大黃素在體外誘導人肝癌Hep3b細胞凋亡的作用及機制

倪 華 王 欽

(南通大學附屬醫(yī)院藥學部，江蘇 南通 226001)

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大黃素在體外誘導人肝癌Hep3b細胞凋亡的作用及機制

倪 華 王 欽

(南通大學附屬醫(yī)院藥學部，江蘇 南通 226001)

目的 了解大黃素在體外誘導人肝癌Hep3b細胞凋亡的作用及機制。方法 采用MTT法測定不同濃度大黃素對人肝癌Hep3b細胞的抑制作用，不加大黃素作為對照組；采用流式細胞儀檢測大黃素作用后的Hep3b細胞的增殖周期，計算細胞增殖指數(PI)；Western印跡法檢測Hep3b細胞凋亡相關蛋白AKT、Bcl-2、p-AKT和酶切caspase-3的相對表達量。結果 1、5、25、125 μmol/L大黃素作用24 h后的OD值均低于對照組(t=1.694、6.129、13.400、34.739，P均<0.05)；隨著大黃素濃度的升高，它對Hep3b細胞的抑制率呈上升趨勢；作用24 h時，大黃素對Hep3b細胞的半抑制濃度(IC50)為21.08 μmol/L。25、125 μmol/L大黃素作用24、36 h后，Hep3b細胞的G0/G1期比例增高(P<0.05)，S期比例、PI降低(P<0.05)，因而表現(xiàn)出濃度、時間依賴性。大黃素作用時間增加后，抑制細胞凋亡的Bcl-2(24 h：t=2.610；36 h：t=5.713)、p-AKT蛋白(12 h：t=2.075，24 h：t=5.157；36 h：t=12.926)的表達量呈下降趨勢(P均<0.05)，促進細胞凋亡的酶切caspase-3蛋白的表達量呈上升趨勢(6、12、24、36 h：t=2.487、3.327、5.276、8.137，P均<0.05)。結論 大黃素在體外通過誘導細胞凋亡而抑制人肝癌Hep3b細胞的增殖，大黃素是通過AKT信號途徑誘導Hep3b細胞凋亡。

大黃素；人肝癌Hep3b細胞；肝癌；抑制率；細胞凋亡

大黃是蓼科大黃屬植物，是祖國傳統(tǒng)中藥材，用于疾病的治療已有數千年歷史，具有清濕熱、攻積滯、涼血、瀉火、解毒、祛瘀之功效，其主要化學成分是大黃素、大黃酚、大黃酸、番瀉苷、大黃多糖等物質。其中大黃素是大黃最重要的活性成分，近年研究發(fā)現(xiàn)，大黃素具有一定的抗腫瘤活性，能明顯抑制多種惡性腫瘤細胞的增殖過程，如肺癌、宮頸癌、白血病、肝癌等〔1～4〕。目前肝癌的主要治療手段是化學治療，但部分化療藥物的毒副作用明顯，因而臨床應用受限〔5，6〕。近年來，由中草藥中提取有效抗腫瘤成分，并驗證其抗腫瘤活性已成為新的研究熱點，用此方法可開發(fā)新的高效低毒的抗肝癌藥物，有利于老年肝癌患者的治療。目前，已有大黃素對人肝癌細胞SMMC-7721和HepG2作用的相關研究報道〔7，8〕，但尚無大黃素對人肝癌Hep3b細胞生長的影響報道。因而本文探討大黃素對人肝癌Hep3b細胞增殖的影響，進一步證實大黃素的抗肝癌藥物活性。

1 材料和方法

1.1 細胞 人肝癌Hep3b細胞株，由蘇州大學藥學院提供，在含10%小牛血清、100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液中，含有5%CO2、37℃恒溫條件孵育24 h后傳代。

1.2 試劑與儀器 大黃素(純度>98%，西安豐足生物科技有限公司)；小牛血清(澳大利亞Selborne公司)；青霉素、鏈霉素(華北制藥有限公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)(美國Sigma-Aldrich公司)；β-actin、AKT、Bcl-2、p-AKT、酶切caspase-3抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗鼠IgG、HRP標記山羊抗兔IgG(美國Santa Cruz公司)。IX83型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；DNM-9606型酶標分析儀(北京普朗新技術有限公司)；Forma Steri-Cult型紅外CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；FACSCalibur型全自動流式細胞儀(美國BD公司)；Micro Chemi型凝膠成像系統(tǒng)(以色列DNR公司)。

