結(jié)構(gòu)光照明顯微中的偏振控制?

趙天宇周興但旦千佳汪召軍雷銘?姚保利?

1)(中國科學(xué)院西安光學(xué)精密機(jī)械研究所,瞬態(tài)光學(xué)與光子技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安 710119)

2)(中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

結(jié)構(gòu)光照明顯微中的偏振控制?

趙天宇1)2)周興1)但旦1)千佳1)汪召軍1)雷銘1)?姚保利1)?

1)(中國科學(xué)院西安光學(xué)精密機(jī)械研究所,瞬態(tài)光學(xué)與光子技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安 710119)

2)(中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

(2017年5月16日收到;2017年6月13日收到修改稿)

結(jié)構(gòu)光照明顯微(structured illumination microscopy,SIM)作為一種寬場超分辨光學(xué)顯微成像技術(shù),具有成像速度快、光漂白和光毒性弱等優(yōu)點(diǎn),是目前主流超分辨成像方法之一.在SIM技術(shù)中,正弦強(qiáng)度分布的條紋結(jié)構(gòu)光場的對比度決定了SIM超分辨圖像的質(zhì)量.低的條紋對比度將導(dǎo)致樣品中超衍射極限的高頻信息被噪聲掩蓋,從而無法解析出超分辨信息.結(jié)構(gòu)照明入射光的偏振態(tài)調(diào)控決定了干涉條紋的對比度,是SIM的關(guān)鍵技術(shù).鑒于此,本文總結(jié)對比了幾種典型的SIM系統(tǒng)偏振控制方法,同時(shí)提出了一種使用零級渦旋半波片的偏振控制方法.實(shí)驗(yàn)證明,與其他方法相比,采用零級渦旋半波片法可以獲得更高效的偏振控制效果,具有系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單、易使用、可將光能利用率提升到接近100%的優(yōu)點(diǎn).

結(jié)構(gòu)光照明顯微,超分辨,偏振控制,零級渦旋半波片

1 引 言

自十七世紀(jì)荷蘭人列文虎克發(fā)明光學(xué)顯微鏡以來,光學(xué)顯微鏡一直是研究活細(xì)胞生命現(xiàn)象的主流方法.這一發(fā)明極大地推動(dòng)了人類文明的進(jìn)程,將人類的觀察視野由宏觀世界延伸至微觀領(lǐng)域.然而,傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的空間分辨率受到光學(xué)衍射極限的限制,空間分辨率最高只能達(dá)到大約半個(gè)波長,故而對低于200 nm的細(xì)節(jié)信息無能為力,制約了其在亞細(xì)胞水平觀測中的應(yīng)用[1-3].以無損光學(xué)成像進(jìn)一步探索生命活動(dòng)的構(gòu)想似乎在阿貝的預(yù)言下戛然而止.然而近幾十年伴隨著熒光探針技術(shù)的發(fā)展,提出了一系列超分辨光學(xué)顯微成像方法,使得光學(xué)顯微鏡的空間分辨率突破了阿貝極限.其中最具代表性的技術(shù)包括受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)(stimulated emission depletion microscopy,STED)[4,5]、光激活定位顯微技術(shù)(photo-activation localization microscopy, PALM)[6,7]、隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)[8,9],結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)(structured illumination microscopy,SIM)[10-12]等.在這些技術(shù)的推動(dòng)下,超分辨顯微鏡已經(jīng)可以觀察納米尺度范圍內(nèi)的生物體結(jié)構(gòu)及其變化過程,為現(xiàn)代生物學(xué)提供了強(qiáng)有力的研究工具,將相關(guān)領(lǐng)域的研究推向了新的高度.

