傳導(dǎo)信號胞質(zhì)蛋白4在非小細(xì)胞肺癌患者中表達(dá)及與臨床生物學(xué)行為關(guān)系

彭國慶 劉文洲 冼 磊

(廣西科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院外三科，廣西 柳州 545006)

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傳導(dǎo)信號胞質(zhì)蛋白4在非小細(xì)胞肺癌患者中表達(dá)及與臨床生物學(xué)行為關(guān)系

彭國慶 劉文洲1冼 磊1

(廣西科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院外三科，廣西 柳州 545006)

目的 研究傳導(dǎo)信號胞質(zhì)蛋白(SMAD)4 在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中的表達(dá)，探討其與NSCLC臨床生物學(xué)關(guān)系。方法 采用逆轉(zhuǎn)錄(RT)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、熒光定量(FQ)-PCR和蛋白質(zhì)印跡法(Western印跡)檢測54例NSCLC組織及相應(yīng)癌旁組織和57例非腫瘤性肺組織中SMAD4 mRNA和蛋白的表達(dá)，分析其與NSCLC臨床生物行為關(guān)系。結(jié)果 RT-PCR和FQ-PCR結(jié)果顯示肺癌組織SMAD4 mRNA表達(dá)量均顯著低于癌旁組織及對照組(1.28±0.25比3.94±0.13比5.47±1.29，0.41±0.05比1.04±0.10比2.59±0.35，均P<0.01)；Western印跡結(jié)果顯示肺癌組織SMAD4 蛋白表達(dá)顯著低于癌旁組織及對照組(0.61±0.10比2.18±0.61比4.51±0.98，P<0.01)。RT-PCR和Western印跡結(jié)果提示肺癌組織SMAD4 mRNA和蛋白陽性表達(dá)率(13/54和12/54)顯著低于癌旁組織(32/54和34/54)及對照組(48/54和47/54)(均P<0.01)。肺癌SMAD4表達(dá)下調(diào)或缺失與腫瘤類型、病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床TNM分期有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 SMAD4的低表達(dá)或缺失與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

傳導(dǎo)信號胞質(zhì)蛋白(SMAD)4；臨床生物學(xué)行為；非小細(xì)胞肺癌

肺癌大部分起源于支氣管黏膜上皮，因此也稱為支氣管肺癌，在我國大部分地區(qū)的發(fā)病率和死亡率一直呈現(xiàn)上升趨勢〔1〕，而非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)作為肺癌最常見的病理類型，占肺癌的85%，5年生存率僅有15%〔2〕。傳導(dǎo)信號胞質(zhì)蛋白(SMAD)4是由Hahn等〔3〕發(fā)現(xiàn)的最新基因，該基因是定位于胰腺癌染色體18q21.1上的一種抑癌基因。抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CPG島發(fā)生高甲基化是基因失活的重要機(jī)制，而基因失活可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生〔4〕。研究顯示〔5〕，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β/SMAD通路能通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖從而抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，SMAD4基因表達(dá)產(chǎn)物SMAD4蛋白是TGF-β/SMAD信號傳導(dǎo)通路中的組成成分，SMAD4基因缺失或突變可引起腫瘤細(xì)胞逃避TGF-β對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用引起腫瘤發(fā)生。本研究通過對NSCLC組織、癌旁組織及正常組織中的SMAD4 mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，探討其與NSCLC臨床生物學(xué)行為特征關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年10月至2014年5月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸心外科手術(shù)切除肺癌標(biāo)本54例為實(shí)驗(yàn)組，病例均經(jīng)病理學(xué)檢查診斷為原發(fā)性NSCLC，相應(yīng)癌旁組織為距離癌組織>5 cm。平均年齡(60.5±13.8)歲；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟UICC2007年分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期9例，Ⅱ期14例，Ⅲ期27例，Ⅳ期4例。同時(shí)收集同期非腫瘤性肺炎性肺組織標(biāo)本57例為對照組，其中，男30例，女27例，平均年齡(42.7±10.2)歲。兩組性別和年齡均無顯著差異(P>0.05)。研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并于術(shù)前與患者溝通簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 總RNA提取試劑盒(TIANGEN公司，北京)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司，加拿大)，SMAD4引物：正義' 5-CCATCATAACAGCACTACCACCT-3'，反義5'-CTTCACCTTTACATTCCAACTGC-3'，404 bp；β-肌動(dòng)蛋白(actin)引物：正義5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，反義5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'，186 bp(日本TaKaRa公司合成)，熒光定量(FQ)試劑盒(TaKARa，日本)，SMAD4抗人單克隆抗體及二抗(Abcam公司)。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄(RT)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 按總RNA提取試劑盒提取肺癌組織、肺癌癌旁組織和對照組總RNA，再按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒一步法合成cDNA，參照試劑盒說明書進(jìn)行配液及反應(yīng)：模板1 μl，上下游引物(10 μmol/L)分別為1 μl，2×分裂酶(MasterMi)12.5 μl，重蒸水(ddH2O)9.5 μl，反應(yīng)體系為25 μl。擴(kuò)增參數(shù)：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。反應(yīng)完畢后取反應(yīng)液8 μl于2%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像分析系統(tǒng)上拍照并進(jìn)行定量分析。

