不同灌溉方式下3種土壤微生物活性測定方法比較

李 文,葉旭紅,韓 冰,張西超,鄒洪濤,張玉龍

沈陽農業(yè)大學土地與環(huán)境學院,農業(yè)部東北耕地保育重點實驗室,土壤肥料資源高效利用國家工程實驗室, 沈陽 110866

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不同灌溉方式下3種土壤微生物活性測定方法比較

李 文,葉旭紅,韓 冰,張西超,鄒洪濤*,張玉龍

沈陽農業(yè)大學土地與環(huán)境學院,農業(yè)部東北耕地保育重點實驗室,土壤肥料資源高效利用國家工程實驗室, 沈陽 110866

探究不同灌溉方式下土壤微生物活性,對維持土壤穩(wěn)定和提高水資源利用效率具有重要意義。以沈陽農業(yè)大學長期定位灌溉試驗基地為平臺,采用土壤酶活性、土壤呼吸和微量熱法,研究節(jié)水灌溉組覆膜滴灌、滲灌及對照組溝灌下的土壤微生物活性并比較3種微生物活性測定方法。結果表明：不同灌溉方式下土壤脲酶、轉化酶、脫氫酶活性無顯著差異,土壤呼吸在3個主要生長季也沒有明顯變化規(guī)律；而微量熱法得到的熱功率時間曲線呈現(xiàn)了典型的微生物生長特征趨勢,覆膜滴灌的生長速率較大,且與溝灌的總熱量、最大熱功率相差不大。因此,從可持續(xù)農業(yè)觀點出發(fā),覆膜滴灌是保證土壤微生物活性較高的一種節(jié)水灌溉方式；微量熱法也為傳統(tǒng)方法下不易檢測的微生物活性提供了新思路。

灌溉；酶活性；土壤呼吸；微量熱

當前土壤微生物研究的重點是微生物群落結構與生態(tài)系統(tǒng)功能之間的聯(lián)系,而微生物活性正是整合兩者的紐帶[1]。因此,準確、快速地測定微生物活性對于評價土壤微生物新陳代謝能力具有重要作用。土壤微生物活性即微生物代謝活力,可以用多種方法測定。傳統(tǒng)測定土壤微生物活性的方法有土壤酶活性,土壤呼吸等,然而這些方法均存在一定的局限性。微量熱法已被證實是一種高度敏感的測定土壤微生物活性的方法,且微量熱法得到的熱動力學指標與土壤呼吸速率及其他傳統(tǒng)方法的結果存在一定的相關性[2]。因而微量熱法已成為一種有廣泛應用前景的微生物活性評價工具[2-3]。微量熱法不僅可以有效的確定生長速率,也可以快速的檢測到新陳代謝過程中的擾動,在環(huán)境科學、醫(yī)學等方面被廣泛應用[4-5]。

灌溉是旱地農業(yè)的主要田間管理措施,我國約有45%的農田是灌溉農田,灌溉面積已達到5.85×107hm2[6]。隨著可持續(xù)農業(yè)的發(fā)展,節(jié)水灌溉面積已達到2.90×107hm2[7]。然而傳統(tǒng)溝灌仍被廣泛使用,特別是在需水量大的設施蔬菜地。溝灌不僅造成了水資源的浪費,也出現(xiàn)了保護地土壤酸化等一系列土壤質量問題。覆膜滴灌、滲灌和噴灌等節(jié)水灌溉方式不僅可以解決這些土壤問題,還可以準確控制水量減少水分蒸發(fā)和深層滲漏,從而增加作物產(chǎn)量并防止土壤退化[8-9]。灌溉會改變土壤的水分條件,進而影響土壤微生物活動場所,對微生物的生長均有不同程度的影響。已有研究表明灌溉影響土壤的理化性質,進而影響土壤微生物活性[10],并指出在田間持水量下土壤微生物活性最高。目前對于不同灌溉方式下土壤微生物的活性研究較多,但由于方法不同,得出的結論不一致,陳全勝等[11]認為土壤水分在特定范圍內變化對土壤呼吸影響不顯著,侯樂等[12]認為過氧化氫酶、轉化酶、脲酶活性因灌水方法不同表現(xiàn)出差異。

