黑楊應(yīng)答楊生褐盤二孢?；颓秩镜幕虿町惐磉_(dá)

王凱英,高 茜,孫曉明,張琰鋒,嚴(yán)東輝,2

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所 北京 100091; 2.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 江蘇 南京 210037; 3. 北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 北京 100083)

黑楊應(yīng)答楊生褐盤二孢?；颓秩镜幕虿町惐磉_(dá)

王凱英1,高 茜1,孫曉明1,張琰鋒3,嚴(yán)東輝1,2

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所 北京 100091; 2.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 江蘇 南京 210037; 3. 北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 北京 100083)

[目的]楊生褐盤二孢的單芽管?；秃投嘌抗軐；头謩e引起白楊組和黑楊組(包括青楊組)楊樹的褐斑病，其分化機(jī)制有待闡明。[方法]本文在?；曰プ黧w系建立的基礎(chǔ)上，利用熒光染色標(biāo)記研究了病菌孢子在專化性寄主侵染過程中的萌發(fā)發(fā)育情況，并通過RT-qPCR分析了黑楊寄主抗病相關(guān)基因在應(yīng)答兩?；颓秩具^程中的不同表達(dá)。[結(jié)果]結(jié)果發(fā)現(xiàn)多芽管分生孢子在黑楊寄主上能完成發(fā)育并成功侵染，單芽管分生孢子也能成功萌發(fā)和發(fā)育，但不能侵入黑楊寄主；黑楊抗性基因在兩?；颓秩景l(fā)育過程中均能被誘導(dǎo)表達(dá)，但在表達(dá)時間和表達(dá)量上，除基因WRKY89的表達(dá)較為一致外，病程相關(guān)基因PR5、PR10、NPR1和LAR3在二者間的表達(dá)存在差異。[結(jié)論]研究結(jié)果初步表明病原?；涂赡苁羌闹髋c病原專性互作的表型，這一認(rèn)識將有助于進(jìn)一步探明楊樹褐斑病病原?；托纬珊头只臋C(jī)制。

楊生褐盤二孢，專化型，RT-qPCR，基因表達(dá)

病原菌種內(nèi)?；偷姆只瘷C(jī)制是植物病理學(xué)研究的基本問題，揭示其中的機(jī)制對于認(rèn)識病害發(fā)生規(guī)律和提出防治策略均具有重要意義[1]。楊生褐盤二孢(Marssoninabrunnea(Ell. et Ev.) P. Magn.)是引起楊樹早期落葉和樹勢衰弱的重要病原菌[2-3]，針對不同楊樹寄主，該菌分化為多芽管和單芽管兩個專化型，并在自然界分別只侵染親和性黑楊(Aigeiros)(包括青楊Tacamahaca)派系寄主和白楊派系(Leuce)寄主[2,4]。有研究表明，籍于ITS分子系統(tǒng)發(fā)育以及其它遺傳分子標(biāo)記，在一定程度上可區(qū)分兩個?；蚚5-6]， 尤其ITS2遺傳特征能區(qū)分聚類不清的?；蚚6]，這說明兩個?；偷姆只哂幸欢ǖ姆肿舆z傳基礎(chǔ)。但這種分化基礎(chǔ)在病原與寄主互作水平上的表現(xiàn)并未給予揭示，專化型是病原侵入寄主過程中與寄主互作的表型體現(xiàn)，是病原與寄主互作生態(tài)進(jìn)化的結(jié)果，其中寄主的病程相關(guān)蛋白可能參與或奠定了?；缘陌l(fā)生基礎(chǔ)[1]。為此，作者在明確黑楊寄主對兩個?；颓秩揪哂许憫?yīng)的基礎(chǔ)上，通過分析已有相關(guān)病原?；颓秩九c楊樹互作過程的研究報道，選取了具有抗病標(biāo)記作用的楊樹寄主基因，如水楊酸(SA)誘導(dǎo)表達(dá)防衛(wèi)基因PR5(類奇異果糖蛋白)、抗性基因PR10、SAR(systemic acquired resistance)信號途徑中起關(guān)鍵調(diào)控因子的非病程相關(guān)基因表達(dá)基因NPR1(Nonexpressor of Pathogenesis-related Genes1)、抗病調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子WRKY以及和對褐斑病病菌菌絲有抑制作用的無色花色素還原酶基因(PtrLAR)等進(jìn)行分析研究，結(jié)果初步證明了楊生褐盤二孢和寄主的互作是形成楊樹?；偷幕A(chǔ)之一。

