褪黑素受體1A基因rs13140012位點T基因多態(tài)性增加特發(fā)性草酸鈣結(jié)石易感性風(fēng)險

陳立紅，郝 鵬，巢玉娣，邵秋陽，陳方進，章永堅，習(xí)海波

褪黑素受體1A基因rs13140012位點T基因多態(tài)性增加特發(fā)性草酸鈣結(jié)石易感性風(fēng)險

陳立紅1，郝 鵬2，巢玉娣1，邵秋陽1，陳方進1，章永堅1，習(xí)海波3

（1.都昌縣人民醫(yī)院泌尿外科，江西 九江 332600；2.武漢市普愛醫(yī)院泌尿外科，湖北 武漢 430032；3.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，江西 南昌 330006）

目的 研究褪黑素受體1A基因rs13140012位點A/T多態(tài)性與特發(fā)性草酸鈣結(jié)石的關(guān)系。方法 根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，在江西省漢族人群內(nèi)，進行相關(guān)試驗研究。采用RT-PCR技術(shù)監(jiān)測研究對象外周血中MTNR1A的基因多態(tài)性。結(jié)果 共納入260例研究對象，其中特發(fā)性草酸鈣結(jié)石（ICOS）患者115例和對照組145例。試驗組與對照組兩組基線可比：性別、年齡和體重指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。SNP rs13140012位點A等位基因頻率在ICOS組和健康對照組分別為：86%VS 95.2%。T等位基因頻率分別為14%VS 4.8%。ICOS和健康人群相比，SNP-A與SNP-T的基因頻率有顯著的差異（P＜0.001）。結(jié)論 MTNR1A基因rs13140012位點A/T與ICOS易感性存在相關(guān)性，T是特發(fā)性草酸鈣結(jié)石的危險因素。

尿石癥；特發(fā)性草酸鈣結(jié)石；褪黑素受體；單核苷酸多態(tài)性；易感性

特發(fā)性草酸鈣結(jié)石（Idiopathic calcium oxalate stones，ICOS）是多基因疾病，ICOS的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)，與多個基因存在相關(guān)性，并受到基因-基因之間和基因-環(huán)境的交互作用所影響[1-3]。目前研究發(fā)現(xiàn)褪黑素受體1A（MTNR1A）基因與多種疾病相關(guān)，在早期研究中發(fā)現(xiàn)，其可能影響著泌尿系結(jié)石的發(fā)生。本研究擬對MTNR1A基因rs13140012位點A/T多態(tài)性與ICOS易感性的關(guān)系進行探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 試驗通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理協(xié)會論證。（1）ICOS組：納入標(biāo)準(zhǔn)，①在本中心就診，完善相關(guān)檢查，臨床明確診斷為泌尿系結(jié)石，接受藥物排石或手術(shù)治療；②所取得的泌尿系結(jié)石標(biāo)本，采用結(jié)石紅外光譜分析系統(tǒng)進行結(jié)石成分分析，明確診斷為草酸鈣結(jié)石（一水草酸鈣或二水草酸鈣）；③研究對象知情同意并簽署相關(guān)知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)，①有家族遺傳性疾?。虎谔悄虿〖捌渌麅?nèi)分泌系統(tǒng)疾?。虎燮渌绊懨谀蛳到Y(jié)石慢性?。郝阅c道疾病、甲狀旁腺功能亢進、尿路梗阻等[4]。（2）健康對照組：納入標(biāo)準(zhǔn)，①健康體檢成人，年齡大約18周歲；②知情告知，簽知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①家族遺傳性疾?。虎谔悄虿〖捌渌麅?nèi)分泌系統(tǒng)疾?。虎燮渌绊懨谀蛳到Y(jié)石慢性?。喝缒虻滥[瘤、尿道梗阻、甲狀旁腺功能亢進癥、慢性結(jié)腸炎。最終共有260例研究對象納入研究，其中ICOS患者115例，健康對照人群145例。兩組人群性別、年齡及體重指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。見表1。

表1 試驗組與對照組年齡、性別和體重指數(shù)比較

1.2 方法

1.2.1 結(jié)石成分使用結(jié)石紅外光譜分析系統(tǒng)（天津藍莫德公司），經(jīng)手術(shù)或藥物排石后獲取結(jié)石標(biāo)本，取結(jié)石標(biāo)本的核心部分進行成分分析。

1.2.2 MTNR1A基因rs13140012位點A/T多態(tài)性分析 （1）血DNA提?。翰捎脗鹘y(tǒng)Chelex-100方法提取外周血DNA。檢測DNA濃度及OD260/280值；最終所有DNA標(biāo)本稀釋至20-50ng/μL，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

（2）PCR擴增：生工生物工程（上海）有限公司合成引物：

上游引物為：MTNR1A rs13140012-A(F)5'GCGGGCCTAAGTAAATCTACAGGA 3'

MTNR1A rs13140012-T(F) 5' GCGGGCAGGGCGGCCTAAGTAAATCTAC AGGT 3'

下游引物為：

MTNR1A rs13140012(R)5'AGGATTGCAGTGTGGGATTTCTA 3' SYBR Green PCR反應(yīng)體系：

體積（μL）10 1 0.25 0.25 0.25 6反應(yīng)條件：成分Just SYBR Premix DNA引物SNP-UP-A(5μM) SNP-UP-T(5μM) SNP-Low(5μM) DEPC-treated water 95℃10 min 35 95℃ 5 s 58℃ 15 s 72℃ 15 s預(yù)變性循環(huán)數(shù)變性退火延伸

