豬流行性腹瀉病毒與圓環(huán)病毒2型復(fù)合PCR方法的建立

龔雙燕，李小璟，陳瑛琪，蔡 瑤，李雨濛，徐逸飛，朱 玲，b，徐志文，b，*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) a.動(dòng)物醫(yī)學(xué)院； b.動(dòng)物疫病與人類(lèi)健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

豬流行性腹瀉病毒與圓環(huán)病毒2型復(fù)合PCR方法的建立

龔雙燕a，李小璟a，陳瑛琪a，蔡 瑤a，李雨濛a，徐逸飛a，朱 玲a，b，徐志文a，b，*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) a.動(dòng)物醫(yī)學(xué)院； b.動(dòng)物疫病與人類(lèi)健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

為研究豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)在腹瀉仔豬中的感染狀況，建立一種能同時(shí)檢測(cè) PEDV與PCV2混合感染的復(fù)合PCR方法。根據(jù)GenBank已發(fā)表的PEDV、PCV2的基因序列，選擇保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)、合成1對(duì)特異性引物，擴(kuò)增目的片段分別為530和278 bp。經(jīng)反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了特異性檢測(cè)PEDV、PCV2的復(fù)合PCR方法。應(yīng)用本試驗(yàn)所建復(fù)合PCR方法，對(duì)2016年4—8月采自四川省樂(lè)山、宜賓、廣元和遂寧等地區(qū)的67份腹瀉仔豬樣品(腸系膜淋巴結(jié)、腸道黏膜及其內(nèi)容物混合)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：PEDV、PCV2單一感染陽(yáng)性率分別為34.33%、73.13%；PEDV+PCV2復(fù)合感染率為16.42%。經(jīng)與特異性檢測(cè)PCV2的PCR法和PEDV的RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析，符合率均為100%。

流行性腹瀉病毒；圓環(huán)病毒2型；復(fù)合PCR

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus， PEDV)會(huì)引發(fā)以嘔吐、腹瀉和脫水為特征的急性、接觸性、高度傳染性豬消化道疾病。近年，豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea， PED)在全球范圍暴發(fā)流行，表現(xiàn)為高發(fā)病率和7 d以?xún)?nèi)新生仔豬感染后高死亡率，給我國(guó)乃至世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失[1]。豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2， PCV2)感染可引起斷奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎與腎炎綜合征、豬呼吸道綜合征等多種病型[2-4]。該病毒因可侵害感染豬免疫系統(tǒng)引起免疫抑制，降低機(jī)體抵抗力[5-6]，導(dǎo)致繼發(fā)、并發(fā)其他病原而表現(xiàn)為臨床混合感染[7]。有報(bào)道顯示，PCV2感染可能加重PEDV所致的仔豬病毒性腹瀉病理?yè)p傷，導(dǎo)致死亡率提高。為進(jìn)一步研究PCV2在腹瀉仔豬中感染狀況與疾病損害間關(guān)系，本試驗(yàn)建立了同時(shí)檢測(cè)PCV2和PEDV的復(fù)合PCR方法，以期為開(kāi)展以上病毒診斷提供靈敏、快速、特異的方法，科學(xué)分析其混合感染狀況，為制定仔豬PEDV、PCV2的綜合防控措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒、病料和菌株的來(lái)源

豬偽狂犬病病毒(pseudo rabies virus， PRV)、豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus virus， PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV)、豬瘟病毒(classical swine fever virus， CSFV)、豬傳染性胃腸炎(transmissible gastroenteritis of swine virus， TGEV)、豬輪狀病毒(rotavirus， RV)、豬流行性腹瀉病毒和豬圓環(huán)病毒2型均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心保存；病料(腸道、腸系膜淋巴結(jié)、腸道內(nèi)容物)采自四川省樂(lè)山、宜賓、廣元和遂寧等地區(qū)。

1.2 主要試劑

DL2000 DNA Marker、10×buffer(Mg2+free)、dNTP Mix、MgCl2、TaKaRaTaqHs、ddH2O、pMD19-T載體、DH5α大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒(Plasmid)DNA小量純化試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。DNA膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank已發(fā)表的PEDV(Accession: KR011756.1)、PCV2(Accession: KT336601.1)基因的核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物PEDV-F、PEDV-R和PCV2-F、PCV2-R，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為530 bp和278 bp，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

