天麻素對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β、TNF-α及IL-10的影響

夏烈新，陳立銘，彭曉艷，冉文

·論著·

天麻素對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β、TNF-α及IL-10的影響

夏烈新，陳立銘，彭曉艷，冉文

目的 探討IL-1β、TNF-α及IL-10在癲癇發(fā)病中的作用以及天麻素對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β、TNF-α及IL-10水平的影響。方法 將45只成年雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組(NC組)15只、癲癇組(EP組)15只和天麻素組(GE組)15只。EP組和GE組每日1次經(jīng)腹腔注射閾下劑量的戊四氮建立大鼠癲癇模型，然后給予GE組大鼠腹腔注射天麻素，觀察兩組大鼠的行為學變化。應(yīng)用免疫組織化學的方法檢測大鼠海馬IL-1β、TNF-α及IL-10水平的變化并進行比較。結(jié)果 GE組的發(fā)作潛伏期較EP組明顯延長，且發(fā)作持續(xù)時間縮短、發(fā)作強度降低(P<0.05)。EP組與NC組比較，大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β、TNF-α水平明顯上調(diào)(P<0.01)，而IL-10水平明顯降低(P<0.01)。GE組與EP組比較，大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β、TNF-α水平明顯降低(P<0.01)，而IL-10水平明顯升高(P<0.01)。結(jié)論 IL-1β、TNF-α可促進癲癇的發(fā)生與發(fā)展，而IL-10有抗癲癇作用；天麻素可通過降低IL-1β、TNF-α水平并升高IL-10而發(fā)揮抗癲癇作用。

癲癇; 天麻素; IL-1β;TNF-α；IL-10

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病之一，其特點是臨床癥狀復(fù)雜多樣，病程長且反復(fù)發(fā)作。抗癲癇治療的目標是控制癲癇發(fā)作，減少致殘率并提高患者生活質(zhì)量。目前，癲癇的治療主要以藥物，主要以西藥為主。天麻素(對羥基苯甲醇-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)[1]為傳統(tǒng)名貴中藥天麻的主要藥物活性成分，已有大量報道[1]證實了其具有的抗癲癇作用。但其具體抗機制目前還不明確。細胞因子不僅是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，同時也在CNS中起到神經(jīng)調(diào)節(jié)的作用。本研究通過戊四氮點燃大鼠模型模擬人類癲癇模型，經(jīng)點燃大鼠腹腔內(nèi)注射天麻素，觀察其對癲癇發(fā)作潛伏期、發(fā)作持續(xù)時間的影響；并采用免疫組化的方法觀察癲癇大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β、TNF-α及IL-10水平的變化以及天麻素對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元TNF-α、IL-1β及IL-10水平的影響，分析天麻素抗癲癇的免疫機制，為天麻素預(yù)防和治療癲癇提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和分組 將45只健康成年雄性Wistar大鼠(湖北中醫(yī)藥高等?？茖W校實驗動物中心提供，體質(zhì)量180～230 g)，隨機分為3組：正常對照組(NC組)、癲癇組(EP組)和天麻素組(GE組)，每組15只。均在安靜、清潔、12 h光照/黑暗的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑和材料 戊四氮粉劑(Sigma公司)，天麻素注射液(昆明制藥廠), 輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn))，兔抗大鼠IL-1β、TNF-α及IL-10抗體(科瑞生物制品有限公司)，AH-2型Olympus光學顯微鏡及光學顯微照像系統(tǒng)(日本Olympus光學工業(yè)株式會社)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 (1)GE組15只，均在每日上午8:00～10:00經(jīng)腹腔注射閾下劑量的戊四氮(35 mg/kg[2])，并觀察行為學變化。行為學判斷按Racine方法[3]分級標準：Ⅰ級：濕狗樣顫動，面肌抽動、咀嚼；Ⅱ級：節(jié)律性點頭；Ⅲ級：前肢陣攣；Ⅳ級：站立伴前肢陣攣；Ⅴ級：失平衡、傾倒、四肢抽動、全身陣攣。若連續(xù)3次出現(xiàn)Ⅳ級以上發(fā)作，即達到點燃標準，以后每3～4 d注射1次戊四氮(劑量同上)，以維持點燃效應(yīng)。全部大鼠點燃(28 d)后24 h，均經(jīng)腹腔注射天麻素(200 mg/kg )，注射天麻素2 h后，再經(jīng)腹腔注射戊四氮(35 mg/kg)誘發(fā)癲癇發(fā)作，觀察并記錄大鼠行為學變化，連續(xù)觀察l h左右。以后每天注射并觀察共7 d。(2)EP組：EP組15只，模型制造方法、點燃標準以及維持點燃效應(yīng)方法與GE相同。大鼠全部點燃(28 d) 后24 h，均腹腔注入同天麻素相同體積的生理鹽水，注射生理鹽水2 h后，再經(jīng)腹腔注射戊四氮(同上述劑量)誘發(fā)癲痛發(fā)作，并觀察行為學變化，連續(xù)觀察1 h左右。連續(xù)注射并觀察共7 d。(3)NC組：NC組每日上午8:00～10:00經(jīng)腹腔注入與戊四氮相同體積的生理鹽水，排除疼痛刺激對大鼠造成的影響。

