一個嗜藍孢孔菌屬新菌株的分離、鑒定與菌種培養(yǎng)基質(zhì)研究

郭尚　周林　徐莉娜

摘 要：采自山西右玉地區(qū)沙棘樹腐木中的野生嗜藍孢孔菌屬一新菌株，其形態(tài)學(xué)特征為具有馬蹄形擔子果，蓋狀無柄，有時平伏反卷生長，單系菌絲系統(tǒng)；骨架菌絲在Melzer試劑和棉藍試劑中呈負反應(yīng)；擔孢子近球形或球形，無色，厚壁等。將Fomitiporia yanbeiensis的ITS序列與其他已經(jīng)報道的嗜藍孢孔菌屬真菌ITS進行比對分析。分析結(jié)果表明Fomitiporia yanbeiensis與嗜藍孢孔菌屬親緣關(guān)系較近，因此可定該屬的一個新種，名為 Fomitiporia yanbeiensis S. Guo & L. Zhou（GenBank： KT861405，F(xiàn)ungal name： FN570360）。

關(guān)鍵詞：嗜藍孢孔菌；新種；形態(tài)學(xué)；分類；培養(yǎng)基質(zhì)

中圖分類號 R285 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）14-0035-04

Abstract：A new Fomitiporia fungus，F(xiàn)omitiporia sp. nov.，was collected from the Datong area （Youyu） Shanxi Province China in the wild sea buckthorn trees rot wood. The morphological feature is that it has a horseshoe shaped cover basidiocarps，sessile，sometimes procumbent backscroll mycelium growth，single system；skeletal hyphae showed a negative reaction in the Melzer reagent and cotton blue reagent；basidiospore near spherical or spherical，colorless，thick wall etc..The ITS sequence of Fomitiporia yanbeiensis was compared with the other species of ITS，which were reported. The results showed that Fomitiporia yanbeiensis had a close genetic relationship with the Fomitiporia species. It was an new species and was named Fomitiporia yanbeiensis S. Guo & L. Zhou （GenBank： KT861405，F(xiàn)ungal name： FN570360）.

Key words：Fomitiporia；New species；Morphology；Classification；Culture medium

嗜藍孢孔菌（Fomitiporia）是擔子菌門 Basidiomycota，傘菌亞門 Agaricomycotina，傘菌綱 Agaricomycetes，銹革孔菌目 Hymenochaetales 銹革孔菌科 Hymenochaetaceae 的一個屬，隨著形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合研究技術(shù)的進步，對嗜藍孢孔菌屬Fomitiporia的研究也有了很大的進展，發(fā)現(xiàn)了許多新的分類單元[1-3]。

我們在研究山西省食藥用菌種質(zhì)資源的工作中，在山西大同地區(qū)的右玉縣發(fā)現(xiàn)并采集到了一種生長在沙棘樹上的木生真菌。通過對采集標本進行的形態(tài)學(xué)和ITS序列比對的分析研究發(fā)現(xiàn)，該菌是屬于Fomitiporia屬的一個種，并對該菌種的培養(yǎng)基質(zhì)進行了試驗，現(xiàn)將其結(jié)果概述如下。

1 材料和方法

1.1 材料的采集和菌株的保存 課題組在山西右玉采集到了一種生長在沙棘樹上的嗜藍孢孔菌屬真菌，采集人郭尚等，采集時間2015年10月，寄主為沙棘樹（Hippophae rhamnoides Linn.），標本編號SXSYJBB1510，保存于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所內(nèi)。該標本采集地點海拔1352m，北緯39°98′、東經(jīng)112°47′，這個地區(qū)的山脈是山西地區(qū)針闊葉林和混交林地帶的生長處。以采集的新鮮沙棘腐木上的子實體，進行組織分離得到純菌株，保存于山西省農(nóng)科院食用菌所內(nèi)（SXSYJJZ No.1510）和中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC No.13380）。

1.2 菌絲分離與培養(yǎng) 采用組織分離法，子實體整體用75%乙醇擦拭消毒后，在無菌條件下，用手術(shù)刀分別在菌蓋、菌柄、菌褶、根部切取小塊組織，分別接種于121℃滅菌30min的PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，水1L）。將接種的培養(yǎng)基放置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔24h檢查一次菌絲的生長情況。