1.4 樣品處理及病毒核酸的提取

67份腹瀉病料，樣品編號(hào)1—67。病料處理：取病豬的腸道、腸系膜淋巴結(jié)、腸道內(nèi)容物混合在一起，放進(jìn)研缽加入適量的液氮磨碎成粉末狀，加入適量生理鹽水形成研磨液，反復(fù)凍融3次備用。

DNA的提取：采用傳統(tǒng)的酚-氯仿法提取病料研磨液的總DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄：采用TrizoL法提取病料研磨液的總RNA。將提取的RNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，反應(yīng)體系(10 μL)如下：模板RNA 3.0 μL；5×PrimeScript Buffer 2.0 μL；Primer script RT Enzyme mix Ι 0.5 μL；Oligo dT primer 0.5 μL；Random 6 mers 0.5 μL；RNase free H2O 3.5 μL。放入PCR儀，經(jīng)37 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min,85 ℃滅活5 s，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單項(xiàng)PCR的擴(kuò)增

以1.4節(jié)制備的DNA和cDNA為模板，參照本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)所用PCR反應(yīng)體系，及所設(shè)計(jì)引物的Tm值，優(yōu)化PCR反應(yīng)溫度。選出兩對(duì)引物的最佳反應(yīng)退火溫度。本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)PCR反應(yīng)總體系25 μL∶10×buffer(Mg2+free) 2.5 μL；dNTP Mix 2.0 μL(2.5 mmol·L-1)；MgCl22.0 μL(25 mmol·L-1)；TaKaRaTaqHs 0.2 μL(5 U·μL-1);上游和下游引物各1.0 μL(10 pmol·μL-1);DNA或cDNA模板1.0 μL;其余用ddH2O補(bǔ)足。單項(xiàng)PCR擴(kuò)增過(guò)程：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取PCR產(chǎn)物6 μL經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 復(fù)合PCR所用引物序列

Table 1 Primer sequences for the multiplex PCR

引物名稱(chēng)Primername引物序列Primersequence(5′→3′)預(yù)期擴(kuò)增片段大小Amplifiedfragmentsize/bpPEDVF：GTGAGTAATCCGAGTGCGGT530R：ATTGCCACGACTCCTGCTACPCV2F：GGAAGGACGAACACCTCACC278R：CAAACGTTACAGGGTGCTGC

1.6 目的片段克隆與測(cè)序

使用DNA膠回收試劑盒回收單項(xiàng)PCR目的片段，連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化入DH5α克隆宿主菌中。將陽(yáng)性克隆交由擎科生物公司測(cè)序，將測(cè)序正確的樣品擴(kuò)大培養(yǎng)，用質(zhì)粒小提試劑盒提取2種含有不同目的片段的質(zhì)粒作為復(fù)合PCR的反應(yīng)模板。

1.7 復(fù)合PCR方法的建立與反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.7.1 dNTP Mix、Mg2+、TaqHs用量?jī)?yōu)化

在單項(xiàng)PCR基礎(chǔ)上，對(duì)PCV2、PEDV復(fù)合PCR中 dNTP Mix、Mg2+、TaqHs酶用量進(jìn)行優(yōu)化。PCR反應(yīng)總體系25 μL。每試驗(yàn)優(yōu)化單一變量，其余參數(shù)仍使用未優(yōu)化濃度與劑量(見(jiàn)1.5節(jié))。分別只改變 dNTP Mix、Mg2+、TaqHs的用量，其梯度分別為dNTP Mix∶1.0、1.5、2.0、2.5 μL；Mg2+：1.0、1.5、2.0、2.5 μL；TaqHs∶0.2、0.3、0.4、0.5 μL，進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序同單項(xiàng)PCR，根據(jù)擴(kuò)增條帶的效果差異逐步篩選出各自組分的最佳用量。

1.7.2 PCV2、PEDV復(fù)合PCR反應(yīng)引物的優(yōu)化

在單項(xiàng)PCR基礎(chǔ)上，進(jìn)行復(fù)合PCR實(shí)驗(yàn)(25 μL復(fù)合PCR優(yōu)化體系)，按不同引物用量(PCV2、PEDV分別為0.5、0.8、1.0、1.5、1.8、2.0 μL)進(jìn)行試驗(yàn)，篩選出最佳引物量。