1.2.2 標本的制作 3組大鼠在GE組連續(xù)應(yīng)用天麻素并觀察7 d，待最后一次癲癇發(fā)作停止后，均經(jīng)腹腔注射10%的水合氯醛(0.3 g/kg)進行麻醉，統(tǒng)一行心臟灌注、固定及取材。取含整個海馬結(jié)構(gòu)的組織修塊，將修塊后的腦組織塊放入4%多聚甲醛磷酸二鈉/氫氧化納緩沖液中，置于4℃冰箱中過夜。將修塊后的腦組織取出，放入20%蔗糖中，常溫下放置12 h。將腦組織用石蠟包埋后，用冷冰凍切片機切片，片厚約4 μm。每只動物取12張腦片，且每張切片的斷面水平在每只大鼠中均相似。

1.2.3 免疫組織化學方法(S-P法) 免疫組化染色采用S-P法(DAB免疫組化染色試劑盒購于北京中山生物制品工程有限公司)行免疫組化染色。

1.2.4 圖象分析和數(shù)據(jù)處理 每只大鼠均取12張腦片，4張切片用于神經(jīng)元IL-1β的檢測，4張切片用于神經(jīng)元TNF-α的檢測，4張切片用于神經(jīng)元IL-10的檢測。每張切片的每個區(qū)域隨機選擇3個高倍視野(×200)進行測定，取其平均值作為最終結(jié)果，進行統(tǒng)計學分析。應(yīng)用PIPS-2011彩色病理圖文分析管理系統(tǒng)進行圖像分析。首先分析海馬內(nèi)含IL-1β、TNF-α、IL-10神經(jīng)元的平均陽性細胞記數(shù)，然后對所選腦區(qū)進行陽性反應(yīng)細胞平均光密度測定(待測物質(zhì)顏色越深，表明其在細胞中表達的量越高；反之，顏色越淺，表明其在細胞中表達的量越低)。

2 結(jié) 果

2.1 各組行為學變化的比較 見表1。NC組均無癲癇發(fā)作。EP組和GE組大鼠在注射閾下劑量戊四氮后第6 d開始出現(xiàn)反應(yīng)，點燃時間為21～28 d，平均24 d。行為學的判斷標準參考Racine方法[3]分級標準。點燃后，EP組每次腹腔注射戊四氮后所有大鼠均出現(xiàn)Ⅴ級發(fā)作，平均潛伏期為(152.46±43.54)s，平均持續(xù)時間為(2796.40±601.15)s；GE組注射戊四氮后有3只大鼠出現(xiàn)Ⅴ級發(fā)作，3只大鼠出現(xiàn)Ⅳ級發(fā)作，其余均為Ⅲ級發(fā)作，平均潛伏期為(249.58±78.64)s，平均持續(xù)時間為(2063.70±679.28)s。GE組的發(fā)作潛伏期較EP組明顯延長，且發(fā)作持續(xù)時間縮短、發(fā)作強度降低(均P<0.05)。

表1 EP組和GE組大鼠平均潛伏期和平均持續(xù)時間的比較(n=15，x±s，s)組別平均潛伏期(s)平均持續(xù)時間(s)EP組152．46±43．542796．40±601．15GE組249．58±78．64?2063．70±679．28? 注：與EP組比較?P<005

2.2 各組間海馬IL-1β平均陽性細胞記數(shù)和胞體平均光密度值的比較 見表2、圖1～圖3。免疫反應(yīng)的強弱用平均光密度值表示，顏色越深則數(shù)值越大。EP組明顯高于NC組(P<0.01)；GE組明顯低于EP組(P<0.01)，明顯高于NC組(P<0.01)。

