慢性阻塞性肺疾病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞NOD2 mRNA表達(dá)及白細(xì)胞介素-6的水平及意義

賈欽堯 陳紹平 李新勝 宋 珊 毛 建 韓美玲

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 南充 637000)

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慢性阻塞性肺疾病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞NOD2 mRNA表達(dá)及白細(xì)胞介素-6的水平及意義

賈欽堯 陳紹平 李新勝 宋 珊 毛 建 韓美玲

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 南充 637000)

目的 探討外周血單個(gè)核細(xì)胞NOD2 mRNA和血清白細(xì)胞介素(IL)-6在慢性阻塞性肺疾病(COPD)發(fā)病機(jī)制中的作用及其與COPD患者嚴(yán)重程度的關(guān)系。方法 對(duì)經(jīng)過門診及住院達(dá)到穩(wěn)定期的COPD患者進(jìn)行綜合評(píng)估，分為A、B、C、D四組，每組30例，同期門診健康體檢者30例作為健康對(duì)照組，采用PCR和ELISA法分別檢測(cè)COPD各組及健康對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞核內(nèi)NOD2 mRNA的表達(dá)及血清中IL-6的含量。結(jié)果 COPD穩(wěn)定期患者外周血單個(gè)核細(xì)胞核內(nèi)NOD2 mRNA及血清IL-6的表達(dá)均明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05)。COPD患者A、B、C、D各組中NOD2 mRNA和IL-6的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05)。COPD患者D組NOD2 mRNA和IL-6的表達(dá)明顯高于C組(P<0.05)，C組和D組的NOD2 mRNA和IL-6的表達(dá)均明顯高于A組和B組(P<0.05)，A組和B組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。COPD患者NOD2 mRNA表達(dá)和IL-6的含量呈正相關(guān)(r=0.81，P<0.05)。結(jié)論 NOD2 和IL-6都參與了COPD氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展，其水平與COPD患者嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

慢性阻塞性肺疾?。籒OD2；白細(xì)胞介素

NOD樣受體(NLRs)可以通過識(shí)別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)快速啟動(dòng)先天免疫，對(duì)病原體作出應(yīng)答，是抵抗病原體入侵第一道防線的重要組成部分〔1〕。PAMPs識(shí)別病原體的受體目前一致被命名為模式識(shí)別受體(PRR)，主要包括Toll 樣受體(TLR)、 RIG-1樣受體(RLRs)、NLRs和C 型凝集素家族及MDA 5〔2〕。NOD2作為NLRs家族中最具有代表性的成員之一，和自身免疫性疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系，并參與了先天免疫中的細(xì)胞凋亡以及炎癥反應(yīng)，但是NOD蛋白家族與慢性阻塞性肺疾病(COPD)之間的關(guān)系尚未見報(bào)道。本文旨在探討NOD2及白細(xì)胞介素(IL)-6在COPD發(fā)病中的作用。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科2013年10月至2014年4月門診和住院緩解后的COPD患者的外周血，根據(jù)其肺功能〔1 s用力呼氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)%、FEV1占預(yù)計(jì)值%〕、癥狀〔英國(guó)醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)(mMRC)呼吸困難指數(shù)〕、過去 1 年急性加重次數(shù)進(jìn)行綜合評(píng)估，患者年齡55～87〔平均(70.76±7.89)〕歲，將患者分為A、B、C、D四組，每組30例。A組是肺功能Ⅰ～Ⅱ級(jí)和(或)1年內(nèi)急性加重次數(shù)≤1次及mMRC分級(jí)0～1的患者，男14例，女16例，平均年齡(69.23±8.42)歲；B組是肺功能Ⅰ～Ⅱ級(jí)和(或)1年內(nèi)急性加重次數(shù)≤1次及mMRC分級(jí)≥2的患者，男17例，女13例，平均年齡(71.86±8.23)歲；C組是肺功能Ⅲ～Ⅳ級(jí)和(或)1年內(nèi)急性加重次數(shù)≤2次及mMRC分級(jí)≥0～1的患者，男15例，女15例，平均年齡(70.57±7.71)歲；D組是肺功能Ⅲ～Ⅳ級(jí)和(或)1年內(nèi)急性加重次數(shù)≤2次及mMRC分級(jí)≥2的患者，男16例，女14例，平均年齡(71.37±7.27)歲。診斷和分組都符合《慢性阻塞性肺疾病診斷、處理和預(yù)防全球策略(2013修訂版)》〔3〕，除合并高血壓、糖尿病、冠心病、自身免疫系統(tǒng)疾病、癌癥、哮喘、結(jié)核病等嚴(yán)重疾病，近2 w內(nèi)未使用茶堿或糖皮質(zhì)激素。同期門診健康體檢者為對(duì)照組，共30例，年齡58～86〔平均(70.23±7.52)〕歲，入選者均無實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)異常。各組間性別、年齡無明顯差異(P>0.05)。

