纖維明顯減少，肝內(nèi)α-SMA蛋白表達(dá)明顯減少，提示糖腎方可能通過干預(yù)胰島素抵抗和抑制肝星形細(xì)胞的激活以調(diào)整糖脂代謝紊亂和緩解肝纖維化，從而對糖尿病肝損傷起到了保護(hù)作用。

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2016-12-14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目基于AGEs/RAGE/NF-κB/MCP-1炎癥路徑多靶點(diǎn)探究早期糖尿病腎病“氣陰兩虛、絡(luò)脈瘀阻”病機(jī)，編號：81273615；浙江省新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目基于Sirt1/PGC-α通路研究新加下瘀血湯對糖尿病大鼠肝損傷保護(hù)作用的機(jī)制，編號：2016R410003

#通訊作者：杜月光，E-mail：duyueguang@163.com