圖1 NC組海馬IL-1β神經(jīng)元陽性細胞數(shù)和光密度，DAB顯色為棕黃色(×200) 圖2 EP組海馬IL-1β神經(jīng)元陽性細胞數(shù)和光密度，DAB顯色為棕黃色(×200) 圖3 GE組海馬IL-1β神經(jīng)元陽性細胞數(shù)和光密度，DAB顯色為棕黃色(×200)

2.3 各組間海馬TNF-α平均陽性細胞記數(shù)和胞體平均光密度值的比較 見表3、圖4～6。 免疫反應(yīng)的強弱用平均光密度值表示，顏色越深則數(shù)值越大。EP組明顯高于NC組(P<0.01)；GE組明顯低于EP組(P<0.01)，明顯高于NC組(P<0.01)，具有統(tǒng)計學意義。

表3 海馬神經(jīng)元TNF?α陽性細胞數(shù)和平均光密度比較(n=15，x±s)組別陽性細胞數(shù)平均光密度NC組92．43±21．420．265±0．017EP組164．76±34．17#0．489±0．028#GE組127．65±27．62#?0．392±0．021#? 注：與NC組比較#P<001；與EP組比較?P<001

2.4 各組間海馬IL-10平均陽性細胞記數(shù)和胞體平均光密度值 見表4、圖7～9。免疫反應(yīng)的強弱用平均光密度值表示，顏色越深則數(shù)值越大。EP組明顯低于NC組(P<0.01)，GE組明顯高于戊四氮組(P<0.01)，明顯高于NC組(P<0.01) 。

圖4 NC組海馬TNF-α神經(jīng)元陽性細胞數(shù)和光密度，DAB顯色為棕黃色(×200) 圖5 EP組海馬TNF-α神經(jīng)元陽性細胞數(shù)和光密度，DAB顯色為棕黃色(×200) 圖6 GE組海馬TNF-α神經(jīng)元陽性細胞數(shù)和光密度，DAB顯色為棕黃色(×200)

表4 海馬神經(jīng)元IL?10陽性細胞數(shù)和平均光密度比較(n=15，x±s)組別陽性細胞數(shù)平均光密度NC組98．34±21．390．367±0．019EP組86．37±15．91#0．217±0．013#GE組136．63±32．48#?0．512±0．028#? 注：與NC組相比#P<001；與EP組相比?，P<001

圖7 NC組海馬IL-10神經(jīng)元陽性細胞數(shù)和光密度，DAB顯色為棕黃色(×200) 圖8 EP組海馬IL-10神經(jīng)元陽性細胞數(shù)和光密度，DAB顯色為棕黃色(×200) 圖9 GE組海馬IL-10神經(jīng)元陽性細胞數(shù)和光密度，DAB顯色為棕黃色(×200)

3 討 論

神經(jīng)元異常放電是癲癇的病變基礎(chǔ)，神經(jīng)元異常放電的同步和擴散導(dǎo)致癲癇的發(fā)生、發(fā)展。近年來研究[4]發(fā)現(xiàn)，癲癇的發(fā)病機制與機體的神經(jīng)免疫系統(tǒng)功能紊亂有密切關(guān)系。細胞因子是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，癲癇的發(fā)生發(fā)展與細胞因子關(guān)系密切。