1.2 主要試劑與儀器 人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊锕?，Trizol試劑、實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒、熒光染料試劑盒Power SYBR Green PCR Master Mix(TakaRa公司,Japan)，人IL-6定量ELISA試劑盒(Neobiosciense公司，中國(guó))，低溫高速離心機(jī)5417R(Eppendorf公司，USA)，7900 RT-PCR儀(ABI公司，USA)，肺功能儀3748(HP-Deskjet公司，Germany)，酶標(biāo)儀model680(Bio-Rad公司，USA)。

1.3 研究方法

1.3.1 設(shè)計(jì)引物 依據(jù)GenBank中人β-actin、NOD2的基因序列設(shè)計(jì)PCR引物。NOD2上游：5'-CACCCTGACCGTGTCCTGT-3'。下游：5'-CACCTTGCGGGCATTCTT-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度159 bp；β-actin上游：5'-GAGCT ACGAGCTGCCTGACG-3'，下游5'-GTAG-TTTCGTGGATGCCACAG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度128 bp。

1.3.2 總RNA提取與cDNA合成 取外周靜脈血4 ml，抗凝劑使用EDTA。嚴(yán)格按照說明書操作，分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞，提取總RNA，加30 μl無RNA酶水溶解RNA，最后合成cDNA，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCR檢測(cè)NOD2 mRNA表達(dá) 將COPD患者、健康對(duì)照者cDNA用熒光定量PCR檢測(cè)，建立總體積20 μl反應(yīng)體系。反應(yīng)條件(40個(gè)循環(huán))：95℃ 10 min，95℃ 15 s,60℃ 1 min。每份標(biāo)本作復(fù)孔，復(fù)孔間Ct值差異控制在0.5內(nèi)。目的基因的Ct值減去內(nèi)參的Ct值作為△Ct，目的基因mRNA表達(dá)水平由2-△△Ct表示。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)血清IL-6濃度 應(yīng)用人IL-6定量ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，中國(guó))檢測(cè)各組血清IL-6濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q法分析及Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組外周血單個(gè)核細(xì)胞NOD2 mRNA、血清IL-6水平比較 見表1。COPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞NOD2 mRNA及血清IL-6水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。COPD患者D組NOD2 mRNA和IL-6的水平明顯高于C組(P<0.05)，C組和D組NOD2 mRNA和IL-6水平均明顯高于A組和B組(P<0.05)，A組和B組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組NOD2 mRNA的表達(dá)和血清IL-6水平比較

與對(duì)照級(jí)比較：1)P<0.05；與A組及B組比較：2)P<0.05；與C組比較：3)P<0.05

2.2 COPD患者NOD2 mRNA表達(dá)和血清IL-6含量的相關(guān)性 COPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞核內(nèi)NOD2 mRNA表達(dá)與血清IL-6含量呈正相關(guān)(r=0.81，P<0.05)。

3 討 論

NLR 蛋白家族有其特有的結(jié)構(gòu)特征，所有家族成員都有3個(gè)基本結(jié)構(gòu)域，人類基因組命名委員會(huì)主要依據(jù)其不同的N端功能結(jié)構(gòu)域，把NLRs 家族劃分成為五個(gè)亞家族：即PYD 、CARD 、BIR 和NLRA 以及NLRX 亞家族〔2〕。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，NOD2缺陷的小鼠對(duì)細(xì)菌感染的易感性會(huì)增高，如NOD2缺陷小鼠在接受結(jié)核菌感染時(shí)，對(duì)CD4+,CD8+T細(xì)胞的招募能力以及Ⅰ型細(xì)胞因子的產(chǎn)生能力會(huì)出現(xiàn)下降〔4，5〕。此外，COPD的發(fā)病和煙霧的氧化應(yīng)激具有相關(guān)性，有研究表明，氧化應(yīng)激能夠激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB，促進(jìn)炎癥介質(zhì)在肺內(nèi)的滯留和活化等〔6〕，國(guó)外研究證實(shí)，NOD2能夠激活NF-κB，因此，NOD2在煙霧的氧化應(yīng)激中的可能參與了NF-κB的激活〔7〕。本研究表明，COPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞NOD2 mRNA水平明顯高于對(duì)照組，證實(shí)NOD2參與了COPD疾病的發(fā)生。