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以“x±s”表示，進行獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測 目的基因擴增后，根據(jù)溶解曲線，確定基因分型：MTNR1A基因rs13140012位點A/T。見圖1、圖2。

2.2 MTNR1A基因rs13140012位點A/T多態(tài)性與結(jié)石易感性相關(guān)性分析 MTNR1A基因rs13140012位點A基因和T基因，在ICOS組與健康人群分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 ICOS與對照組中的A/T等位基因頻率

3 討論

泌尿系結(jié)石是最常見的泌尿外科疾病之一，嚴(yán)重的影響人類健康和生活質(zhì)量。世界范圍內(nèi)其發(fā)病率為2%～20%[5]。所有的泌尿系結(jié)石中，60%～80%為含草酸鈣的結(jié)石。臨床上，少數(shù)草酸鈣結(jié)石是由單基因遺傳引起的，還有一部分是繼發(fā)性結(jié)石（如胃腸道疾病引起），其余的絕大多數(shù)草酸鈣結(jié)石是ICOS[6]。目前大多數(shù)學(xué)者認為：ICOS是多基因遺傳疾病，其發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)與多個基因的SNP存在相關(guān)性，并且受到基因-基因之間、基因-環(huán)境之間得交互作用影響。目前已報道的與泌尿系結(jié)石發(fā)病相關(guān)的一些基因包括：如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）[7]、骨橋蛋白基因（OPN）[8]、尿激酶[3]等。這些SNP的發(fā)現(xiàn)為結(jié)石的形成機制研究提供了基因水平的證據(jù)。

褪黑素（MEL）是主要是由位于下丘腦的松果體分泌的吲哚胺類激素，具有重要生理功能的激素；有少部分MEL由視網(wǎng)膜分泌。目前，已經(jīng)在多個物種的多個組織中檢測到，并且能維持明顯的晝低夜高的節(jié)律變化。不僅可以提高機體免疫能力，也有報道認為MEL是一種高效的自由基清除劑和抗氧化劑，這些生理功能的發(fā)現(xiàn)，提示可能于泌尿系結(jié)石形成有關(guān)。在哺乳動物體內(nèi)體內(nèi)，MEL受體有兩型：α細胞中的MEL受體1A（MTNR1A）和β細胞中的MEL受體1B（MTNR1B）；MTNR1A的分布比MTNR1B更為廣泛，兩個受體介導(dǎo)了褪黑素不同生理活性。人類MTNR1A基因位于染色體4q53.1，有兩個外顯子，編碼350個氨基酸的蛋白。目前研究認為：褪黑素的主要生理學(xué)功能是由MTNR1A基因介導(dǎo)的[9-10]。

隨著MEL及MTNR相關(guān)作用機制的研究進展，其生理功能逐漸被學(xué)者所認識。MTNR1A基因的多態(tài)性和性狀關(guān)聯(lián)分析是目前研究的重點：目前研究認為MTNR1A基因的改變與某些先天性疾病的發(fā)生有關(guān)，或?qū)е潞筇煨约膊〉陌l(fā)生率增加，如：睡眠紊亂、精神分裂、多囊卵巢及糖尿病等[11-13]。與目前關(guān)于MTNR1A基因多態(tài)性與泌尿系結(jié)石相關(guān)性研究較少。本研究通過對江西省人群范圍內(nèi)，對比ICOS和健康人群中MTNR1A基因SNP rs13140012多態(tài)位點在等位基因頻率上的差異，探討MTNR1A基因與特發(fā)性草酸鈣結(jié)石的相關(guān)性，擬為ICOS的發(fā)生、發(fā)展及治療提供理論學(xué)依據(jù)。我們的目前研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ICOS組，rs13140012多態(tài)位點T基因攜帶者的患病風(fēng)險率明顯高于A基因，說明MTNR1A基因可能是特發(fā)性草酸鈣結(jié)石的易感基因，與ICOS的易感性存在相關(guān)性。Esposito Teresa[14]等與2012年也報道了想類似的研究結(jié)果。

由于客觀條件限制，本研究最終納入260例研究對象，能從一定程度上發(fā)現(xiàn)相關(guān)情況，但尚需在后續(xù)研究中進行更大范圍的人群普查，以擴大研究結(jié)論和增強驗證強度。另外，由于泌尿系結(jié)石初發(fā)和復(fù)發(fā)人群存在差異性，故基因可能存在部分差異，后期需進行分組研究，以提高論證依據(jù)，用于病因預(yù)防及治療。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MTNR1A基因rs13140012多態(tài)位點A/T多態(tài)性和特發(fā)性草酸鈣結(jié)石易感性的關(guān)系，在一定程度上為泌尿系結(jié)石的研究提供了基因水平的證據(jù)。隨著MEL和MTNR的不斷研究進展，必定會為草酸鈣結(jié)石的精準(zhǔn)治療提供了新的方向和治療靶點。但此次報道僅為我們的初步研究結(jié)果，進入臨床應(yīng)用尚需要我們的深入研究。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2017.22.034

2016年九江市科技局課題19號

習(xí)海波，E-mail：13870834578@163.com