1 材料與方法

1.1 楊生褐盤二孢和供試黑楊材料

供試黑楊為一年生扦插苗盆栽苗。扦插于第二年3月份，7—8月份成熟葉片用于接種試驗。

1.2 ?；途昵秩竞跅钤囼灱斑^程觀察

孢子懸浮液制備：兩專化型菌株RHHB和RHBH分別在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d，無菌水洗脫孢子，分別制備成濃度為106個·mL-1的孢子懸浮液用于接種。

侵染試驗及病情分級：7—8月份，選取健康長勢相近的一年生的黑楊扦插植株進(jìn)行處理試驗。每株選取7～8片健康成熟葉片用于涂抹接種，塑料袋保濕48 h。對照設(shè)置為接種無菌水。選取接種后2、8、24、96 h觀察記錄侵染過程和發(fā)病情況，該時間點對應(yīng)孢子萌發(fā)的不同發(fā)育階段和侵染階段。發(fā)病程度依據(jù)病情指數(shù)統(tǒng)計，病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 離體葉片接種病情分級標(biāo)準(zhǔn)

侵染過程觀察：黑楊接種葉組織經(jīng)徒手切片[7]后，放在載玻片上，滴加0.001%的熒光增白劑(18909-100ML-F,Sigma)，黑暗條件下染色5 min后，在倒置熒光顯微鏡(徠卡DMI6000B)觀察褐盤二孢孢子在黑楊葉片的發(fā)育侵染過程。

1.3 熒光定量PCR分析黑楊響應(yīng)不同?；途昵秩镜南嚓P(guān)基因表達(dá)

取接種后第2、24、96 h處理組黑楊和對照葉組織，用錫箔紙包裹立即放到液氮中1 min，然后取出放入-80℃冰箱中保藏至RNA提取。

RNA提取及反轉(zhuǎn)錄：實驗采用CTAB法提取RNA[8]。用1%瓊脂糖凝膠及Nanodrop ND-1000儀對RNA完整性和質(zhì)量進(jìn)行檢測。反轉(zhuǎn)錄前，用RQ1 RNase-Free Dnase (Promega)去除RNA樣本中的DNA，并將RNA的濃度稀釋為100 ng·μl-1，取10 μlRNA作為反轉(zhuǎn)錄起始模板，反轉(zhuǎn)錄試劑盒采用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo)，按說明書進(jìn)行。

本次研究中，采取靜脈溶栓治療能夠顯著提高早期急性心梗死患者的血管再通率，并減少其不良反應(yīng)的發(fā)生，從而顯著降低患者的死亡率。同時從本次研究還可以看到，38例在發(fā)病后6 h之內(nèi)進(jìn)行靜脈溶栓的患者，其血管再通率要顯著高于22例發(fā)病6～12 h進(jìn)行治療的患者，這一結(jié)果表明，對于早期急性心肌梗死患者來說，靜脈溶栓治療的時間越早，其血管再通成功率也越高，因此，對于這類患者需及早進(jìn)行治療。

1.4 Real-time PCR

以病程相關(guān)蛋白PR5、PR1、NPR1，WRKY基因家族的基因PtrWRKY89以及無色花色素還原酶基因PtrLAR3為定量表達(dá)基因，內(nèi)參基因為ACTIN。內(nèi)參基因與目的基因擴(kuò)增效率M值<0.1。上述基因擴(kuò)增引物(表2)見相關(guān)文獻(xiàn)[9-12]，且其?；越?jīng)過實驗驗證。

基因表達(dá)定量采用SYBR Green (Life Technologies)相對定量2-ΔΔCt法。其中ΔΔCt的計算方法如下：

ΔCt=Ct(目的基因)— Ct(參考基因)

△△Ct =△Ct(試驗樣品)—△Ct(基準(zhǔn)樣品)

△Ct(試驗樣品) = Ct(試驗樣品，目的基因)—Ct(試驗樣品，內(nèi)參基因)

△Ct(基準(zhǔn)樣品) = Ct(基準(zhǔn)樣品，目的基因)—Ct(基準(zhǔn)樣品，內(nèi)參基因)

定量PCR的反應(yīng)體系為20 μL，每個處理3個重復(fù)。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火60 s(開啟熒光)，40個循環(huán)。定量PCR儀為Rorot Gene 6000。

表2 Real-time PCR中目的基因的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 兩?；途昵秩竞跅?/p>

