貝殼粉對(duì)儲(chǔ)糧霉菌抑制作用的研究

趙 闊 謝更祥 陳 艷 張紅建 羅 山 張連中 鄭聯(lián)合

（海南省糧油科學(xué)研究所，海南 瓊海 571400）

貝殼粉對(duì)儲(chǔ)糧霉菌抑制作用的研究

趙 闊 謝更祥 陳 艷 張紅建 羅 山 張連中 鄭聯(lián)合

（海南省糧油科學(xué)研究所，海南 瓊海 571400）

本研究通過(guò)直接粉碎、煅燒、酸處理和堿處理四種工藝制備貝殼粉，研究了貝殼粉對(duì)灰綠曲霉、黃曲霉、青霉、根霉和高大毛霉五種儲(chǔ)糧霉菌的抑制效果，并進(jìn)行了模擬儲(chǔ)藏試驗(yàn)。研究結(jié)果表明：四種工藝制備的貝殼粉均具有良好的抑菌作用，抑菌能力由高到低依次為：酸處理、堿處理、煅燒、直接粉碎。本研究為貝殼粉在儲(chǔ)糧行業(yè)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

貝殼粉；儲(chǔ)糧霉菌；抑制

糧食始終是關(guān)系著我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要資源，是全面建設(shè)小康社會(huì)的重大戰(zhàn)略性物質(zhì)基礎(chǔ)。糧食儲(chǔ)藏是糧食保存的根本。對(duì)糧食儲(chǔ)藏危害最嚴(yán)重的生物因素，主要是儲(chǔ)糧害蟲(chóng)和儲(chǔ)糧微生物。儲(chǔ)糧害蟲(chóng)易察覺(jué)，微生物不易察覺(jué)，而微生物中霉菌對(duì)儲(chǔ)糧的危害最嚴(yán)重[1]。當(dāng)環(huán)境溫濕度滿足霉菌生長(zhǎng)條件后，儲(chǔ)糧就很容易發(fā)生霉腐現(xiàn)象[2]，有的還會(huì)代謝產(chǎn)生毒素，嚴(yán)重威脅到人畜的生命健康[3-4]。本研究利用貝殼的防腐、抑菌作用[5-7]，研究了不同工藝制備的貝殼粉，對(duì)儲(chǔ)糧霉菌的抑制效果，以期為貝殼粉在糧食儲(chǔ)藏中的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

貝殼，購(gòu)自海鮮市場(chǎng)；稻谷,農(nóng)家收購(gòu)；灰綠曲霉、黃曲霉、青霉、根霉、高大毛霉,來(lái)自上海復(fù)祥生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

玻璃干燥器，沈陽(yáng)一化玻商貿(mào)有限公司；AY220電子天平，日本島津；UPN-11-10T超純水制造系統(tǒng)，四川優(yōu)普超純科技有限公司；XSP-BM-2CA生物顯微鏡，上海彼愛(ài)姆光學(xué)儀器廠；SX2-4-10馬弗爐,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；LRH-150-S恒溫恒濕培養(yǎng)箱，廣東醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 貝殼預(yù)處理。將貝殼用清水清洗干凈，除去黏附雜質(zhì)，晾干備用。

1.3.2 貝殼粉制備[8-12]。（1）直接粉碎：將貝殼直接粉碎，過(guò)60目篩。（2）煅燒處理：將直接粉碎后的貝殼粉放入高溫煅燒爐中煅燒1h，取出自然冷卻。（3）酸處理：用稀鹽酸溶液浸泡直接粉碎的貝殼粉，10min后取出，用去離子水洗滌3～4次，晾干，過(guò)60目篩。（4）堿處理：用NaOH溶液浸泡直接粉碎的貝殼粉，30min后取出，用去離子水洗滌3～4次，晾干，過(guò)60目篩。

1.3.3 制備培養(yǎng)基[13]。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：將馬鈴薯洗凈去皮，取200g切成小塊，加水1000mL，煮沸半小時(shí)后，補(bǔ)足水分。在濾液中加入10g瓊脂，煮沸溶解后加葡萄糖20g，補(bǔ)足水分，分裝，滅菌，備用。

1.3.4 預(yù)試驗(yàn)。先取將貝殼粉添加到PDA培養(yǎng)基中，制成貝殼粉-PDA培養(yǎng)基，然后將灰綠曲霉、黃曲霉、青霉、根霉和高大毛霉5種霉菌活化后，分別制備成菌懸液，接種到貝殼粉-PDA培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后觀察菌落總數(shù)。確定貝殼粉最佳用量、煅燒處理最佳煅燒溫度、酸處理最佳酸液濃度和堿處理最佳堿液濃度。