1.4 FQ-PCR檢測 以合成cDNA為模板，按FQ試劑盒說明書進(jìn)行配液及反應(yīng)：20 μl反應(yīng)體系中熒光劑10 μl，引物上下游分別為0.8 μl，F(xiàn)Q-PCR參比染料(50×) 0.4 μl，cDNA模板2 μl，ddH2O 6 μl；擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃ 30 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)第3步結(jié)束后進(jìn)行熒光采集檢測，用ABI StepOne軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和按2-△△CT法進(jìn)行相對定量分析及表達(dá)等級評估。

1.5 蛋白質(zhì)印跡(Western印跡)檢測 用蛋白裂解液提取蛋白上清液后檢測蛋白濃度，與聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳(電壓濃縮膠80 V，分離膠120 V)，待電泳完成后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，時(shí)間為45～90 min，并將膜取出放入加吐溫的三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS-T)中洗1次(時(shí)間5 min)后封閉，室溫放置1 h，分別進(jìn)行一抗和二抗孵育，最后采用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色和電化學(xué)發(fā)光(ECL)曝光，并用Lab Works軟件進(jìn)行灰度分析。SMAD4相對表達(dá)量以目的基因密度單位/內(nèi)參密度單位表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 PCR中SMAD4在肺癌組織、癌旁組織和對照組中的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示SMAD4 mRNA在肺癌組織、癌旁組織及對照組中表達(dá)量分別為(1.28±0.25)、(3.94±0.13)和(5.47±1.29)，SMAD4 mRNA在肺癌組織中的表達(dá)量明顯低于癌旁組織及對照組(t=9.42、12.07,均P<0.01)，見圖1；FQ-PCR中SMAD4 mRNA在肺癌組織、癌旁組織及對照組中表達(dá)量分別為(0.41±0.05)、(1.04±0.10)和(2.59±0.35)，SMAD4在肺癌組織中的表達(dá)量明顯低于癌旁組織及對照組(t=7.36、10.71,均P<0.01)。

1：肺癌組織；2：癌旁組織；3：對照組；4：β-actin；5～10：6個(gè)病例圖1 肺癌組織、癌旁組織及對照組中SMAD4 mRNA的表達(dá)

2.2 Western印跡顯示SMAD4蛋白在肺癌組織、癌旁組織和對照組中的表達(dá) SMAD4蛋白在肺癌組織、癌旁組織及對照組中表達(dá)量分別為(0.61±0.10)、(2.18±0.61)、(4.51±0.98)，SMAD4蛋白在肺癌組織中的表達(dá)量明顯低于癌旁組織及對照組(t1=8.14，P<0.01；t2=11.27,P<0.01)，見圖2。

1、3：癌旁組織；2、4、6：肺癌組織；5：對照組圖2 肺癌組織、癌旁組織及對照組中SMAD4蛋白的表達(dá)(Western印跡)