1.7.3 PCV2、PEDV復(fù)合PCR反應(yīng)退火溫度優(yōu)化

在單項(xiàng)PCR基礎(chǔ)上，確定25 μL復(fù)合PCR優(yōu)化體系，然后梯度選取10個(gè)退火溫度(56.6、57.5、58.6、60.0、61.7、63.0、64.2、65.2、65.7、66.0 ℃)，選出最佳反應(yīng)退火溫度。

1.8 復(fù)合PCR 的特異性試驗(yàn)

利用已建立的復(fù)合PCR，取等量的PRV、PPV病毒的DNA，及CSFV、PRRSV、TGEV、RV病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以ddH2O做陰性對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電脈拍照分析。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

將PCV2、PEDV陽(yáng)性病料抽提出的DNA和RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，以初步建立的該檢測(cè)方法，分別進(jìn)行批間、批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，檢驗(yàn)該方法的穩(wěn)定性。

1.10 敏感性試驗(yàn)

取鑒定陽(yáng)性的PEDV、PCV2基因克隆，通過(guò)試劑盒抽提質(zhì)粒，用核酸蛋白儀測(cè)量PEDV、PCV2的陽(yáng)性重組質(zhì)粒的濃度，分別對(duì)兩者進(jìn)行10倍梯度稀釋(100～106)，然后取同一稀釋度的2種病毒核酸各1 μL混合，用以上優(yōu)化好的反應(yīng)體系和程序進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增，確定出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)條帶模板的最高稀釋倍數(shù)，推算出其最低檢出濃度。

1.11 臨床應(yīng)用

從四川樂(lè)山、宜賓、廣元和遂寧等地區(qū)采集腹瀉病料，按照本試驗(yàn)建立的復(fù)合PCR 擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照，取PCR產(chǎn)物6 μL在1.5%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一PCR擴(kuò)增

將1.6節(jié)所提取的2種質(zhì)粒作為模板，用各自特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)PEDV和PCV2進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳。單項(xiàng)PCR(體系見(jiàn)1.5節(jié))產(chǎn)物大小分別與預(yù)期的530 bp和278 bp相符合。將產(chǎn)物送至擎科生物公司測(cè)序，NCBI Blast比對(duì)結(jié)果顯示，核苷酸序列同源性均為99%，表明擴(kuò)增片段分別為各自病毒的特異性條帶(圖1)。

2.2 dNTP Mix、Mg2+、TaqHs酶用量?jī)?yōu)化

優(yōu)化單一變量，其余參數(shù)仍使用未優(yōu)化濃度與劑量，分別只改變dNTP Mix(1.0、 1.5、 2.0、 2.5 μL)、Mg2+(2.5、 2.0、 1.5 、1.0 μL)、TaqHs(0.5、 0.4、 0.3、 0.2 μL)的用量，結(jié)果顯示，在25 μL反應(yīng)體系中，當(dāng)dNTP Mix、Mg2+、Taq Hs酶用量分別為2.0、1.5和0.2 μL時(shí)擴(kuò)增的2條條帶最清晰(分別見(jiàn)圖2、圖3、圖4)

2.3 引物濃度和退火溫度的優(yōu)化

結(jié)果顯示，引物的最佳使用量分別為PCV2、PEDV各1.0 μL(圖5)；63 ℃為最佳退火溫度(圖6)。

M， DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1， PCV2； 2， PEDV； 3， 陰性對(duì)照M， DL2000 DNA Marker; 1， PCV2; 2， PEDV; 3， Negative control圖1 單一PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Single PCR test result

M， DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1、2、3、4，dNTP Mix 1.0、1.5、2.0、2.5 μL； 5， 陰性對(duì)照M， DL2000 DNA marker; 1， 2， 3， 4， dNTP mix 1.0， 1.5， 2.0， 2.5 μL， respectively; 5， Negative control圖2 不同濃度的dNTP mix的復(fù)合PCR擴(kuò)增Fig.2 Multiplex PCR amplification result with different concentrations of dNTP mix