1.3.5 模擬儲(chǔ)藏試驗(yàn)[14]。用玻璃干燥器作為模擬倉(cāng)，如圖1所示。海南常年高溫高濕，儲(chǔ)藏條件惡劣時(shí)倉(cāng)溫甚至高達(dá)35℃，濕度達(dá)80%以上[15]。根據(jù)2010年版中國(guó)藥典，35℃下飽和氯化鉀溶液相對(duì)應(yīng)的濕度為84%。將適量飽和氯化鉀溶液倒入干燥器底部，模擬倉(cāng)內(nèi)濕度。在干燥器隔板上放置過(guò)濾篩網(wǎng)，將直接粉碎、煅燒、酸處理、堿處理的貝殼粉分別以0.5%的劑量與稻谷混合均勻，置于篩網(wǎng)上，裝入體積約為干燥器的50%。將干燥器蓋子蓋上，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中儲(chǔ)藏。以不添加貝殼粉為對(duì)照。每隔5天取樣，進(jìn)行霉菌孢子計(jì)數(shù)。稱取10.0g稻谷于50mL試管中，加入30mL去離子水，加塞用力上下振蕩1min，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾，取濾液于顯微鏡下進(jìn)行霉菌孢子計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝殼粉最佳用量的確定

取直接粉碎的貝殼粉0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g，分別添加到200mLPDA培養(yǎng)基中，以不添加貝殼粉的培養(yǎng)基為對(duì)照，將灰綠曲霉等5種霉菌的菌懸液，接種到貝殼粉-PDA培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后觀察菌落總數(shù)，確定貝殼粉最佳用量。

試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，添加了貝殼粉的培養(yǎng)基上菌落總數(shù)，明顯低于對(duì)照，說(shuō)明貝殼粉對(duì)5種霉菌生長(zhǎng)均有抑制作用，這與文獻(xiàn)報(bào)道中關(guān)于貝殼有抑菌作用的說(shuō)法一致；隨著貝殼粉用量增加，培養(yǎng)基上菌落總數(shù)減少，抑菌效果增強(qiáng)，但貝殼粉用量增加到1.0g以后，增加用量抑菌效果變化不明顯，估計(jì)此時(shí)貝殼粉的抑制作用達(dá)到相對(duì)飽和狀態(tài)，因此確定貝殼粉最佳用量為1.0g。

圖1 貝殼粉用量對(duì)菌落總數(shù)的影響

2.2 煅燒溫度的確定

直接粉碎的貝殼粉分別至于200℃、400℃、600℃、800℃、1000℃高溫爐中煅燒1h，冷卻后各取1.0g，分別添加到200mL PDA培養(yǎng)基中，以添加等量直接粉碎的貝殼粉為照，將灰綠曲霉等5種霉菌的菌懸液，接種到貝殼粉-PDA培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后觀察菌落總數(shù)，確定貝殼粉最佳煅燒溫度。

試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，煅燒溫度對(duì)貝殼粉的抑菌能力有一定影響，經(jīng)過(guò)不同溫度煅燒后的貝殼粉的抑菌能力，均比不經(jīng)過(guò)煅燒的貝殼粉（對(duì)照）的抑菌能力強(qiáng)。煅燒溫度低于600℃時(shí)，煅燒溫度越高貝殼粉的抑菌能力越強(qiáng)，可能是因?yàn)殪褵^(guò)程中貝殼粉中的有機(jī)物發(fā)生了氧化、分解，產(chǎn)生了對(duì)霉菌有抑制作用的物質(zhì)。但煅燒溫度高于600℃后，貝殼粉的抑菌能力變化不明顯，說(shuō)明此時(shí)貝殼粉中的有機(jī)物全部分解完畢，貝殼粉中的碳酸鈣開(kāi)始分解為氧化鈣。因此，確定最佳煅燒溫度為600℃。

圖2 煅燒溫度對(duì)貝殼粉抑菌作用的影響

2.3 酸處理濃度的確定

用0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%鹽酸溶液，分別浸泡處理直接粉碎的貝殼粉，10min后取出，水洗3～4次，晾干后過(guò)60目篩。然后取酸處理貝殼粉各1.0g，分別添加到200mL PDA培養(yǎng)基中，以添加等量直接粉碎的貝殼粉為對(duì)照，將灰綠曲霉等5種霉菌的菌懸液接種到貝殼粉-PDA培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后觀察菌落總數(shù)。

圖3 鹽酸溶液濃度對(duì)貝殼粉抑菌作用的影響

試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，鹽酸溶液濃度對(duì)貝殼粉的抑菌效果有較大影響，添加了酸處理貝殼粉的培養(yǎng)基上菌落總數(shù)明顯低于對(duì)照。分析其原因，可能是因?yàn)辂}酸處理過(guò)程中，鹽酸與貝殼中的碳酸鈣發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，增加了貝殼粉的表面積，并且鹽酸溶液滲透進(jìn)貝殼粉的微孔中，清除了微孔中的雜質(zhì)，使微孔擴(kuò)大，表面積進(jìn)一步增加，提高了抑菌能力。但鹽酸濃度增加到0.6%以后，再增加鹽酸溶液濃度，貝殼粉的抑菌能力逐漸減弱，說(shuō)明鹽酸溶液濃度過(guò)高反應(yīng)過(guò)于激烈，會(huì)破壞貝殼粉中的有效抑菌成分，降低貝殼粉的抑菌能力。因此，確定鹽酸溶液濃度為0.6%。