因此,本研究采用微量熱、酶活性與土壤呼吸法來研究不同灌溉方式對土壤微生物活性的影響。首先,通過3種微生物活性測定方法比較,找到一個可靠精確的微生物活性測定方法。其次,研究覆膜滴灌,滲灌與溝灌下微生物活性變化趨勢,從理論上認識灌溉對微生物活性的影響,從而找到一種高效的節(jié)水灌溉方式,為節(jié)水灌溉方法推廣提供更加準確的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2015年4月到8月在沈陽農業(yè)大學長期定位灌溉試驗基地(41°49′N, 123°33′E, 海拔高度51.6 m)的溫室大棚進行。供試土壤為棕壤(Mollic Gleysols, FAO-UNESCO 系統(tǒng))[13],土壤的基本理化性質為pH 6.8,有機質含量12.58 g/kg,全氮含量1.47 g/kg,全鉀含量17.60 g/kg,全磷含量0.10 g/kg。供試作物為番茄(LycopersiconesculentumMill.,綠又福)。試驗設對照組溝灌(F)和試驗組覆膜滴灌(D)、滲灌(S)3個處理,3次重復,試驗小區(qū)隨機分布。各小區(qū)面積為20 m2,每個小區(qū)4條壟,小區(qū)間用深埋60 cm塑料膜隔開防止水分互滲。溝灌以壟溝為灌水溝,按常規(guī)方法灌水；滴灌管為市售,采用一管四的鋪設方式,即1根滴灌管下接4根滴灌帶,分別鋪于4條壟上,兩出水孔中心點距離30 cm,與植株相對；滲灌管為自主研制的節(jié)點式滲灌管,兩組出水孔間距30 cm,埋于地下30 cm。在各小區(qū)壟上埋設張力計,當?shù)叵?0 cm的張力計的土壤水吸力值到30 kPa時開始灌水,灌水上限為6 kPa。地下5 cm埋曲管地溫計,記錄地溫。

番茄定植于4月19日,澆定植水,并在1周后澆緩苗水,此后開始記錄不同灌溉處理下的灌水次數(shù)及灌水量。在番茄生長期,D、S、F分別灌水9次、13次、9次,灌水總量分別為662.6、647.4、1234.6 m3/hm2。滴灌的3個小區(qū)均鋪設60 cm寬的黑色防水的PE可降解薄膜以防止水分蒸發(fā)。

施肥處理：在土壤翻耕前撒施25.53 t/hm2腐熟的牛糞和37.5 t/hm2膨化的雞糞。定植時溝施0.6 t/hm2的磷酸二銨、硫酸鉀和0.15 t/hm2的尿素。于番茄穗果膨大期追施兩次尿素,各0.15 t/hm2。

1.2 樣品采集

2015年8月番茄收獲后采集根際土壤樣品,具體為每個小區(qū)用五點法隨機選擇5株番茄植株,挖取具有完整根系的土體,先輕輕抖落大塊的土壤,然后將根表面附著的土壤全部抖落于報紙上,五點土樣迅速混勻裝在聚乙烯塑料袋中,放入冰盒帶回實驗室[14-15]。將重復土壤樣品混合分3部分,一部分用于基本理化指標測定,一部分保存于4℃用于土壤微量熱測定,剩于土樣風干,分別過1 mm和2 mm篩測定酶活性。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 土壤基本理化性質測定

土壤含水量測定采用稱重法。土壤全氮、總有機碳采用元素分析儀(Elementer Ⅲ,德國)。有機質含量為總有機碳的1.724倍。土壤pH在水土比2.5∶1下用pH計測定。

1.3.2 土壤酶活性測定

1.3.3 土壤呼吸測定

采用靜態(tài)箱氣象色譜法測定番茄生長期內土壤呼吸。在番茄定植前,每個小區(qū)放置底座,規(guī)格為50 cm × 50 cm × 15 cm(長×寬×高),含3 cm高的凹槽用于密封。靜態(tài)箱規(guī)格是50 cm × 50 cm × 60 cm(長×寬×高)。內置風扇用于攪動箱內氣體確保氣體濃度均勻,溫度計測定箱內溫度。采樣時,向凹槽內注水,將靜態(tài)箱放于底座上密封,用50 mL針管抽取0、5、10、15、20 min氣體裝入集氣袋中,并記錄每一時刻的箱內溫度。土壤呼吸量測定在8:00到10:00 進行,在番茄生長的幼苗期、開化期和結果期并不在灌溉前后和施肥前后進行樣品采集。收集到的氣體樣品用氣相色譜儀(Agilent GC7890A)測定CO2含量。土壤呼吸CO2排放通量的計算公式：

1.3.4 土壤微生物代謝活性的測定

取1g土樣放入4mL滅菌的安瓿瓶中,加60μLLB(胰蛋白胨和酵母提取物2∶1)培養(yǎng)基密封,安瓿瓶放入TAMⅢ 微量熱儀(TAInstrument,USA)28 ℃培養(yǎng),3次重復。土壤微生物代謝活性以熱功率值被計算機實時監(jiān)控、記錄,待信號終止即停止試驗。根據(jù)熱功率時間曲線計算總熱量Qtotal,最大熱功率Pmax及達到最大熱功率的時間tmax,可通過熱力學動力方程[17-18]得到生長速率常數(shù)(k)。

lnPt=lnP0+ k(t-t0)