1.3 形態(tài)學(xué)研究 標本保存于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所。肉眼觀察標本的顏色、質(zhì)地、形狀、生長年限、平伏或有菌蓋，菌蓋是否有毛或環(huán)帶等特征，然后用標尺測量子實體的長度、寬度和厚度。

在尼康E80i顯微鏡下利用Melzer、棉藍和5%KOH三種試劑作切片浮載劑觀察顯微形狀，包括：菌絲系統(tǒng)（單系或二系或三系、菌絲在棉藍試劑中有無嗜藍反應(yīng)、在Melzer試劑中有無淀粉質(zhì)反應(yīng)或擬糊精反應(yīng)、在5%KOH試劑中有無變化或反應(yīng)、菌髓或菌肉菌絲的排列方式）；生殖菌絲（顏色、簡單分隔或鎖狀聯(lián)合、分隔常見或稀少、薄壁或厚壁、平直或彎曲、有無分支、菌髓或菌肉中生殖菌絲常見或稀少、致密或疏松、交織排列或平行排列、直徑）；骨架菌絲（顏色、薄壁或厚壁或近實心、平直或彎曲、有無分枝、致密或疏松、交織排列或平行排列、直徑）；囊狀體或擬囊狀體（有或無、形狀、厚壁或薄壁、是否包被結(jié)晶、大?。?；其他結(jié)構(gòu)如剛毛、樹狀菌絲或菌絲釘?shù)鹊挠袩o，擔孢子和擬擔子的形狀、顏色、厚壁或薄壁，表面光滑或有紋飾，在棉藍試劑和Melzer試劑中的反應(yīng)、大小、平均長、平均寬、長寬比等。綜合宏觀、微觀特征并結(jié)合生態(tài)習(xí)性和腐朽類型等性狀，查閱相關(guān)資料對采集的標本進行鑒定[4]。

1.4 ITS DNA鑒定 在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)Fomitiporia yanbeiensis菌絲后，刮取50mg的菌絲，用CTAB的方法提取總DNA，抽提后分別用微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和完整性。采用通用引物ITS5（GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G）和 ITS4（TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC），對提取的真菌菌絲基因組ITS DNA進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min，重復(fù)95℃變性30sec，57℃復(fù)性1min，72℃延伸1min這變性—復(fù)性—延伸三個過程35個循環(huán)，最后在72℃保溫10min。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

采用天根生化科技有限公司的膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化，純化產(chǎn)物進行sanger測序，將測序結(jié)果中質(zhì)量較低的堿基剔除，同時將測得的ITS序列上傳NCBI，對Fomitiporia yanbeiensis的ITS DNA進行Blast同源比對后，找到所分離菌株的同源性最高物種，并作為鑒定結(jié)果。

1.5 菌種培養(yǎng)基質(zhì)實驗 采用三種培養(yǎng)基，觀察菌絲生長情況。培養(yǎng)基成分：小麥、玉米、小米為主料，配以石膏粉和碳酸鈣。小麥（玉米、小米）100：石膏粉25%：碳酸鈣25%，即，主料2.5kg，拌入石膏粉25g，碳酸鈣25g，攪拌均勻，調(diào)至含水量60%～65%，裝袋，pH值自然。每袋裝料250個左右。接種后觀察菌種的生長狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)鑒定及形態(tài)特征描述 嗜藍孢孔菌新種；見圖1。

子實體：擔子果7年多生，蓋狀無柄，有時平伏反卷生長，單生覆瓦狀生，新鮮時無特殊氣味，木栓質(zhì)，干燥后木質(zhì)。菌蓋馬蹄形，單個菌蓋大約7cm長，4cm寬，2cm厚。菌蓋上表面棕褐色，粗糙，無同心環(huán)帶；菌蓋邊緣鈍，黃褐色。菌蓋背表面綠褐色，菌肉黃褐色，具同心的環(huán)區(qū)，木栓質(zhì)，達30mm厚。菌管比菌肉顏色稍暗，棕黃色，木質(zhì)，達10mm長（圖1）。