由于SIM是成像速度最快的超分辨成像技術(shù),自該技術(shù)出現(xiàn)伊始,就受到了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注. SIM技術(shù)最初由Heintzmann和Cremer[10]于1999年提出,通過將光柵經(jīng)由物鏡投影在樣品上產(chǎn)生的正弦強(qiáng)度分布的條紋結(jié)構(gòu)光場,利用四步相移法重構(gòu)超分辨圖像,得到近100 nm空間分辨率的超分辨圖像.在此基礎(chǔ)上,Gustafsson等[11]于2000年采用三步相移法進(jìn)一步提高了SIM 的時(shí)間分辨率.隨著研究的深入,SIM技術(shù)也得到進(jìn)一步的改進(jìn)與拓展.2008年,Schermelleh等[13]使用三光束干涉,成功地記錄到細(xì)胞核膜上核孔復(fù)合體的精細(xì)三維結(jié)構(gòu),其橫向分辨率達(dá)到100 nm,縱向分辨率200 nm.同年,Shao等[14]使用六光束干涉并結(jié)合非相干光干涉照明干涉成像顯微技術(shù)(incoherent interference illumination image interference microscopy,I5M),實(shí)現(xiàn)了縱向及橫向空間分辨率均為100 nm的三維結(jié)構(gòu)光照明顯微,使得從三維上精確定位細(xì)胞內(nèi)部各種細(xì)胞器及觀測活體細(xì)胞內(nèi)的活動(dòng)及反應(yīng)成為可能.線性SIM最大可以將光學(xué)顯微系統(tǒng)的空間分辨率提高一倍.2005年Gustafsson[15]利用熒光分子的非線性響應(yīng),進(jìn)一步將空間分辨率提升至50 nm.Li等[16]于2015年使用鐵電液晶空間光調(diào)制和相位延遲器提升了SIM的時(shí)間分辨率,他們對細(xì)胞內(nèi)吞作用和細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)的研究極大地推動(dòng)了SIM在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用.

以線性SIM為例,將其超分辨成像原理概述如下.顯微物鏡的空間分辨率取決于它能采集到的最大空間頻率f0=2NA/λ(其中NA是物鏡的數(shù)值孔徑).當(dāng)樣品包含的高頻信息f＞f0時(shí),將難以分辨樣品的細(xì)節(jié).如果使用空間頻率為f1的正弦條紋結(jié)構(gòu)光照明樣品,則會(huì)產(chǎn)生空間頻率為fm=|f-f1|的低頻莫爾條紋(Moiré fringes).莫爾條紋實(shí)際上是樣品與結(jié)構(gòu)光的拍頻信號,它包含有樣品超衍射分辨的高頻信息f.當(dāng)fm＜f0時(shí),可以在顯微物鏡下觀察到莫爾條紋,通過解碼,可以提取出樣品的超分辨率信息,進(jìn)而重構(gòu)出樣品的高分辨率圖像.為保證結(jié)構(gòu)光照明顯微系統(tǒng)光學(xué)傳遞函數(shù)(OTF)的各向同性,實(shí)驗(yàn)中需要旋轉(zhuǎn)照明光場在多個(gè)方向上對稱地對樣品照明.通常在每一個(gè)成像平面旋轉(zhuǎn)3個(gè)位置,兩兩夾角60°,如圖1所示.從頻域來看,結(jié)構(gòu)光照明拓展了顯微系統(tǒng)的OTF從f0提高到了f0+f1.因此f1越大,SIM顯微的空間分辨率就越高.但是結(jié)構(gòu)照明光場的空間頻率f1同樣受衍射極限限制,即f1≤f0,所以線性SIM顯微技術(shù)至多可以將光學(xué)顯微系統(tǒng)的空間分辨率提高一倍.

圖1 (a)普通寬場頻譜;(b)單一頻率方向結(jié)構(gòu)光擴(kuò)展了這一方向的頻譜;(c)三個(gè)方向結(jié)構(gòu)光得到近各向同性的頻譜Fig.1.(a)Wide- field spectrum;(b)extended spectrum with single frequency direction;(c)extended nearly isotropic spectrum with three frequency directions.