式中,t是對數(shù)期的某一時刻,P0是微生物進入對數(shù)期時的初始放熱功率,Pt是t時刻總放熱功率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Origin8.0和SPSS19.0 軟件進行單因素方差分析(One-wayANOVA),多重比較采用最小顯著差異法(LSD),顯著性水平設為0.05,結果以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 灌溉方式對土壤基本理化性質的影響

通過不同灌溉方式的處理,溝灌的土壤含水量顯著高于滲灌,但與覆膜滴灌無顯著差異,這是因為膜下滴灌能保證灌溉前后含水量空間分布相似[19]。3種不同灌溉方式下土壤pH相差不大。土壤全氮、總有機碳及有機質均無顯著性差異(表1),表明灌溉方式不同對土壤養(yǎng)分狀況沒有顯著影響。

表1 不同灌溉方式下土壤理化性質

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P< 0.05)

2.2 灌溉方式對土壤酶活性的影響

從表2可以看出,不同灌溉方式對土壤脲酶、轉化酶和脫氫酶活性均無顯著性影響,但總體呈現(xiàn)的趨勢是覆膜滴灌的轉化酶和脫氫酶均為最高,溝灌次之,滲灌最小。灌水量相對高的溝灌會提高脲酶的活性,灌水量小的滲灌會降低土壤轉化酶的活性。覆膜滴灌下土壤酶活性相對較高可能是由于地膜覆蓋,使得地溫保持在適宜的水平,從而增強了土壤酶的活性。

表2 不同灌溉方式下土壤酶活性

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P< 0.05)

2.3 灌溉方式對土壤呼吸速率的影響

圖1通過對番茄3個主要生長期CO2排放通量的變化趨勢來表示土壤的呼吸速率。在番茄幼苗期,溝灌的土壤CO2排放通量顯著高于覆膜滴灌,而滲灌與溝灌的排放通量無顯著性差異。開花期3種灌溉方式均無顯著性差異。結果期溝灌與滲灌有顯著性差異,與覆膜滴灌無顯著性差異。3個時期CO2排放通量的總趨勢是溝灌最高,覆膜滴灌、滲灌次之。

2.4 灌溉方式對土壤新陳代謝活性的影響

圖2描繪了一個典型的微生物生長特征曲線,展示了微生物的完整生長期。以對照組溝灌為例,停滯期(a和b),微生物適應新環(huán)境；對數(shù)生長期(b和c),微生物以穩(wěn)定的幾何數(shù)級增長；穩(wěn)定期(c和d),由于營養(yǎng)物質消耗殆盡,微生物總數(shù)處于平坦階段；衰亡期(d和e),微生物生長減慢,死亡數(shù)目增多；潛伏期(e和h),微生物恢復到自然活性狀態(tài)[20]。

計算獲得覆膜滴灌、滲灌和溝灌3種灌溉方式的總熱量Qtotal,最大熱功率Pmax及達到最大熱功率的時間tmax和生長速率常數(shù)k如表2所示。溝灌下最大熱功率、總熱量與覆膜滴灌相差不大,僅是達到最大熱功率的時間相差40 min。而溝灌與滲灌的最大熱功率、總熱功率相差較大。生長速率常數(shù)k值越大,表明微生物活性越高、生長越快。根據(jù)生長速率常數(shù)可知,滴灌下土壤微生物活性最高,而滲灌的土壤微生物活性最小。

圖1 不同灌溉方式對番茄3個主要生長期CO2排放通量的影響Fig.1 The effect of irrigation methods on CO2 emission flux during tomato main growth period D：覆膜滴灌 drip irrigation；S：滲灌 subsurface drip irrigation；F：溝灌 furrow irrigation；不同小寫字母表示同一時期不同處理間差異顯著(P<0.05)

圖2 不同灌溉方式下土壤微生物活性的熱功率時間曲線Fig.2 Thermal power time curve of soil microbial under different irrigation methodsa和b代表微生物生長特征曲線的停滯期；b和c代表對數(shù)期；c和d代表穩(wěn)定期；d和e代表衰亡期；e和h代表潛伏期

處理Treatment總熱量/(J/g)Totalheatdissipation(Qtotal)峰值功率/μWthemaximumthermalpowerpeak(Pmax)峰值功率時間/minthetimetoreachthemaximumofthepeak(tmax)生長速率常數(shù)/minGrowthrateconstant(k)覆膜滴灌Dripirrigation15.45844.614600.006926滲灌Subsurfacedripirrigation14.86720.344700.005854溝灌Furrowirrigation15.52848.364200.006595