經(jīng)接種試驗調(diào)查，兩?；驮诠┰嚭跅钌袭a(chǎn)生的發(fā)病率情況分別是：多芽管?；途闞HHB從29.2～50%；單芽管?；途闞HBH從0～8.3%，分別表現(xiàn)為感病和抗病(表3)。這與自然界?；颓秩鞠鄳?yīng)寄主發(fā)病的現(xiàn)象是一致的。

楊生褐盤二孢黑楊?；蚏HHB和白楊?；蚏HBH在黑楊葉片上的發(fā)育過程(圖1、2)基本一致，即在接種2 h時，分生孢子開始萌發(fā)，在2～12 h逐漸長出芽管；12 h時始見附著孢；在24 h時產(chǎn)生大量附著孢；48～96 h時產(chǎn)生先菌絲。

表3 楊生褐盤二孢接種黑楊葉片感病病情分析結(jié)果

RHHB在黑楊葉片表面開始大量形成先菌絲，先菌絲先端接觸到葉片后膨大形成附著孢，由此開始侵染葉片。菌絲在擴(kuò)展過程中逐漸形成分生孢子盤，接種葉片在10 d可以看到產(chǎn)生病斑，病斑顏色由褐色逐漸加深至黑色；而RHBH產(chǎn)生少量先菌絲后就不再對葉片侵染，接種10 d后也未發(fā)現(xiàn)葉片表面有病斑出現(xiàn)。

表4 相對定量的相關(guān)參數(shù)

2.2 黑楊抗性基因?qū)蓪；颓秩镜捻憫?yīng)表達(dá)

選擇內(nèi)參基因Actin和五個目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2>0.97，擴(kuò)增效率E值為1.05和1.06，兩者的M值相差小于0.1 (表4)。擴(kuò)增后的產(chǎn)物可通過溶解曲線的峰型圖直觀判斷，內(nèi)參Actin和五個目的基因的Real-time PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳均為單一條帶(圖3)，表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較高。這些結(jié)果均符合實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，滿足后續(xù)試驗要求，可以進(jìn)行熒光定量PCR試驗[13-14]。

黑楊5個抗性基因在葉片分別接種孢子2 h、24 h、96 h后的表達(dá)情況如下(圖4)。

圖1 黑楊?；途昵秩竞跅钊~片過程Fig.1 The Aigeiros Biotypes strains infection leaf of P. niger

圖2 白楊?；途昵秩竞跅钊~片過程Fig.2 The Leuce Biotypes strain infection leaf of P. niger

圖3 Real-time PCR產(chǎn)物凝膠電泳
Fig. 3 Agarose electrophoresis of Real-time PCR products

在黑楊應(yīng)答楊盤二孢侵染的過程中，隨著孢子在葉片上的萌發(fā)生長和侵染，抗病基因?qū)Σ煌瑢；偷谋磉_(dá)也呈現(xiàn)不同的變化。多芽管專化型(黑楊?；?病菌侵入時，黑楊在接種2 h時孢子萌發(fā)時，均上調(diào)表達(dá)了5個抗性基因，其中PR10上調(diào)最為顯著；至接種后24 h時病菌附著孢形成，寄主中這5個基因均呈現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)，顯示出寄主對這一時期病菌侵染過程抗性的減弱；而接種96 h時，病菌先菌絲形成并侵入后，僅有PtrWRKY89和PtrLAR3顯著上調(diào)表達(dá)，其余3個基因的表達(dá)與孢子萌發(fā)期的表達(dá)水平幾乎持平。

而黑楊對單芽管專化型(白楊?；?病菌相同發(fā)育階段和侵染過程的應(yīng)答，則是接種2 h時，PR10和PtrWRKY89顯著上調(diào)表達(dá)，而其余3個基因的表達(dá)微式上調(diào)；接種24 h時病菌形成附著孢，PR5、NPR1和PtrLAR3持續(xù)明顯上調(diào)，至接種96 h時，這3個參與病菌先菌絲形成和侵入階段的抗性基因表達(dá)達(dá)到檢測時間內(nèi)的最高表達(dá)量；而PR10在接種24 h和96 h時持續(xù)下調(diào)，PtrWRKY89則在接種24 h時有所下調(diào)后，接種96 h時又有上調(diào)至病原菌侵染之處2 h的表達(dá)水平。因此，黑楊中5個抗性基因?qū)蓪；偷谋磉_(dá)譜沒有一個是相似的?？梢?，兩?；驮谇秩緯r，與寄主的互作在分子水平上存在顯著差異。