產(chǎn)生高空間頻率正弦強(qiáng)度分布條紋結(jié)構(gòu)光場是SIM的核心.大多數(shù)的結(jié)構(gòu)光照明顯微系統(tǒng)都使用線偏振的激光束照明衍射光柵或者空間光調(diào)制器產(chǎn)生±1級衍射光,再將兩束衍射光干涉產(chǎn)生周期性正弦干涉條紋照明樣品.改變干涉條紋的相位和旋轉(zhuǎn)方向需要通過電控平移臺(tái)和旋轉(zhuǎn)臺(tái)移動(dòng)衍射光柵來實(shí)現(xiàn),這將不可避免地帶來機(jī)械振動(dòng)并降低系統(tǒng)的時(shí)間分辨率.因此目前大多數(shù)的SIM 系統(tǒng)都采取液晶空間光調(diào)制器(spatial light modulator,SLM)代替衍射光柵的方案,通過編程控制SLM上加載的光柵結(jié)構(gòu)可以實(shí)時(shí)改變正弦干涉條紋的旋轉(zhuǎn)方向和相位,整個(gè)顯微系統(tǒng)的時(shí)間分辨率和穩(wěn)定性都得到了極大的提高.實(shí)驗(yàn)中雙光束干涉條紋的對比度受兩束光偏振態(tài)影響,只有在線偏振入射光偏振方向與條紋方向呈特定角度時(shí)條紋對比度才能達(dá)到最高.為保證結(jié)構(gòu)光照明顯微系統(tǒng)OTF的各向同性,需要改變條紋光場對稱地照明樣品.因此在實(shí)驗(yàn)上必須同步控制入射線偏振光的偏振方向與加載在空間光調(diào)制器上的光柵方向,使二者始終保持平行.

本文針對幾種典型的SIM偏振控制方法進(jìn)行了對比,同時(shí)提出了一種使用零級渦旋半波片的偏振控制方法.實(shí)驗(yàn)證明零級渦旋半波片法可以對SIM系統(tǒng)進(jìn)行更高效的偏振控制,并具有操作簡單和光能利用率高等優(yōu)點(diǎn).

2 理論分析

2.1 偏振方向?qū)Ω缮鏃l紋對比度的影響

我們首先理論分析干涉條紋對比度與入射光偏振方向的關(guān)系,模擬因偏振引起的條紋對比度變化對最終超分辨圖像重構(gòu)質(zhì)量的影響.

圖2 雙光束干涉示意圖Fig.2.Sketch of two beam interference.

如圖2所示,為了簡化問題,設(shè)強(qiáng)度相同、關(guān)于z軸對稱入射的兩束相干平面波在空間xz平面相干疊加,其電場復(fù)振幅矢量分別為：

其中e1,e2分別表示E1,E2振動(dòng)方向的單位矢量; k1,k2是波矢,|k1|=|k2|=k=2π/λ;r是位矢.設(shè)φ表示k與z軸夾角,φ∈(0,π/2);θ為e與xz平面夾角,θ∈(0,π);ex,ey,ez分別為x,y,z軸的單位方向矢量.則有

當(dāng)兩束光發(fā)生干涉時(shí),由光波的疊加原理可知干涉場的復(fù)振幅分布為

所以,干涉場的光強(qiáng)分布為

其圖像如圖3所示.

圖3 干涉條紋對比度隨偏振方向及雙光束夾角的變化規(guī)律Fig.3.The variation of the interference fringe contrast with di ff erent polization angles and the cross angle between the two beams.

可以看出,當(dāng)雙光束偏振方向角θ=90°,即垂直于光束平面xz,亦即為s偏振時(shí),干涉條紋具有最大對比度.而對于雙光束夾角接近180°,如2φ=159°時(shí),當(dāng)雙光束偏振方向平行于光束平面xz時(shí)(即為p偏振時(shí)),干涉條紋也可以接近最大對比度,而其他偏振方向條紋對比度則逐漸下降.因此為了獲得更高的條紋對比度,就必須對偏振方向進(jìn)行控制,以實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的超分辨圖像重構(gòu),一般都將雙光束偏振方向調(diào)制為s偏振,即在xy觀察平面內(nèi)看,偏振方向與干涉條紋方向一致.

2.2 條紋對比度對重構(gòu)圖像的影響

目前,常用的SIM圖像重構(gòu)算法包括Shro ff等[17]提出的POP(phase of peaks)算法, Wicker[18]提出的ACR(auto-correlation reconstruction)算法,Zhou等[19]提出的IRT(image recombination transform)算法.在不同的條紋對比度下,三種算法分別呈現(xiàn)不同的圖像重構(gòu)效果.下面就這三種算法在不同條紋對比度情況下的重構(gòu)結(jié)果進(jìn)行對比.