1.3 方法

1.3.1 大黃素溶液的配制 將5.0 mg大黃素超聲溶解于1.0 ml的0.1%二甲基亞砜溶液(DMSO)中，再加入37.0 ml滅菌注射用水和0.25 ml 5 mol/L NaOH溶液，采用0.45 μm微孔濾膜過濾，制得濃度為500 μmol/L的大黃素標準溶液。實驗時采用滅菌注射用水稀釋至所需濃度即可。

1.3.2 大黃素對Hep3b細胞的抑制作用 將對數生長期Hep3b細胞稀釋至1.0×104個/ml，接種至96孔板中，37℃恒溫5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h。分別加入大黃素使成終濃度為1、5、25、125 μmol/L；對照組僅加入等量的培養(yǎng)基；另設置空白調零孔，不加細胞，僅加入培養(yǎng)基；每個藥物濃度、對照組、空白調零孔均設8個復孔，實驗重復3次。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在每孔中加15 μl 5.0 mg/ml標準濃度MTT，再培養(yǎng)3 h，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復洗滌細胞3次，在每孔中加100 μl DMSO并振蕩20 min，采用酶標儀檢測每孔在570 nm波長的吸光度(OD)值，計算抑制率(%)=〔1-(大黃素孔OD值-空白調零孔OD值)/(對照孔OD值-空白調零孔OD值)〕×100%。

1.3.3 Hep3b細胞周期 采用1、5、25、125 μmol/L大黃素作用并孵育12、24、36 h的細胞各1×105個，2 000 r/min離心8 min，棄去上清液，并采用PBS反復3次洗滌細胞，加4℃ 75%酒精溶液固定細胞并保持4℃ 12 h。2 000 r/min離心8 min得沉淀，加入PBS充分懸浮收集到的細胞，過400目篩網得濾液，2 000 r/min離心8 min得沉淀；再加適量RNaseA使成60 μg/ml溶液，37℃恒溫下培養(yǎng)45 min，然后加碘化丙啶得終濃度50 μg/ml的溶液，4℃恒溫下避光保存45 min。流式細胞儀測定Hep3b細胞的周期及其比例，并計算細胞增殖指數(PI)。

1.3.4 細胞凋亡相關蛋白的表達量 采用Western印跡進行檢測。采用培養(yǎng)基稀釋Hep3b細胞接種至6孔板內，細胞密度為1×105/孔，采用濃度為40 μmol/L的大黃素溶液處理Hep3b細胞0、6、12、24、36 h后回收細胞至離心管中，加入含苯甲基磺酰氟化物(PMSF)的細胞裂解液置冰袋上處理40 min，保持4℃溫度，12 000 r/min連續(xù)離心25 min，取上清液。采用SDS-PAGE電泳法將上清液中的蛋白進行分離，轉到硝酸纖維膜中，采用脫脂牛奶進行封閉，50 min后加入一抗(AKT、Bcl-2、p-AKT和酶切caspase-3)，保持4℃并緩慢振蕩10 h。采用TBST緩沖液洗滌硝酸纖維膜，再加入經辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG，振蕩60 min。再次用TBST緩沖液洗滌，采用增強化學發(fā)光法顯色，以β-actin作為內參基因。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS24.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 大黃素對Hep3b細胞抑制率的影響 濃度為1、5、25、125 μmol/L大黃素作用24 h后的OD值均明顯低于不加藥物的對照組(t=1.694、6.129、13.400、34.739，P均<0.05)；隨著大黃素濃度的升高，它對Hep3b細胞的抑制率呈上升趨勢；作用24 h時，大黃素對Hep3b細胞的半抑制濃度(IC50)為21.08 μmol/L，見表1。