3 討論

注：黑色條框表示黑楊?；途杲臃N黑楊葉片的樣本表達(dá)情況，白色條框表示白楊?；途杲臃N黑楊葉片的樣本表達(dá)情況。
Note:The black box show expression of Aigeiros Biotypes strain inoculate leaves, the white box show expression of Leuce Biotypes Strain inoculate leaves.
圖4 目的基因在不同時期Real-time PCR相對定量表達(dá)
Fig.4 The samples relative expression of target genes in different stages by real-time PCR

侵染楊樹的楊生褐盤二孢兩個?；途哂幸欢ǖ倪z傳基礎(chǔ)[4-6]。11條隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性引物(RAPDs 引物)能擴(kuò)增到76條帶，能將國內(nèi)42株楊盤二孢聚類成主要的兩組，并與寄主來源對應(yīng)；僅有一株不在兩組內(nèi)，而被認(rèn)為是過渡型[5]，而這過渡型在ITS2結(jié)構(gòu)的分型中得以歸化為兩組之一[6]。因此，楊盤二孢專化型是病原菌適應(yīng)和遺傳進(jìn)化的結(jié)果。但我們不了解這遺傳形成的進(jìn)化壓力，最新研究認(rèn)為病原與寄主分子互作是壓力構(gòu)成的主要因素或主導(dǎo)因素[15]。自然界楊樹褐斑病只發(fā)生在?；秃直P二孢與其親和的楊樹組寄主中，不發(fā)生交叉侵染。供試的白楊?；秃直P二孢(單芽管專化型)孢子能在供試黑楊上發(fā)育，但不能侵染。雖然在供試黑楊上也出現(xiàn)有8.3%的壞死病斑，但這些均屬于過敏性壞死(張琰鋒, 資料待發(fā)表)。因此，楊樹寄主對褐盤二孢的選擇性或二者之間的互作是形成專化型的分化的可能因素。

在楊樹抗病抗逆的研究中，發(fā)現(xiàn)了一些抗性關(guān)聯(lián)的常規(guī)表達(dá)基因[9-11,16-17]。本文利用的5個基因中，PR5(類奇異果糖蛋白)是病程相關(guān)基因，由水楊酸(SA)誘導(dǎo)表達(dá)的防衛(wèi)基因；PR10蛋白是具有多種小亞類的胞內(nèi)蛋白，表現(xiàn)抗菌、體外酶活性、參與植物次生代謝、抵御非生物脅迫等復(fù)雜的生物學(xué)功能；NPR1是系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAS)信號途徑關(guān)鍵調(diào)控因子之一，誘導(dǎo)PR相關(guān)基因表達(dá)；PtrWRKY89為WRKY基因家族，參與發(fā)育和生理過程調(diào)節(jié)，高通量轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)該族蛋白在楊樹黑斑病、水楊酸途徑、創(chuàng)傷等過程都表現(xiàn)抗性調(diào)控，并且加速PR相關(guān)基因表達(dá)；最后，PtrLAR3為無色花色素還原酶基因(PtrLAR)，分離自毛果楊葉片，能抑制黑斑病菌菌絲的生長。這些基因在植物與病原物互作過程中發(fā)揮著一定作用，在病原菌侵染的不同時期，其表達(dá)也存在差異性。