模擬中為了與實(shí)驗(yàn)條件匹配,設(shè)置物鏡的數(shù)值孔徑為1.49,浸油折射率為1.515,同時(shí),考慮到SIM系統(tǒng)中常選用高靈敏度的sCMOS相機(jī)作為探測器,設(shè)探測器分辨率為2048×2048像素,像素大小為6.5μm.如圖4(a)所示,選用分辨率漸變的USAF1951分辨率測試板作為測試目標(biāo),該分辨率板空間頻率在中心處達(dá)到最高,往外緣呈逐級減小趨勢.在波長為500 nm時(shí),模擬系統(tǒng)的衍射極限為168 nm.當(dāng)條紋頻率增至衍射極限時(shí),算法估測誤差將顯著增大,且精度受到噪聲干擾,因此模擬中加載的條紋周期為170 nm,并使用高斯噪聲模擬退化圖像.模擬重構(gòu)圖像結(jié)果如圖4所示,其中圖4(a)為寬場結(jié)果.在圖4(b)—圖4(d)中,當(dāng)m=0.01時(shí),由于高頻信息被淹沒在噪聲中,三種算法均失效,無法提供重構(gòu)結(jié)果.在圖4(e)—圖4(g)中,當(dāng)m=0.1時(shí),POP和ACR算法可以辨認(rèn)出分辨率板上的圖案,但是由于偽影存在,不能提供真實(shí)可靠的細(xì)節(jié)信息,而IRT算法已經(jīng)可以得到良好的重構(gòu)結(jié)果.在圖4(h)—圖4(j)中,當(dāng)條紋對比度m=0.5時(shí),三種算法均可以得到較好的重構(gòu)圖像,并且沒有偽影產(chǎn)生.由此可見,對于不同的SIM圖像重構(gòu)算法,高的條紋對比度是獲得高品質(zhì)圖像的必要條件.而偏振方向的變化將影響條紋對比度進(jìn)而影響最終的圖像重構(gòu)質(zhì)量,因此,為了得到高質(zhì)量的超分辨結(jié)果,就必須對系統(tǒng)進(jìn)行偏振控制.

圖4 三種算法在不同條紋對比度情況下的重構(gòu)結(jié)果對比 (a)普通顯微鏡結(jié)果;(b)—(d)m=0.01重構(gòu)結(jié)果; (e)—(g)m=0.1重構(gòu)結(jié)果;(h)—(j)m=0.5重構(gòu)結(jié)果Fig.4.Comparison of reconstructed images of the simulated object by using three algorithms at di ff erent fringe contrast：(a)Wide- field;(b)–(d)reconstructed images with m=0.01;(e)–(g)reconstructed images with m=0.1;(h)–(j)reconstructed images with m=0.5.

3 結(jié)構(gòu)光照明顯微中的幾種偏振控制方法

由于條紋對比度是SIM重構(gòu)超分辨圖像的重要參數(shù),而上文的模擬顯示干涉光束的偏振態(tài)決定了干涉條紋的對比度.這里選取具有代表性的3種方法,對SIM技術(shù)中的偏振控制方法進(jìn)行詳細(xì)介紹與對比.

3.1 相位延遲器法

在早期Gustafsson等機(jī)械式地旋轉(zhuǎn)和平移衍射光柵的方式來控制干涉條紋的相位和方向時(shí),需要在光路中加入一個(gè)可以同步旋轉(zhuǎn)控制的半波片來實(shí)現(xiàn)雙光束的偏振態(tài)的同步控制.然而機(jī)械轉(zhuǎn)動(dòng)的半波片已經(jīng)無法滿足高速成像實(shí)驗(yàn)對系統(tǒng)的速度與穩(wěn)定性的要求.Kner等[20]在SIM系統(tǒng)中使用鐵電液晶SLM時(shí),同時(shí)還使用了一對鐵電液晶相位延遲器(ferro-electric liquid crystal phase retarders,FLC)進(jìn)行光束的偏振控制(如圖5(a)所示).FLC由充滿液晶分子的透明液晶盒組成,液晶分子在未加電壓的情況下,其快軸方向豎直,對入射光束產(chǎn)生的相位延遲量為0.加載一定電壓后,液晶分子快軸方向?qū)?huì)旋轉(zhuǎn)45°, FLC對入射光束產(chǎn)生的相位延遲量和外加電壓大小相關(guān).