許多動物研究[5-6]表明，IL-1β與TNF-α具有誘發(fā)抽搐的作用，而IL-10的抗驚厥作用。關(guān)于IL-1β誘發(fā)癲癇的機制，在于其不僅能通過增加一氧化氮的產(chǎn)生來提高癲癇敏感性，并能通過激活N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體或使NMDA受體表達水平增加而增強NMDA受體功能，IL-1β還能通過抑制GABA受體、抑制細胞內(nèi)K+外流而增強神經(jīng)細胞興奮性。IL-1β的致癇作用也依賴于海馬中神經(jīng)磷脂酶和Src激酶的活化，其能導(dǎo)致NMDA受體的NR2B亞基的磷酸化，從而引起神經(jīng)元的過度興奮[7]。升高的IL-1β可能通過激活膠質(zhì)細胞釋放其他細胞因子，促進黏附分子的表達并參與炎癥反應(yīng)，促進癲癇的發(fā)生發(fā)展[8]。TNF-α表達增加可通過促進NMDA受體的激活，介導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)鈣升高，使神經(jīng)元興奮性提高[9]。TNF-α還可能通過對GABA能(GABAA)受體的內(nèi)吞作用，是突觸表面GABAA受體減少，使突觸興奮性增強。TNF-α可通過抑制膠質(zhì)細胞內(nèi)谷氨酰胺合成酶的活性，使谷氨酸的表達增加、活性增強。通過與P55受體的相互作用，TNF改變了突觸α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)受體的分子化學計量，并增加興奮性突觸的活動[10]。TNF-α能通過減弱神經(jīng)細胞抑制性突觸后電位并興奮海馬CA3錐體細胞而導(dǎo)致致異常癇樣放電。IL-10是一種在CNS受損傷時起重要抗炎作用的細胞因子，具有一定的抗氧化酶、抗自由基的作用。IL-10能通過抑制神經(jīng)細胞Ca2+內(nèi)流、減少大腦皮質(zhì)興奮性氨基酸特異性受體的表達并使神經(jīng)細胞GABA的表達增加等途徑而發(fā)揮抗癲癇作用[11-12]。IL-10能抑制神經(jīng)細胞的過度興奮，降低谷氨酸的興奮性神經(jīng)毒性并能抑制神經(jīng)細胞死亡，具有很強的神經(jīng)保護作用[13]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，EP組大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β、TNF-α的陽性細胞數(shù)和光密度較NC組明顯增加，而EP組大鼠海馬神經(jīng)元IL-10的陽性細胞數(shù)和光密度較NC組降低。應(yīng)用天麻素后，GE組大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β、TNF-α的陽性細胞數(shù)和光密度較EP組明顯下降，而GE組大鼠海馬神經(jīng)元IL-10的陽性細胞數(shù)和光密度較EP組明顯升高。這說明海馬神經(jīng)元內(nèi)IL-1β、TNF-α可促進癲癇的發(fā)生與發(fā)展，而IL-10具有抗癲癇作用。GE組與EP組比較，點燃大鼠在應(yīng)用天麻素后再給予戊四氮刺激時，GE組大鼠癲癇發(fā)作的強度明顯減弱、發(fā)作的潛伏期明顯延長且發(fā)作持續(xù)時間明顯縮短，兩組比較具有明顯的統(tǒng)計學意義。這說明天麻素可能通過抑制海馬神經(jīng)元IL-1β、TNF-α的表達，促進IL-10的表達而影響了神經(jīng)元電生理活動，抑制了神經(jīng)元異常放電的產(chǎn)生、擴散和傳導(dǎo)。天麻素可能通過影響大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)細胞因子的表達在一定程度上影響神經(jīng)元的興奮性，起到了一定的抑制癲癇發(fā)生發(fā)展的作用。

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Effect of gastrodin on IL-1β,TNF-α and IL-10 in hippocampus neurons from epileptic rats

XIALie-xin,CHENLi-min,PENGXiao-yan,etal.

DepartmentofNeurology,thePeople’sFirstAffiliatedHospitalofYangtzeUniversity,Jingzhou434000,China

Objective To explore the possible role of IL-1β,TNF-α and IL-10 in the pathogenesis of epilepsy, and investigate the effect of gastrodin on IL-1β,TNF-α and IL-10 in hippocampus neurons from epileptic rats.Methods Forty-five adult male Wistar rats were randomly divided into normal control group (NC group), the epilepsy group (EP group) and gastrodin group (GE group).EP group and the GE group injection subthreshold doses of Pentylenetetrazol by intraperitoneal once a day,until them reache the ignited standards. GE group injection gastrodin by intraperitoneal. Observed and recorded the changes of rats’s behavior. IL-1β，TNF-α and IL-10 levels change in hippocampal neurons were detected and compared by immunohistochemistry. Results Compared gastrodin group with epilepsy group the incubation period of onset was significantly prolonged, the duration is shorter、attack strength is lower (P<0.05).Compared with normal control group, IL-1β,TNF-α levels in hippocampal neurons of epilepsy group significantly increased(P<0.01), and IL-10 levels decreased significantly(P<0.01).Compared with epilepsy group,IL-1β,TNF-α levels in hippocampal neurons of gastrodin group decreased significantly (P<0.01),and IL-10 levels increased significantly (P<0.01).Conclusions IL-1β、TNF-α can promote the occurrence and development of epilepsy, antiepileptic and IL-10 has the effect of antiepileptic. The gastrodin play an antiepileptic effect by lower IL-1β,TNF-α and increased IL-10 levels.

epilepsy;gastrodin;IL-1β;TNF-α;IL-10

434000 長江大學醫(yī)學院附屬荊州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

R742.1

A

1004-1648(2017)03-0209-04

2016-02-27

2016-03-29)