從這5個抗病相關(guān)基因在侵染過程中的表達(dá)變化可見(圖4)，黑楊寄主對病原菌的調(diào)控表達(dá)，在病原菌接觸起始就有了響應(yīng)。現(xiàn)已知病原菌孢子在葉組織表面萌發(fā)至附著孢形成，寄主的主要應(yīng)答方式是對病原菌相關(guān)分子程式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)因子識別引起的抗性，這種抗性非常容易被長期進(jìn)化和適應(yīng)了的病原菌所克服[13]。自然界楊生褐盤二孢的兩個專化型上，與黑楊有著長期互作適應(yīng)進(jìn)化的是多芽管?；汀Ｔ谖覀兊难芯拷Y(jié)果中，也呈現(xiàn)出二者的這種適應(yīng)關(guān)系。如在2 h～24 h間，黑楊對多芽管?；?RHHB)的接觸和識別，在5個抗性基因中，寄主除PR10在孢子萌發(fā)階段有強(qiáng)烈上調(diào)相應(yīng)和迅速下調(diào)外，其余4個抗性基因并沒有顯示積極的顯著上調(diào)表達(dá)，說明病原菌進(jìn)化出適應(yīng)寄主抗性的能力，并進(jìn)而分泌效應(yīng)物克服黑楊對PAMPs的抗性，致使黑楊發(fā)生病害[18]。而面對單芽管?；偷牟【秩?，在2 h病原菌萌發(fā)開始，黑楊寄主這5個基因就具有強(qiáng)烈應(yīng)答表現(xiàn)，而且其中三個基因的表達(dá)強(qiáng)度隨單芽管病原菌發(fā)育侵染過程不斷增加，顯示出該?；团c黑楊寄主的不親和性。這可能是單芽管?；驮谂c黑楊寄主長期進(jìn)化過程中，未發(fā)展出適應(yīng)性互作關(guān)系的結(jié)果，致使黑楊寄主對此專化型表現(xiàn)出高度抗性或免疫。這種抗性從組織病理學(xué)的角度也可以發(fā)現(xiàn)(圖1)，相對于多芽管?；玩咦影l(fā)育形成附著孢之后，表現(xiàn)的繼續(xù)旺盛生長而言，單芽管專化型孢子則在黑楊上萌發(fā)形成附著孢后，菌絲的發(fā)育即陷入停滯(圖2)。這些觀察到的性狀比較，在之前的研究中并未給予揭示或提示。當(dāng)然，更為明確的區(qū)別特征有待于進(jìn)一步通過更細(xì)致的分子組織病理學(xué)的方法給予闡述。

4 結(jié)論

楊生褐盤二孢?；偷姆只碎L期進(jìn)化適應(yīng)導(dǎo)致的遺傳變異外，還可能與寄主互作過程相關(guān)。本文通過兩個?；途陮跅钋秩具^程的組織病理學(xué)、及其關(guān)聯(lián)的抗性基因表達(dá)變化的研究，發(fā)現(xiàn)了黑楊對兩個專化型有著不同的應(yīng)答圖譜，進(jìn)而認(rèn)為病原菌專化型的分化與寄主的互作是密切相關(guān)的，楊生褐盤二孢與楊樹寄主的互作對其?；头只哂羞x擇壓力的作用。其機(jī)制有待于后續(xù)互作轉(zhuǎn)錄組學(xué)來做進(jìn)一步的闡明。

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(責(zé)任編輯：崔 貝)

Gene Differential Expression onPopulusdeltoidsResponding to Infection byMarssoninabrunneaFormae

WANGKai-ying1,GAOQian1,SUNXiao-ming1,ZHANGYan-feng3,YANDong-hui1,2

(1. Research Institute of Forest Ecology，Environment and Protection, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China; 2. Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing 210037, Jiangsu, China; 3. Forestry College, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)

[Objective]To study the mechanism ofMarssoninabrunneasp.monogermtubiformae speciales (RHBH) infectingPopulusSection Leuce andM.brunneasp.multigermtubiformae speciales (RHHB) infectingPopulusSection Aigeiros. [Method] Based on pathogen-host interaction system, the pathogen’s spore germination, growth and infection process on poplar leaves were investigated by using fluorescence microscopy strain method and the expression of five pathogen-relative genes in hosts was also analyzed by RT-qPCR technique. [Result] The results showed that the spores of RHHB were able to grow and successfully infect the hosts ofPopulusSection Aigeiros, the spores of RHBH were also able to grow but failed to infect the hosts ofPopulusSection Aigeiros. The pathogen-resistant genes of Populus Section Aigeiros could be induced and express during the infection process of the two formae speciales. The gene express ofWRIKY89 followed a similar expression trend, while the other four genes (PR5, PR10, NPR1 and LAR3) followed different expression patterns in time and quantity for the two formae speciales. [Conclusion] The study provides some references for study the mechanisms of the two formae speciales and their differentiation.

Marssoninabrunnea; formae speciales; Real-time PCR, gene express

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.04.007

2016-08-29

效應(yīng)物在楊盤二孢半活養(yǎng)方式及親和寄主致病性中的作用(31370645)、水解纖維素產(chǎn)烴樹木內(nèi)生菌資源利用技術(shù)引進(jìn)(2013-4-10)、芯片通量病原檢測技術(shù)在楊樹病害防控中的應(yīng)用([2016]10號)

王凱英(1990—)，女，河北邯鄲人，在讀碩士研究生，森林植物微生物組學(xué)，E-mail：wkylibra@163.com

* 通訊作者：博士，研究員，主要從事森林病理與樹木微生物群學(xué)(microbiomes)，E-mail：yandh@caf.ac.cn

S796

A

1001-1498(2017)04-0582-06