該系統(tǒng)的偏振控制原理如圖5(b)所示,其中紅色箭頭表示系統(tǒng)中各個(gè)位置處激光的偏振方向,藍(lán)線代表兩個(gè)FLC和一個(gè)1/4波片(QWP)的快軸方向.入射光依次通過兩個(gè)FLC和一個(gè)1/4波片,控制兩個(gè)FLC的相位延遲量為λ/3,即每一個(gè)FLC相當(dāng)于一個(gè)快軸方向可變的1/3波片.如圖5(b)第一行所示,當(dāng)所需條紋方向?yàn)?°時(shí),兩個(gè)FLC均不加載電壓,則入射光沒有旋轉(zhuǎn),出射光即為垂直偏振.如圖5(b)第二行所示,當(dāng)所需條紋方向?yàn)?0°時(shí),則第一個(gè)FLC不變,第二個(gè)加載電壓,出射光即為60°線偏振.如圖5(b)第三行所示,當(dāng)所需條紋方向?yàn)?60°時(shí),則兩個(gè)FLC都加載電壓,出射光為-60°線偏振.

圖5 (a)相位延遲器法裝置示意圖;(b)使用三個(gè)相位延遲器對光束進(jìn)行偏振控制的示意圖[20]Fig.5.(a)Schematic of polarization control by using phase retarders;(b)process of polarization control by using three phase retarders[20].

FLC最大的優(yōu)點(diǎn)在于可以快速(＜100μs)準(zhǔn)確地對光束偏振方向進(jìn)行調(diào)制.然而由于其變化過程需要編程控制,并需要同空間光調(diào)制器等器件進(jìn)行同步,使得系統(tǒng)的復(fù)雜度增加.另外,由于需要使用兩個(gè)FLC,實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的總透過率將小于90%.

3.2 分區(qū)偏振片法

為了解決FLC操作復(fù)雜的問題,2014年F?rster等[21]設(shè)計(jì)了一個(gè)特殊的分區(qū)偏振片(segmented polarizer),其結(jié)構(gòu)如圖6所示.該分區(qū)偏振片是一個(gè)無源器件,由12個(gè)偏振片膠合而成,其中每一個(gè)小扇形代表一塊偏振片,其偏振透光軸方向如箭頭所示.實(shí)驗(yàn)時(shí)將由SLM衍射得到的兩束線偏振光通過1/4波片調(diào)制為圓偏振光,當(dāng)兩束圓偏光沿圖6中所示兩個(gè)相同顏色的圓斑位置入射分區(qū)偏振片時(shí),出射線偏光的偏振方向可以調(diào)制為圓斑內(nèi)箭頭所指的偏振方向,并且與兩光束的干涉條紋方向平行,從而實(shí)現(xiàn)SIM系統(tǒng)的偏振控制.

分區(qū)偏振片的優(yōu)點(diǎn)在于其本身為無源器件,調(diào)整好光路后不需要加入額外的同步控制,從而簡化了SIM系統(tǒng)的操作.然而由于入射的圓偏光經(jīng)過分區(qū)偏振片后,理論上將損失50%的光強(qiáng),如果再考慮到偏振片材料的吸收特性,該方法的能量利用率將小于50%.

圖6 分區(qū)偏振片結(jié)構(gòu)示意圖[21]Fig.6.Methord of polarization control by using segmented polarizer.

3.3 零級渦旋半波片法

針對前兩種偏振調(diào)制技術(shù)的不足,本文提出了一種使用零級渦旋半波片進(jìn)行偏振控制的方法.零級渦旋半波片(zero-order vortex half-wave retarder,VHR)是一種非均勻半波片,其快軸方向并不惟一,圖7中的單箭頭方向?yàn)樵撐恢锰幇氩ㄆ目燧S方向.圖8是使用VHR進(jìn)行偏振控制的原理示意圖,如果需要產(chǎn)生方向如圖8(d)所示的干涉條紋,首先將兩束入射線偏光的偏振方向調(diào)節(jié)為圖8(a)雙箭頭所示垂直方向,紅色圓斑為兩光束的入射位置,圖8(b)中的單箭頭代表零級渦旋半波片的快軸方向.當(dāng)兩光束通過VHR調(diào)制后,出射光的偏振方向?yàn)閳D8(c)中紅色圓斑位置處的雙箭頭方向,即為所需的偏振方向.同理,其余兩個(gè)方向的偏振控制原理如圖8(e)—(l),從而實(shí)現(xiàn)了SIM偏振控制.