菌絲結(jié)構(gòu)：單系菌絲系統(tǒng)，生殖菌絲有鎖狀聯(lián)合。骨架菌絲在Melzer試劑和棉藍試劑中呈負反應(yīng)；菌絲組織在氫氧化鉀試劑中無反應(yīng)，菌絲即不消解，也不膨脹。菌肉：生殖菌絲無色至淺黃色，薄壁至稍厚壁，偶爾分枝，直徑為1.4～2.5μm。骨架菌絲占多數(shù)，黃褐色至銹褐色，厚壁且有一寬或窄的內(nèi)腔，通常分枝，但不分隔，有時塌陷，交織排列，直徑為1.7～3.2μm。

菌管：生殖菌絲占少數(shù)，無色，薄壁，偶爾分枝，直徑為2～3μm；骨架菌絲占多數(shù)，黃褐色，厚壁，大致沿菌平行排列，直徑為2.5～4.8μm。子實層中無剛毛和有囊狀體，薄壁，大小為（4.6～8）μm×（3.8～4）μm；擔子桶狀或近球狀，不著生擔孢子梗，大小為（6～12）μm×（4～6.5）μm。擬擔子少數(shù)，形狀與擔子相似，比擔子稍小。

孢子：擔孢子近球形或球形，無色，厚壁，平滑，在Melzer試劑中呈淀粉反應(yīng)，在棉藍試劑中其壁沒有嗜藍反應(yīng)，大小為（4.0～5.1）μm×（5.4～6.1）μm，平均長為4.52μm，平均寬為4.18μm，長寬比約為1.08。

菌絲培養(yǎng)性狀：培養(yǎng)的菌絲初期為白色，茸毛狀，后期顏色逐漸變?yōu)闇\黃色至黃色，菌絲變得較致密，毛氈狀，菌落邊緣的菌絲白色、稀疏，菌絲生長過程中形成的菌落沒有明顯的環(huán)帶，在整個生長過程中菌絲無特殊氣味，培養(yǎng)基的顏色不斷發(fā)生變化，不產(chǎn)生子實體。在顯微鏡下觀察，菌絲類型為單系菌絲系統(tǒng)，具有生殖菌絲和骨架菌絲（圖2）。

2.2 ITS測序比對鑒定結(jié)果 凝膠電泳結(jié)果顯示得到了條帶單一、大小較為一致的PCR結(jié)果，將PCR產(chǎn)物純化后進行Sanger測序。將測序結(jié)果上傳NCBI并獲得檢索登錄號：KT861405.1。對所得到的序列進行Blast同源比對分析，發(fā)現(xiàn)與Fomitiporia yanbeiensis ITS DNA同源性最高的物種都是嗜藍孢孔菌屬的一些種類。

在本研究中，獲得Fomitiporia yanbeiensis sp. nov. ITS序列片段長度789bp，在GenBank中經(jīng)Blast檢索比對，與Fomitiporia sp. HC-2016a和HC-2016b，GenBank： KU364417，KU364419，KU364420，KU364421，KU364422，KU364423等親緣關(guān)系較近，這些菌株采自于中國西藏[11]，相似性為95%～96%。在GenBank經(jīng)Blast檢索比對的結(jié)果中，其他的Fomitiporia sp.都具有較大親緣差距，相似性在91%以下。

2.3 菌種培養(yǎng)基質(zhì)實驗結(jié)果 本實驗采用了3種培養(yǎng)基質(zhì)，接種新菌后30d和45d進行了菌絲生長狀態(tài)調(diào)查，其結(jié)果見表1。

菌絲培養(yǎng)基質(zhì)試驗結(jié)果表明，接種后30d時，玉米基質(zhì)中有70%長滿菌袋，有20%菌絲超過1/2袋，只有5%的個體菌絲沒有長滿1/2袋。小麥培養(yǎng)基質(zhì)中，有45%的個體長滿了菌袋，30%菌絲超過1/2袋，25%的個體的菌絲沒有長滿1/2袋。這種新菌在小米培養(yǎng)基質(zhì)中的生長狀況最為不佳，當接種30d后沒有一個菌袋長滿菌絲，將一半（45%）的菌袋只長滿了1/2左右。