3 討論

3.1 不同灌溉方式下3種微生物活性測定方法的比較

本研究中3種灌溉方式對脲酶、轉化酶和脫氫酶沒有顯著影響,無法判斷出灌溉方式對微生物活性的影響。同時有研究發(fā)現(xiàn),植物根系能夠分泌釋放一些酶到根際土壤中,而目前很難將植物根系提供的酶和微生物提供的酶區(qū)分開[21]。此外,土壤樣品的預處理和貯藏也是影響土壤酶活性的重要因素[22]。因此僅從單一酶類來反映土壤微生物活性變化存在一些局限性和片面性,無法客觀、全面的反映灌溉方式對土壤微生物活性的影響。

有研究表明,土壤含水量在田間持水量和萎蔫系數(shù)之間時,對土壤呼吸沒有顯著影響[23]。而3種灌溉方式下的土壤含水量始終保持在田間持水量,因此土壤呼吸的變化波動也較小。本研究中溝灌在幼苗期CO2的排放通量顯著高于滴灌,結果期的CO2的排通量均顯著高于滲灌,而在開花期灌溉方式無顯著性差異。無論是滴灌還是溝灌對土壤呼吸排放CO2差異不顯著?？赡苁怯捎谠O施蔬菜地的溫度較高,復雜的溫度因素掩蓋了土壤水分對土壤CO2排放的影響[24]。此外,不同灌溉方式使水的運移和土壤結構有所不同,從而導致土壤的通氣狀況不同。因此,很難從番茄生長期的土壤呼吸來判斷土壤微生物活性。同時由于土壤呼吸包括根系呼吸、微生物呼吸和土壤中C、N的礦化,僅從土壤呼吸來判斷土壤微生物活性存在一些不確定性,要準確測定土壤微生物呼吸必須消除植物根系呼吸和土壤動物呼吸的影響[23]。此外,休眠狀態(tài)中的微生物所占比重較高,而對呼吸起很大作用的活性微生物僅是比例很小的部分[25]。同時,Friedel[26]認為灌溉比降雨農業(yè)提供了更加恒定的土壤水含量,灌溉土壤中的微生物活性一般來說會加強,但是土壤的基礎呼吸和脫氫酶活性波動沒有一個固定的形式。

在土壤生態(tài)系統(tǒng)中,外加LB培養(yǎng)基可以刺激土壤微生物生長,分解更多營養(yǎng)物質,產(chǎn)生較多代謝熱量。微量熱儀記錄這些代謝過程的熱功率隨時間而變化的數(shù)據(jù),從而得到微生物生長的最大熱功率(Pmax)、達到最大熱功率的時間(tmax)和整個代謝過程中的總熱(Qtotal),并可根據(jù)熱力學動力方程線性擬合得到微生物的生長速率常數(shù)k,這些參數(shù)可以準確的表征微生物活性大小。此外,由于不同灌溉方式對微生物活性影響較低,需要用非常靈敏的測試手段才能精確的檢測土壤微生物的活性變化。微量熱高精度、高靈敏的測試方法使其成為檢測微生物活性的一種有效方法。有研究發(fā)現(xiàn),微量熱法和土壤呼吸強度、微生物數(shù)量及土壤酶活性有很高的相關性[27]。Critter[28]已經(jīng)證實微量熱和土壤呼吸值達到0.91的顯著相關性。Pmax分別與脲酶、脫氫酶達到0.871、0.951的顯著相關性,k與所有的酶活性都達到顯著相關[17]。這些結果均表明,微量熱法從熱動力學觀點研究微生物活性有一定優(yōu)勢[29],可以準確的測定土壤微生物活性(表4)。

表4 微量熱法與常用傳統(tǒng)方法比較

**表示在P< 0.01達到極顯著相關

3.2 不同灌溉方式對土壤微生物活性的影響

研究表明,Pmax和tmax的大小可以用于表示土壤微生物活性[31-32]。由微量熱法結果可知,覆膜滴灌和溝灌最大熱功率較為相似,說明兩者的微生物活性基本相同。而覆膜滴灌的灌水量僅為溝灌的1/2,從用水量上考慮,覆膜滴灌是一種既可以保證微生物活性處于較高水平,也可以實現(xiàn)節(jié)水灌溉的可持續(xù)灌溉方式。滲灌的熱動力學指標均不高,這可能是由于滲灌管位于地下30 cm處,而番茄根系大部分位于0—20 cm處,番茄根系不能完全吸收利用滲灌灌溉水。因此,滲灌技術有待于進一步提高。