2.4 復(fù)合PCR擴(kuò)增及體系的優(yōu)化

反應(yīng)體系25 μL: 10×buffer(Mg2+free) 2.5 μL，dNTP Mix 2.0 μL，MgCl21.5 μL，TakaraTaqHs 0.2 μL，上游和下游引物各1.0 μL，DNA或cDNA模板1.0 μL，其余用ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。在此條件下，反應(yīng)結(jié)果最佳。

2.5 特異性檢測(cè)

利用已建立的復(fù)合PCR，以1.6節(jié)所提取的2種質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，復(fù)合PCR能特異性擴(kuò)增PEDV和PCV2，產(chǎn)物大小分別約為530 bp和278 bp。分別以PRV、PPV病毒的DNAs，及PRRSV等病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，在已優(yōu)化的反應(yīng)條件下進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增，同時(shí)以ddH2O做陰性對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)，其擴(kuò)增產(chǎn)物能夠被明顯的區(qū)分開(kāi)來(lái)，并且不會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，證實(shí)了PCR擴(kuò)增的特異性(圖7)。

M， DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1、2、3、4， Mg2+ 2.5、2.0、1.5、1.0 μL； 5， 陰性對(duì)照M， DL2000 DNA marker， 1， 2， 3， 4， Mg2+ 2.5， 2.0， 1.5， 1.0 μL， respectively; 5， Negative control圖3 不同濃度的Mg2+的復(fù)合PCR擴(kuò)增Fig.3 Multiplex PCR amplification result with different concentrations of Mg2+

M， DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1、2、3、4， Taq Hs 0.5、0.4、0.3、0.2 μL； 5， 陰性對(duì)照M， DL2000 DNA marker; 1， 2， 3， 4， Taq Hs 0.5， 0.4， 0.3， 0.2 μL， respectively; 5， Negative control圖4 不同濃度的Taq Hs酶的復(fù)合PCR擴(kuò)增Fig.4 Multiplex PCR amplification result with different concentrations of Taq Hs

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

M， DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1， 56.6 ℃；2， 57.5 ℃；3， 58.6 ℃；4， 60.0 ℃；5， 61.7 ℃；6， 63.0 ℃；7， 64.2 ℃；8， 65.2 ℃；9， 65.7 ℃；10， 66.0 ℃；11， 陰性對(duì)照M， DL2000 DNA marker；1， 56.6 ℃；2， 57.5 ℃；3， 58.6 ℃；4， 60.0 ℃；5， 61.7 ℃；6， 63.0 ℃；7， 64.2 ℃；8， 65.2 ℃；9， 65.7 ℃；10， 66.0 ℃；11， Negative control圖5 不同退火溫度的復(fù)合PCR擴(kuò)增Fig.5 Multiplex PCR amplification result with different annealing temperature

M， DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、3、4、5、6， PCV2 和PEDV各 0.5、0.8、1.0、1.5、1.8、2.0 μL；7， 陰性對(duì)照M， DL2000 DNA marker; 1， PCV2 0.5 μL and PEDV 0.5 μL; 2， PCV2 0.8 μL and PEDV 0.8 μL; 3， PCV2 1.0 μL and PEDV 1.0 μL; 4， PCV2 1.5 μL and PEDV 1.5 μL; 5， PCV2 1.8 μL and PEDV1.8 μL; 6， PCV2 2.0 μL and PEDV 2.0 μL; 7， Negative control圖6 不同引物濃度的復(fù)合PCR擴(kuò)增Fig.6 Multiplex PCR amplification result with different primer concentration

M， DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1， PRV; 2， PRRSV; 3， PPV; 4， CSFV; 5， TGEVV; 6， RV; 7， 陰性對(duì)照; 8， PCV2; 9， PEDV; 10， PCV2+PEDVM， DL2000 DNA marker; 1， PRV; 2， PRRSV; 3， PPV; 4， CSFV; 5， TGEVV; 6， RV; 7， Negative control; 8， PCV2; 9， PEDV; 10， PCV2+PEDV圖7 復(fù)合PCR的特異性試驗(yàn)Fig.7 Specificity test result of multiplex PCR

應(yīng)用復(fù)合PCR方法對(duì)陽(yáng)性模板進(jìn)行批間與批內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)，所有試驗(yàn)結(jié)果一致，表明本試驗(yàn)方法的重復(fù)性良好(圖8)。