在能量利用率方面,VHR透過率與普通半波片類似,幾乎沒有能量損失,理論上接近100%,從而大大提高了系統(tǒng)的能量利用率.同時(shí)VHR與之前的分區(qū)偏振片一樣,都是無源器件,不需要像液晶相位延遲器一樣進(jìn)行同步控制,可以簡化SIM系統(tǒng).

由以上分析可知,三種偏振控制方法均可對光束進(jìn)行偏振控制,具體比較結(jié)果列于表1.可以看出,零級渦旋半波片法在系統(tǒng)復(fù)雜度和能量利用率方面有著明顯的優(yōu)勢.

圖7 零級渦旋半波片快軸方向分布示意圖Fig.7.Distribution of the fast axis orientation of the zero-order vortex half-wave retarder.

圖8 零級渦旋半波片偏振控制過程示意圖Fig.8.Scheme of polarization control by using the zero-order vortex half-wave retarder.

表1 不同偏振控制方法的比較Table 1.Comparison of di ff erent polarization control methods.

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了驗(yàn)證零級渦旋半波片的效果,我們搭建了如圖9所示的SIM實(shí)驗(yàn)系統(tǒng).波長532 nm激光器發(fā)出的水平線偏振光,通過偏振分光棱鏡(PBS)和半波片,垂直入射鐵電液晶空間光調(diào)制器(2048×1536 pixels,QXGA-3 DM,英國Forth Dimension Displays公司).利用Wen等[22]編寫的程序計(jì)算衍射光柵圖像,并加載到空間光調(diào)制器上.經(jīng)空間光調(diào)制器衍射的光原路返回,再次通過半波片并由PBS反射進(jìn)入后續(xù)光路.其中偏振分光棱鏡、半波片和鐵電液晶空間光調(diào)制器共同作用,相當(dāng)于入射激光照射一個(gè)相位型衍射光柵[20],產(chǎn)生的垂直偏振±1級衍射光進(jìn)入透鏡1(焦距500 mm).實(shí)驗(yàn)中使用一個(gè)空間濾波器阻擋零級光,保留±1級衍射光通過.±1級衍射光經(jīng)過零級渦旋半波片改變偏振態(tài)后,再通過透鏡2(焦距175 mm)和透鏡3(焦距125 mm)組成的共焦系統(tǒng)進(jìn)入顯微物鏡(100×,NA=1.49,日本Nikon公司),兩衍射光在物鏡的焦平面附近上形成干涉條紋,激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光.熒光信號由物鏡收集后通過二向色鏡反射,經(jīng)過筒鏡,由sCMOS相機(jī)(2048×2048 pixels,ORCA- fl ash4.0,日本濱松公司)采集圖像.

圖9 使用零級渦旋半波片法進(jìn)行偏振控制的SIM系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)光路圖Fig.9.Experimental setup of the interference-type structured illumination microscope by using the zeroorder vortex half-wave retarder for polarization control.

我們首先測試了偏振調(diào)制對作用在樣品上的結(jié)構(gòu)光干涉條紋對比度的影響.在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中,為了調(diào)制±1級衍射光的偏振方向,將實(shí)驗(yàn)光路中的VHR換為一個(gè)半波片.實(shí)驗(yàn)以牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(bovine pulmonary artery endothelial,BPAE)為測試樣品,并選取了方向分別為0°,60°和-60°的條紋光場進(jìn)行照明.為了更好地展示偏振控制對條紋對比度的影響,設(shè)置條紋的周期約為300 nm.圖10顯示了不同條紋方向下偏振方向?qū)l紋對比度的影響.其中圖10(a),(d),(g)為0°條紋時(shí),條紋對比度隨著偏振方向θ角的增大而增加,當(dāng)θ=90°,即偏振方向?yàn)閟偏振時(shí),系統(tǒng)可獲得最大的條紋對比度.圖10(b),(e),(h)為條紋方向60°的情況;圖10(c),(f),(i)為條紋方向-60°的情況.可見,使用零級渦旋半波片對偏振方向進(jìn)行調(diào)制,保證了偏振方向始終為s偏振,從而可獲取最大的條紋對比度.