2.4 堿處理濃度的確定

用1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%的氫氧化鈉溶液，分別浸泡處理貝殼粉，30min后取出，水洗3～4次，晾干后過(guò)60目篩。然后取堿處理貝殼粉各1.0g，分別添加到200mL PDA培養(yǎng)基中，以添加等量直接粉碎的貝殼粉的培養(yǎng)基作對(duì)照，將灰綠曲霉等5種霉菌的菌懸液接種到培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后觀察菌落總數(shù)。

試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，堿處理對(duì)貝殼粉的抑菌能力也有一定的影響，分析其原因，可能是堿處理過(guò)程中氫氧化鈉與貝殼粉中的氨基酸等化學(xué)成分發(fā)生反應(yīng)，生成了具有抑菌作用的胺、氨基酸鹽或衍生物[16]，提高了貝殼粉的抑菌能力。但氫氧化鈉溶液濃度＞1.2%時(shí)，抑菌效果減弱，說(shuō)明高濃度的氫氧化鉀會(huì)減少貝殼粉中的抑菌成分。因此，確定氫氧化鉀溶液濃度為1.2%。

圖4 氫氧化鈉溶液濃度對(duì)貝殼粉抑菌作用的影響

2.5 不同工藝處理效果對(duì)比分析

試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。在高溫高濕條件下（35 ℃、RH 84%），對(duì)照組稻谷表面的霉菌孢子呈動(dòng)態(tài)上升趨勢(shì)，符合典型的儲(chǔ)糧真菌生長(zhǎng)特征。經(jīng)過(guò)貝殼粉處理過(guò)的稻谷表面霉菌受到不同程度的抑制，其中酸處理的貝殼粉的抑菌效果最佳，因此酸處理貝殼粉在糧食儲(chǔ)藏中有很好的應(yīng)用價(jià)值。

表1 稻谷模擬儲(chǔ)藏后表面霉菌孢子數(shù)單位：（個(gè)/g）

3 結(jié)論

直接粉碎、煅燒、酸處理、堿處理的貝殼粉，均對(duì)霉菌具有良好的抑制作用。在200mL PDA培養(yǎng)基中，直接粉碎的貝殼粉的飽和用量為1.0g；煅燒處理貝殼粉工藝的最佳煅燒溫度為600℃；酸處理工藝最佳鹽酸濃度為0.6%；堿處理工藝最佳氫氧化鈉濃度為1.2%。四種工藝的抑菌能力由高到低依次為：酸處理、堿處理、煅燒、直接粉碎。本研究為貝殼粉在糧食儲(chǔ)藏中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

[1]Wright E J,Webb M C,Highley E. Stored grain in Australia 2003 [C]. Canberra:CSIRO Stored Grain Research Laboratory,2003:55～58.

[2]田國(guó)軍等.不同儲(chǔ)藏條件下稻谷霉菌總數(shù)變化規(guī)律研究[J].糧油倉(cāng)儲(chǔ)科技通訊,2014(6):47～49.

[3]唐芳,程樹(shù)峰伍,松陵.玉米儲(chǔ)藏主要危害真菌生長(zhǎng)規(guī)律的研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2008,23( 5) :137-140.

[4]張福林.淺談黃曲霉毒素的危害與防控[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘,2012,28(7):104.

[5]曾名勇,陳勝軍.海洋生物抗菌劑的研究進(jìn)展[J].精細(xì)與專(zhuān)用化學(xué)品,2002,10(19):3～6.

[6]陳士勇,王令充,嵇晶等.雙殼類(lèi)貝殼的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)海洋藥物,2011,30(1):58～64.

[7]申南竹.水生貝殼類(lèi)動(dòng)物可抑制水果的腐爛[J].化學(xué)世界,1993(7):45.

[8]J Sawai, H Miyoshi,H Kojima. Sporicidal kinetics of Bacillus subtilis spores by heated scallop shell powder[J].Journal of Food Protection,2003,66(8):1482.

[9]林作鵬.貝殼煅燒物抗菌性研究[D].大連海洋大學(xué),2014.

[10]任惠,張志勝,劉媛等.高溫煅燒貝殼粉抑菌效果研究[J].食品工業(yè),2012(12):102～106.

[11]黃現(xiàn)青,高曉平,李苗云等.煅燒鈣粉對(duì)肉制品保鮮效果研究[J].肉類(lèi)工業(yè),2014(1):38～41.

[12]吳少林,徐京鵬.廢棄牡蠣殼生產(chǎn)活性鈣[J].資源開(kāi)發(fā)與市場(chǎng),2003,19(4):195～196.

[13]James M.Jay.現(xiàn)代食品微生物學(xué)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2001.

[14]趙闊,王濤,陳艷等.山蒼子精油熏蒸花生仁防霉效果的研究[J].糧食與食品工業(yè),2016,06:34-37.

[15]吳紅萍,翟世博,杜晨輝等.海南省儲(chǔ)糧稻谷的霉菌多樣性分析[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(4):138～141.

[16]陳玉枝,林舒.牡蠣殼與龍骨成分的分析[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).1999,33(4):432～434.