2.2 各組Hep3b細胞的細胞周期與PI 與對照組比較，25、125 μmol/L大黃素作用24、36 h后，Hep3b細胞的S期比例、PI顯著降低(P均<0.05)，而G0/G1期比例明顯增高(P均<0.05)，因而表現(xiàn)出濃度、時間依賴性，見表2。

2.3 各組細胞凋亡相關蛋白的表達量 與對照組比較，大黃素作用時間增加后，抑制細胞凋亡的Bcl-2(24 h:t=2.610,36 h:t=5.713)、p-AKT蛋白(12 h:t=2.075,24 h:t=5.157,36 h:t=12.926)的表達量呈下降趨勢(P均<0.05)，促進細胞凋亡的酶切caspase-3蛋白的表達量呈上升趨勢(6 h：t=2.487，12 h:t=3.327,24 h:t=5.276,36 h:t=8.137，P均<0.05)，而AKT蛋白的表達量無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)。這表明大黃素通過AKT信號途徑發(fā)揮誘導Hep3b細胞凋亡的作用，見表3。

表1 大黃素對Hep3b細胞抑制率的影響

與對照級比較：1)P<0.05；與前一濃度大黃素組比較：2)P<0.05

表2 各組Hep3b細胞的細胞周期與

與對照級比較：1)P<0.05；與12 h比較：2)P<0.05

表3 各組細胞凋亡相關蛋白的表達量

與對照級比較：1)P<0.05

3 討 論

大黃素由傳統(tǒng)中藥大黃、何首烏中提取，具有抗病毒、抗腫瘤、免疫抑制、抗微生物生長、利尿、解痙、止咳等藥理作用〔9〕。文獻報道大黃素對多種惡性腫瘤細胞具有明顯的抑制與殺傷作用，如胃癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌細胞等，且抑制作用呈現(xiàn)一定的時間與劑量依賴性，但對人體正常細胞并沒有細胞毒作用〔10～13〕。治療肝癌的主要難點是癌細胞的增殖能力與抗凋亡能力明顯強于人體正常細胞，且一般的化療藥物對正常細胞也有細胞毒作用〔14〕。因此，中藥提取物大黃素與傳統(tǒng)化療藥物相比，具有高效低毒的優(yōu)點。

本研究結果表明，大黃素對Hep3b細胞的抑制作用是通過誘導細胞凋亡而體現(xiàn)出來的，這種誘導Hep3b細胞凋亡的作用同樣具有濃度和時間依賴性。

PI3K/AKT信號轉導通路在人肝癌細胞的增殖、分化及凋亡過程中均發(fā)揮著十分重要的作用〔15〕。PI3K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，它激活后會在質膜上產生第二信使PIP3；信號蛋白AKT位于細胞內，含有PH結構域；當PIP3、磷酸化依賴性蛋白(PDK)1、AKT結合后，能促使PDK1磷酸化AKT蛋白中的Ser 308氨基酸位點，從而AKT被激活；此外，PDK2還可磷酸化AKT蛋白中的Thr 473氨基酸位點而活化AKT蛋白。激活后的AKT蛋白又可以激活或抑制它的下游蛋白caspase-9、Bad、NF-κB等，實現(xiàn)調節(jié)肝癌細胞的生長、分化與凋亡過程。文獻研究報道，大黃素能抑制PDK/AKT 信號通路而下調AKT蛋白的活性，然而不會直接影響AKT蛋白激酶的作用〔16〕。本研究結果表明，大黃素作用時間增加后，抑制細胞凋亡的Bcl-2、p-AKT蛋白的表達量呈下降趨勢，促進細胞凋亡的酶切caspase-3蛋白的表達量呈上升趨勢。這是由于大黃素作用后，磷酸化的AKT蛋白能調控多種下游蛋白酶切caspase-3、Bcl-2等，誘導Hep3b細胞凋亡，從而表現(xiàn)出明顯的抗肝癌作用。

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〔2015-12-06修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

王 欽(1985-)，男，碩士，主管藥師，主要從事醫(yī)院制劑、藥物基因組學研究。

倪 華(1964-)，女，主管藥師，主要從事醫(yī)院藥學研究。

R285

A

1005-9202(2017)14-3434-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.023