接下來我們使用直徑40 nm熒光小球?qū)IM系統(tǒng)進(jìn)行了分辨率標(biāo)定,結(jié)果如圖11所示.圖11(b)—圖11(d)是兩個(gè)近鄰的小球成像結(jié)果.可以看出,在SIM下可以分辨的兩個(gè)小球,由于兩球相距180 nm,小于衍射極限,普通寬場下無法區(qū)分.同時(shí),我們還測量了單個(gè)熒光小球的半高寬,如圖11(e)—圖11(g)所示,虛線表示普通寬場結(jié)果,其半高寬為240 nm,略大于衍射極限220 nm;實(shí)線表示SIM超分辨結(jié)果,半高寬為108 nm,比寬場結(jié)果分辨率提升一倍,實(shí)現(xiàn)了SIM技術(shù)可以達(dá)到的2倍分辨率提升效果.

圖10 偏振方向?qū)τ诓煌较驐l紋對比度的影響 對于0°,60°和-60°三個(gè)不同方向的條紋,偏振方向?qū)悠飞袭a(chǎn)生的干涉條紋對比度的影響：(a)—(c)θ=45°,(d)—(f)θ=60°,(g)—(i)θ=90°Fig.10.Comparison of the interference fringe contrast at di ff erent polarization directions.For di ff erent fringe orientations of 0°,60°and-60°,the variation of fringe contrast with the polarization directions：(a)–(c)θ=45°;(d)–(e)θ=60°,(g)–(i)θ=90°.

為了檢驗(yàn)系統(tǒng)對生物樣品的成像分辨能力,我們分別對大腸桿菌和人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞進(jìn)行拍攝.圖12是對大腸桿菌進(jìn)行的超分辨成像結(jié)果.樣品由Syto-64標(biāo)記熒光,并吸附于經(jīng)過poly-L-lysine處理后的蓋玻片上.其中圖12(a)左半邊為普通寬場圖像,右半邊為SIM超分辨結(jié)果,可以清楚地看出,相對于寬場成像,我們的裝置對圖像分辨率有很大提升.圖12(b)和圖12(c)是圖12(a)中虛線方框部分放大結(jié)果,圖12(d)為圖12(b)和圖12(c)中直線標(biāo)記位置的歸一化強(qiáng)度分布,相對于虛線表示的寬場圖像結(jié)果,實(shí)線表示的超分辨結(jié)果可以觀察到大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)的分布變化.

圖11 直徑40 nm熒光小球超分辨結(jié)果 (a)結(jié)構(gòu)光照明顯微結(jié)果;(b)—(d)兩個(gè)相鄰小球的局部放大以及強(qiáng)度分布對比;(e)—(g)單個(gè)小球局部放大以及半高寬測量對比Fig.11.Super-resolution image of 40 nm-diameter fl uorescent beads：(a)SIM;(b)–(d)zoom-in of two beads and measurement of normalized intensity;(e)–(g)zoom-in of one bead and measurement of full width at half maximum.

圖12 大腸桿菌超分辨實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (a)普通顯微鏡和結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡結(jié)果對比;(b)普通顯微鏡局部放大圖; (c)結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡局部放大圖;(d)局部放大圖中直線標(biāo)記處的歸一化強(qiáng)度分布曲線Fig.12.Super-resolution image of E.coli：(a)Comparison of wide- field and SIM;(b)partly enlarged view of wide- field;(c)partly enlarged view of SIM;(d)normalized intensity pro fi les along the marked lines in(b) and(c).

圖13 人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞超分辨結(jié)果 (a)普通顯微鏡和結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡結(jié)果對比;(b)普通顯微鏡局部放大圖;(c)結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡局部放大圖;(d)局部放大圖中直線標(biāo)記處的歸一化強(qiáng)度分布曲線Fig.13.Super-resolution image of human retinal pigment epithelium：(a)Comparison of wide- field and SIM;(b)partly enlarged view of wide- field;(c)partly enlarged view of SIM;(d)normalized intensity pro fi les along the marked lines in(b)and(c).