2.7 敏感性試驗(yàn)

采用復(fù)合PCR擴(kuò)增條件來(lái)擴(kuò)增倍比稀釋的PCV2、PEDV的質(zhì)粒濃度混合模板，擴(kuò)增結(jié)果如圖9所示，推算出PCV2、PEDV的最低檢出量分別為4.38×104copies·μL-1和3.30×104copies·μL-1。

2.8 臨床應(yīng)用

從四川樂(lè)山、宜賓、廣元和遂寧等地采集的67份腹瀉病料提取病料中總RNA、DNA，按照本試驗(yàn)建立的復(fù)合PCR 擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照，取PCR產(chǎn)物6 μL在1.5%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后判定結(jié)果：PEDV單一感染陽(yáng)性率為34.33%，PCV2單一感染陽(yáng)性率為73.13%；PEDV+PCV2復(fù)合感染率為16.42%(表2)。復(fù)合PCR 擴(kuò)增與單一的特異性檢測(cè)PCV2的PCR 和檢測(cè)PEDV 的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析，符合率均為100%(表3)。

M: DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5： 批間重復(fù)性試驗(yàn)；6， 陰性對(duì)照；7～11， 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)；12，陰性對(duì)照M， DL2000 DNA marker; 1-5， Inter batch repeatability test；6， Negative control; 7-11， Intra batch repeatability test; 12， Negative control圖8 復(fù)合PCR的批間、批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Fig.8 Repeatability test of the multiplex PCR of inter batch and intra batch

M， DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～7， 模板的稀釋度分別為100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6；8， 陰性對(duì)照M， DL2000 DNA marker; 1-7， The dilutions of plasmid were 100， 10-1， 10-2， 10-3， 10-4， 10-5， 10-6; 8， Negative control圖9 復(fù)合PCR的敏感性試驗(yàn)Fig.9 Sensitivity test of multiplex PCR

3 討論

近年來(lái)由腹瀉所導(dǎo)致疾病給各大豬場(chǎng)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，不同豬群死亡率差異較大，其中以仔豬腹瀉最為突出。在臨床中常見(jiàn)PPV、PRV、PRRSV、CSFV、TGEV、RV、PCV2等疾病混合

表2 PEDV和PCV2的檢測(cè)結(jié)果

Table 2 Detection results of PEDV and PCV2

檢測(cè)內(nèi)容Testcontents檢測(cè)樣品數(shù)量TotalsampleNo．測(cè)出陽(yáng)性樣品數(shù)PositivesampleNo．陰性樣品數(shù)NegativesampleNo．陽(yáng)性率Positiverate/%PEDV6723443433PCV26749187313PEDV+PCV26711561642

表3 單項(xiàng)PEDV RT-PCR、PCV2 PCR與復(fù)合PCR對(duì)臨床病料檢測(cè)結(jié)果比較

Table 3 Detection results of multiplex PCR compared with PEDV RT-PCR and PCV2 PCR

病毒種類(lèi)Virusspecies檢測(cè)樣品數(shù)量Totalsamplenumber單項(xiàng)檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)positivecountstestedbyPEDVRT?PCRandPCV2PCR復(fù)合PCR檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)PositivecountstestedbyMultiplexPCR陽(yáng)性符合率Positivecoincidencerate/%PEDV672323100PCV2674949100PEDV+PCV2671111100

感染以致疫情加劇。隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模化集約化的發(fā)展，豬群之間接觸的概率增大，患病豬群多呈現(xiàn)混合感染現(xiàn)象，豬群死亡率大幅度上升，PED也會(huì)因?yàn)镻CV2的垂直傳播而變得易發(fā)，使得二者的混合感染更加嚴(yán)重，病癥更加明顯，病情更加嚴(yán)重[8-11]。筆者認(rèn)為，造成疫情嚴(yán)重的主要原因在于免疫接種的重視程度差異、飼喂方式差異、胎次差異等。根據(jù)本試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，在臨床表現(xiàn)為腹瀉的仔豬病料中，PEDV、PCV2兩種導(dǎo)致腹瀉病毒的抗原檢測(cè)有較高的陽(yáng)性檢出率，PEDV、PCV2混合感染豬場(chǎng)相較單獨(dú)感染PEDV、PCV2的豬場(chǎng)而言死亡率增加30%左右。對(duì)此應(yīng)引起高度重視，故本試驗(yàn)建立的這種快速有效檢測(cè)這兩種疾病的復(fù)合PCR方法意義重大。