COPD是一種慢性肺部炎癥疾病，主要特征是持續(xù)存在氣流受限〔3〕，預(yù)計(jì)在2020年將會(huì)成為全球范圍死亡原因的第3位，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)增加〔8〕。隨著我們對(duì)COPD越來越深入的了解，我們從之前單純對(duì)肺功能分級(jí)的重視，到現(xiàn)在更加綜合的考慮到患者的急性發(fā)作次數(shù)以及患者的主觀癥狀，并通過對(duì)患者資料的綜合整理，進(jìn)行病情評(píng)估，更加具有針對(duì)性。本研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者四組之間，D組NOD2 mRNA表達(dá)明顯高于C組，D組和C組的NOD2 mRNA表達(dá)均明顯高于A組和B組。而A組和B組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)可能是由于A組和B組都屬于低風(fēng)險(xiǎn)，肺功能水平及急性發(fā)作次數(shù)較為接近，對(duì)NOD的激活程度較低〔9〕。目前尚無國(guó)內(nèi)外相關(guān)數(shù)據(jù)作為比較，因此，需要更多的研究加以實(shí)證。

IL-6是趨化因子家族中的一員,具有多種生物學(xué)功能，能增加膠原蛋白凝聚、抑制細(xì)胞外基質(zhì)的分解、刺激成纖維細(xì)胞的增殖等，從而導(dǎo)致COPD 氣道纖維結(jié)締組織形成和平滑肌增生，在COPD的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔10〕。本研究結(jié)果證實(shí)IL-6參與了COPD的發(fā)生和發(fā)展。國(guó)內(nèi)外研究證明，NOD2通過NF-κB 與MAPK 通路產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和促炎性因子，包括IL-6 、IL-1β等，同時(shí)還能促使機(jī)體產(chǎn)生抗菌肽〔11，12〕。本研究顯示，COPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞核內(nèi)NOD2 mRNA表達(dá)同IL-6含量呈正相關(guān)。此外，A組和B組之間血清IL-6含量沒有明顯差異，和在A組和B組中NOD2 mRNA表達(dá)的無差異性的結(jié)論一致，進(jìn)一步佐證了兩者的相關(guān)性。

本研究提示NOD2基因表達(dá)升高，在COPD的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮了非常重要的作用，其機(jī)制是通過信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活血清IL-6等炎癥因子的釋放，進(jìn)一步導(dǎo)致COPD患者炎癥反應(yīng)的加重。

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〔2016-12-19修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)

Expression of NOD2 mRNA in peripheral blood monocytes and serum interleukin-6 level in patients with chronic obstructive pulmonary disease

JIA Qin-Yao，CHEN Shao-Ping，LI Xin-Sheng，etal.

Department of Respiratory Medicine，the Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan, China

Objective To explore the expression of NOD2 mRNA in peripheral blood monocytes (PBMCs) and serum IL-6 level in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and the relationship with the severity of COPD.Methods Comprehensive evaluation of COPD patients in stable phase after outpatient and inpatient treatment，the patients were divided into A, B, C, D groups, 30 cases in each group, 30 healthy examiners in the outpatient on the corresponding period were chosen as healthy control group. PCR method and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) were respectively adopted to detect the expression of NOD2 mRNA in PBMCs and serum IL-6.Results The expression of NOD2 mRNA and serum IL-6 from the COPD patients were higher than those of healthy control group(P<0.05). The expression of NOD2 mRNA and serum IL-6 of D group were higher than those of C group(P<0.05), the expression of NOD2 mRNA and serum IL-6 of C and D group were both higher than those of A and B group(P<0.05). There were no statistical significant differences in the expression of NOD2 mRNA and serum IL-6 between A and B group(P>0.05). The expression of NOD2 mRNA and serum IL-6 in COPD patients was positively correlated (r=0.81，P<0.05).Conclusions NOD2 mRNA in PBMCs and serum IL-6 participate the progression of airway inflammatory response of COPD and the levels show positive correlation with disease severity.

Chronic obstructive pulmonary disease; NOD2;Interleukin

四川省教育廳科研基金項(xiàng)目(No.13ZA0216)

陳紹平(1964-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，碩士，主要從事呼吸內(nèi)科臨床診治研究。

賈欽堯(1987-)，男，碩士，醫(yī)師，主要從事呼吸內(nèi)科臨床診治研究。

R563.3

A

1005-9202(2017)14-3529-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.067