4 結論

在農田生態(tài)系統(tǒng)中,土壤微生物在養(yǎng)分循環(huán)與能量流動中具有重要作用。灌溉方式的不同帶來的土壤水分含量及其分布的變化勢必會影響土壤微生物活性,但由于本研究中不同灌溉方式土壤含水量變化較小,僅用傳統(tǒng)的微生物活性測定方法無法判斷灌溉方式對土壤微生物活性的影響。因此根據(jù)土壤熱動力學指標,覆膜滴灌與溝灌處理下土壤微生物活性相差不大,而滲灌土壤的微生物活性最低,表明覆膜滴灌更適合于設施蔬菜地灌溉,而滲灌技術需要進一步改進。同時,不同方法的應用表明微量熱是測定土壤微生物活性簡單快速準確的方法。

致謝：南京土壤研究所土壤生物與生化研究室林先貴研究員、馮有智副研究員對本試驗給予指導和幫助,特此致謝。

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Comparison of three methods used to determine soil microbial activity under different irrigation systems

LI Wen,YE Xuhong,HAN Bing,ZHANG Xichao, ZOU Hongtao*,ZHANG Yulong

CollegeofLandandEnvironmentShenyangAgriculturalUniversity,Northeastkeylaboratoryofconservationandimprovementofcultivatedland,Ministryofagriculture,Nationalengineeringlaboratoryforefficientutilizationofsoilandfertilizerresources,Shenyang110866,China

Irrigation is a main agricultural management measure in arid regions. The area of irrigated farmland has reached 58.5 million hectares in China, and the area of water-saving irrigation has reached 29.0 million hectares with the development of sustainable agriculture. However, furrow irrigation is still widely used, especially in vegetable fields, which require multiple water sources. This results in the waste of water and issues relating to soil quality. Recent studies have demonstrated that irrigation can change the soil moisture conditions, and thus affect soil microbial activity. Soil microbial activity, a significant assessment index for soil quality, links the microbial community structure with ecosystem function. Therefore, determining microbial activity, both accurately and quickly, is important for the evaluation of soil microbial metabolism. Several approaches have been utilized to analyze soil microorganism activity in many studies. Soil enzyme activity and soil respiration are widely used; however, the results might lack accuracy due to certain limitations. Therefore, the objective of this study was to analyze the effects of different irrigation methods on soil microbial activity, which was assessed by soil enzyme activity, soil respiration, and microcalorimetric methods, based on a long-term irrigation experiment in Shenyang Agriculture University. Three irrigation methods were investigated, including drip irrigation (D), subsurface drip irrigation (S), and furrow irrigation (F) as a control. The results showed there was no significant difference in soil enzyme activity or soil respiration under different irrigation systems. Compared with conventional methods, the microcalorimetric method provided more useful information on changes in the soil microbial activity. The microcalorimetric method produced a power-time curve, which was a typical microbial growth curve. Based on the soil thermal dynamic index, changes in total heat, maximum thermal power, and growth rate under drip irrigation and furrow irrigation were negligible. No difference in microbial activity was observed between drip irrigation and furrow irrigation; however, activity was the lowest with subsurface drip irrigation. Therefore, drip irrigation with plastic was the method of water-saving irrigation most suitable for maintaining higher microbial activity in sustainable agriculture. Thus, the technology of subsurface drip irrigation should be further improved. Furthermore, the microcalorimetric method represents a novel way of detecting microbial activity, which was difficult to detect using traditional methods. As a consequence, the use of traditional methods to determinate soil microbial activity is limited, and the microcalorimetric method is highly sensitive for the determination of soil microorganism activity.

irrigation; enzyme activity; soil respiration; microcalorimetry

國家自然科學基金(31572206)；遼寧省農業(yè)科技創(chuàng)新團隊項目；遼寧省農業(yè)領域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃項目(2015051)；農業(yè)部產(chǎn)地環(huán)境質量重點實驗室開放課題資助

2016- 06- 02;

2017- 02- 16

10.5846/stxb201606021062

*通訊作者Corresponding author.E-mail: zouhongtao2001@163.com

李文,葉旭紅,韓冰,張西超,鄒洪濤,張玉龍.不同灌溉方式下3種土壤微生物活性測定方法比較.生態(tài)學報,2017,37(12):4084- 4090.

Li W,Ye X H,Han B,Zhang X C, Zou H T,Zhang Y L.Comparison of three methods used to determine soil microbial activity under different irrigation systems.Acta Ecologica Sinica,2017,37(12):4084- 4090.