當接種后菌絲生長到45d時，3種培養(yǎng)基質(zhì)中的個體基本上都長滿了菌袋，玉米95%，小麥90%，小米基質(zhì)培養(yǎng)基為70%稍低一點，仍然有30%的個體未長滿菌袋。

3 結(jié)論與討論

嗜藍孢孔菌屬Fomitiporia是屬于銹革孔菌科的一個屬，目前報道包含有37個種[5]，在中國報道的有13個種[2]。嗜藍孢孔菌屬Fomitiporia sp.的擔孢子是透明，厚壁狀的，似糊精狀的，嗜藍色的，這一特征明顯區(qū)別于針層孔菌Phellinus類真菌，最近的系統(tǒng)分類學(xué)研究表明嗜藍孢孔菌屬是銹革孔菌科中的一個獨立的類群[6]。本研究標本Fomitiporia yanbeiensis sp.nov. 擁有Fomitiporia sp.的典型特征，如具有近球形或球形、透明的、厚壁擔孢子，因此可以認為Fomitiporia yanbeiensis應(yīng)歸屬于Fomitiporia.屬的一個新種。

DNA條碼技術(shù)是一個行之有效的生物鑒定手段，ITS序列分析被廣泛應(yīng)用于為微生物種類鑒定[7-8]。在本研究中，獲得Fomitiporia yanbeiensis sp. nov. ITS序列片段長度789bp，在GenBank中經(jīng)Blast檢索比對，與Fomitiporia sp. HC-2016a和HC-2016b，GenBank： KU364417，KU364419，KU364420，KU364421，KU364422，KU364423等親緣關(guān)系較近，這些菌株采自于中國西藏[9]，相似性為95%～96%。在GenBank經(jīng)Blast檢索比對的結(jié)果中，其他的Fomitiporia sp.都具有較大親緣差距，相似性在為91%以下。

本研究報道的Fomitiporia yanbeiensis sp.nov.與Fomitiporia hippopha?icola （H. Jahn） Fiasson & Niemel? 具有相同種類的寄主植物——沙棘樹，有較近的親緣關(guān)系。Fomitiporia hippopha?icola采集于New York Botanical Garden，分離于沙棘腐木上，在中國也報道了西藏、青海、西北、內(nèi)蒙古等地的沙棘樹上有這個種生存[9-11]，與本研究中的Fomitiporia yanbeiensis sp.nov.具有相同的分離源，但是根據(jù)ITS序列分析，在GenBank的Blast比對結(jié)果表明，序列相似度只有88%[12]，這意味著兩個類型可能不屬于相同種類。再者，從形態(tài)學(xué)特征上看，F(xiàn)omitiporia hippopha?icola 在子實體的假復(fù)層沒有囊狀體，菌肉灰褐色至深褐色，遇氫氧化鉀變黑，二系菌絲系統(tǒng)，生殖菌絲無鎖狀聯(lián)合，擔子近球形至桶型，著生4個擔孢子梗，擔孢子在Melzer試劑中呈黃褐色（擬糊精反應(yīng)），在棉藍試劑中呈嗜藍反應(yīng)[13]，而Fomitiporia yanbeiensis子實體復(fù)層一側(cè)膨出囊狀體，單系菌絲系統(tǒng)，這是Fomitiporia hippopha?icola與Fomitiporia yanbeiensis的主要區(qū)別，此外Fomitiporia yanbeiensis的生殖菌絲有鎖狀聯(lián)合，擔孢子在Melzer試劑中變黑，具有淀粉質(zhì)反應(yīng)；菌絲在Melzer試劑中黃褐色，具有擬糊精反應(yīng)，在5%氫氧化鉀試劑中無任何變化，在棉藍試劑中，擔孢子、菌絲沒有嗜藍反應(yīng)。因此本研究結(jié)論認為Fomitiporia yanbeiensis是屬于Fomitiporia.屬的一個新種。在山西北部地區(qū)沙棘樹上發(fā)現(xiàn)有嗜藍孢孔菌屬的活標本，這對山西北部地區(qū)食用菌資源的研究填補了一項空白。

參考文獻

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（責編：張長青）