2.3 SMAD4 mRNA和蛋白的表達(dá)與NSCLC患者臨床生物學(xué)行為的關(guān)系 SMAD4 mRNA和蛋白在NSCLC組織中的檢出率與腫瘤類型、病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床TNM分期有關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別無明顯相關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 SMAD4 mRNA及蛋白在NSCLC組織陽性表達(dá)與臨床生物學(xué)行為特征的關(guān)系〔n(%)〕

3 討 論

SMAD4是SMADs蛋白家族的重要成員之一，是TGF-β1/SMAD信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵組件，它與活化的受體調(diào)節(jié)型SMADs蛋白結(jié)合，形成低聚體復(fù)合物，并由胞質(zhì)移位至胞核，調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，當(dāng)SMAD4基因突變、缺失或表達(dá)靜止時(shí)，可影響TGF-β/SMAD4通路中信號的正常傳遞，最終導(dǎo)致正常細(xì)胞的過度增生和分化異常，進(jìn)而參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究〔4，6，7〕顯示，SMAD4在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、喉癌、乳腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌中均處于低表達(dá)或表達(dá)缺失，而在正常人體組織器官細(xì)胞中均有明顯表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，SMAD4 mRNA和蛋白在NSCLC癌組織中顯著低表達(dá)或表達(dá)缺失，而且在正常肺組織中SMAD4 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯高于在癌旁組織和肺癌組織，這與卞春安等〔8〕研究結(jié)果相似，說明SMAD4基因的突變、缺失或表達(dá)靜止與NSCLC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

作為TGF-β的經(jīng)典信號通路之一的SMAD通路是由TGF-β結(jié)合TGF-β受體Ⅱ和受體Ⅰ后，進(jìn)一步激活SMAD2與SMAD3使其磷酸化后，最后結(jié)合SMAD4形成聚合體，調(diào)控下游目的基因的表達(dá)來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)〔9〕。TGF-β信號通路有SMAD通路和非SMAD通路，而根據(jù)SMAD通路和非SMAD通路的激活狀態(tài)，TGF-β信號既是促癌因子，也是抑癌因子。TGF-β受體或者SMAD轉(zhuǎn)錄因子的突變失活便是腫瘤逃避TGF-β抑癌作用，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制?，F(xiàn)有研究表明SMAD4缺失在逆轉(zhuǎn)TGF-β由抑癌因子轉(zhuǎn)變?yōu)榇侔┮蜃拥倪^程中發(fā)揮重要作用〔10〕。既往研究〔11〕提示SMAD4是化療藥敏感性的重要指標(biāo)，且是影響癌癥預(yù)后的關(guān)鍵因素之一，本研究同樣顯示SMAD4低表達(dá)或表達(dá)缺失提示NSCLC惡性程度較高，其機(jī)制可能是SMAD4的低表達(dá)或表達(dá)缺失特異性阻斷了TGF-β的腫瘤抑制通路，使得TGF-β更有利的通過非SMAD通路結(jié)合其他促癌通路發(fā)揮促進(jìn)癌癥的發(fā)生及發(fā)展作用。本研究結(jié)果提示SMAD4可能和非浸潤性腫瘤向浸潤性腫瘤發(fā)展有關(guān)，其機(jī)制〔8〕可能是SMAD4的低表達(dá)或表達(dá)缺失特異性阻斷了TGF-β的腫瘤抑制通路，激活了TGF-β促癌因子的作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞過度繁殖，使腫瘤細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞膜的邊緣波動(dòng)和板狀偽足形成，最終使腫瘤細(xì)胞易于浸潤、遷移和轉(zhuǎn)移。

綜上，臨床對NSCLC患者進(jìn)行SMAD4檢測，對于NSCLC的診斷、綜合治療和預(yù)后具有一定的指導(dǎo)作用。

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〔2016-01-15修回〕

(編輯 苑云杰/王一涵)

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.0542078)

冼 磊(1973-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事胸部腫瘤治療。

彭國慶(1979-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事胸部腫瘤治療。

R655

A

1005-9202(2017)14-3494-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.051

1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科