圖13是對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞進(jìn)行的超分辨成像結(jié)果,樣品經(jīng)過熒光免疫蛋白ab6160對細(xì)胞微管蛋白標(biāo)記熒光.其中圖13(a)左半邊為普通寬場圖像,右半邊為SIM超分辨結(jié)果.圖13(b)和圖13(c)為圖13(a)中紅色虛線方框部分放大結(jié)果,相對于普通寬場結(jié)果,SIM圖像可以更清晰地分辨細(xì)胞微管結(jié)構(gòu).圖13(d)為圖13(b)和圖13(c)中直線標(biāo)記位置處的歸一化強(qiáng)度分布,可以看出在普通顯微鏡下無法分辨的兩條微管結(jié)構(gòu),在SIM中可以清晰分辨.

5 結(jié) 論

在主流的遠(yuǎn)場超分辨光學(xué)顯微成像技術(shù)中, SIM技術(shù)憑借高時(shí)間分辨率、低光毒性和低光漂白性等諸多優(yōu)點(diǎn),尤其適合對生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的活體樣本進(jìn)行超分辨動(dòng)態(tài)觀測.而激光干涉型SIM中的偏振控制是關(guān)鍵,決定了能否最終得到高質(zhì)量的超分辨圖像.本文詳細(xì)對比了三種不同的偏振控制方法：相位延遲器法、分區(qū)偏振片法和零級渦旋半波片法.通過對三種方法的分析比較,證明了零級渦旋半波片法能對不同入射方向的光束進(jìn)行偏振控制,并具有操作簡單、光能利用率高的優(yōu)點(diǎn),對SIM技術(shù)的應(yīng)用推廣具有一定的意義.

感謝美國Bu ff alo大學(xué)Piero Bianco副教授提供大腸桿菌樣品,感謝北京大學(xué)孫育杰課題組提供人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞樣品.

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PACS:87.64.M—,87.64.kv DOI:10.7498/aps.66.148704

Polarization control methods in structured illumination microscopy?

Zhao Tian-Yu1)2)Zhou Xing1)Dan Dan1)Qian Jia1)Wang Zhao-Jun1)Lei Ming1)?Yao Bao-Li1)?
1)(State Key Laboratory of Transient Optics and Photonics,Xi’an Institute of Optics and Precision Mechanics,Chinese Academy of Sciences,Xi’an 710119,China)
2)(University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)

16 May 2017;revised manuscript

13 June 2017)

Structured illumination microscopy(SIM)is one of the most promising super-resolution techniques,owing to its advantages of fast imaging speed and weak photo bleaching.The quality of the SIM image is greatly dependent on the contrast of the sinusoidal fringe illumination patterns.Low fringe contrast illumination will seriously a ff ect the super-resolution result and lead to additional artifacts.The generation of fringe patterns with high contrast is the key requirement in hardware for the SIM technique.This can be done by the interference of two laser beams di ff racted from the phase gratings addressed on a spatial light modulator.Meanwhile,for maximal interference contrast,precise polarization control to maintain s-polarization for di ff erent fringe orientations is critical.In this paper,we review several typical polarization control methods in SIM,and propose a new method by using a zero-order vortex half-wave retarder (VHR).Compared with the other methods,the presented VHR-based polarization control method is very efficient in terms of simple system con fi guration,ease of use,and high light energy utilization efficiency near to 100%.

structured illumination microscopy,super-resolution,polarization control,zero-order vortex half-wave retarder

:87.64.M—,87.64.kv

10.7498/aps.66.148704

?國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號：61522511,11404389,81427802,11474352)和陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(批準(zhǔn)號：2016JZ020)資助的課題.

?通信作者.E-mail：leiming@opt.ac.cn

?通信作者.E-mail：yaobl@opt.ac.cn

?2017中國物理學(xué)會(huì)Chinese Physical Society

http://wulixb.iphy.ac.cn

*Project supported by the National Natural Science Foundation of China(Grant Nos.61522511,11404389,81427802, 11474352)and the Basic Research Plan of Natural Science in Shaanxi Province,China(Grant No.2016JZ020).

?Corresponding author.E-mail：leiming@opt.ac.cn

?Corresponding author.E-mail：yaobl@opt.ac.cn