以往實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的單一PCR[12]或RT-PCR[13]檢測(cè)方法，需要分別使用不同引物單獨(dú)擴(kuò)增，分別鑒定，耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)成本高，而本試驗(yàn)可以節(jié)約一半以上的時(shí)間及成本。與李維華等[14]研究報(bào)告相比，本方法可根據(jù)臨床病癥以及季節(jié)性特征對(duì)PEDV、PCV2這2種疾病的可疑病料進(jìn)行針對(duì)性的檢測(cè)，具有省時(shí)、省力、不浪費(fèi)檢測(cè)試劑去檢測(cè)其余不相關(guān)病毒病，從而降低檢測(cè)成本的優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)2病毒的標(biāo)準(zhǔn)參考株的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，以抽提的DNA和RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行復(fù)合PCR方法的構(gòu)建與優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在退火溫度為63 ℃時(shí)其擴(kuò)增效果最好，沒(méi)有任何非特異擴(kuò)增條帶。研究中所設(shè)計(jì)的2對(duì)引物長(zhǎng)度分別為530 bp 、278 bp，在特異性試驗(yàn)中，本方法能擴(kuò)增出特異的陽(yáng)性條帶，且本試驗(yàn)檢測(cè)的所有其他易引起腹瀉的病毒(豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒等)和陰性對(duì)照均未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，說(shuō)明該方法特異性良好。在敏感性試驗(yàn)中，本方法與普通PCR相比較敏感性更高。在對(duì)臨床樣品的檢測(cè)比較中，筆者發(fā)現(xiàn)這種同時(shí)檢測(cè)PEDV、PCV2兩種疾病的復(fù)合PCR的方法與單項(xiàng)PCR、RT-PCR檢測(cè)的符合率達(dá)到100%，說(shuō)明該方法在臨床上具有重要的應(yīng)用前景。

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(責(zé)任編輯 盧福莊)

Establishment of a multiplex PCR for porcine epidemic diarrhea virus and porcine circovirus type 2

GONG Shuangyana， LI Xiaojinga， CHEN Yingqia， CAI Yaoa， LI Yumenga， XU Yifeia， ZHU Linga，b， XU Zhiwena，b，*

(a.CollegeofVeterinaryMedicine; b.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

In order to study the infection status of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) and porcine circovirus type 2 (PCV2) in diarrhea piglets， a multiplex PCR method for simultaneous detection of PEDV and PCV2 mixed infection was established. According to the published sequence of PEDV and PCV2 in GenBank， 2 pairs of specific primers were designed and synthesized for the conserved region， and the amplified fragments were 530 and 278 bp， respectively. The multiplex PCR method for the specific detection of PEDV and PCV2 was established by optimizing the reaction conditions. A total of 67 diarrhea samples (mixed mesenteric lymph nodes， intestinal mucosa and their contents) were collected from Leshan， Yibin， Guangyuan and Suining of Sichuan Province from April to August， 2016， and were detected by multiplex PCR. The results showed that the single infection positive rates of PEDV and PCV2 was 34.33% and 73.13%， respectively. The combined infection rate of PEDV and PCV2 was 16.42%. The coincidence rates of the multiplex PCR method and the specific detection methods of PCV2 PCR and PEDV RT-PCR were all 100%.

porcine epidemic diarrhea virus; porcine circovirus type 2; multiplex PCR

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.07.05

2016-12-27

四川省科技支撐計(jì)劃(2017NZ0038)；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題(2015BAD12B04-2.3)

龔雙燕(1994—)，女，重慶開(kāi)縣人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)研究。E-mail: 654392857@qq.com

*通信作者，徐志文，E-mail: abtcxzw@126.com

S855.3

A

1004-1524(2017)07-1086-07

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(7): 1086-1092

龔雙燕，李小璟，陳瑛琪，等. 豬流行性腹瀉病毒與圓環(huán)病毒2型復(fù)合PCR方法的建立[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(7): 1086-1092.