豬SLA-DRA基因SNP位點(diǎn)篩選及其生物信息學(xué)分析

劉麗霞，張 麗，田曉靜，陳 紅，寸海霞，金 麗，譚小音，謝德瓊

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

豬SLA-DRA基因SNP位點(diǎn)篩選及其生物信息學(xué)分析

劉麗霞，張 麗，田曉靜，陳 紅，寸海霞，金 麗，譚小音，謝德瓊

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

以八眉豬、蕨麻豬和甘肅黑豬為研究對象，利用PCR-SSCP和測序方法對SLA-DRA基因4個(gè)外顯子進(jìn)行SNP位點(diǎn)篩選，并利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測各SNP位點(diǎn)對DRA基因mRNA二級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果在3個(gè)豬種中共檢測到6個(gè)DRA基因SNP位點(diǎn)，分別為外顯子1的A177G，外顯子2的A3093C，以及外顯子4的A4167G、A4246G、C4282T和G4293A，其中A3093C、A4167G和G4293A為錯(cuò)義突變，分別導(dǎo)致甲硫氨酸(Met)變?yōu)榱涟彼?Leu)、谷氨酰胺(Gln)變?yōu)榫彼?Arg)和精氨酸(Arg)變?yōu)榻M氨酸(His)。以3個(gè)錯(cuò)義SNP位點(diǎn)為基礎(chǔ)，構(gòu)建了6種DRA單倍型，其中H1、H3和H6為主要單倍型，頻率分別為0.25、0.21和0.21。生物信息學(xué)分析表明，三個(gè)豬種DRA基因單倍型的mRNA二級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)與野生型均存在一定的差異。研究結(jié)果可為八眉豬、蕨麻豬和甘肅黑豬的保種和抗病育種提供理論依據(jù)。

豬;SLA-DRA;SNP位點(diǎn);生物信息學(xué)

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)是一組高度多態(tài)且緊密連鎖的基因群，參與免疫反應(yīng)中的抗原呈遞，與機(jī)體抗病性和免疫應(yīng)答密切相關(guān)[1]。豬主要組織相容性復(fù)合體又被稱為豬白細(xì)胞抗原(swine leukocyte antigen，SLA)，位于豬7號染色體著絲粒的兩端，由Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類分子構(gòu)成[2-3]。具有功能的經(jīng)典SLAⅠ類基因編碼蛋白質(zhì)的主要功能是將抗原遞呈給 CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞，還可以與自然殺傷細(xì)胞(NK)相互作用以阻止 NK 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性；SLAⅡ類抗原的主要作用是呈遞外源抗原給CD4+輔助T細(xì)胞；SLAⅢ類基因的主要作用是控制某些補(bǔ)體成分及其受體產(chǎn)生，而其產(chǎn)物不參與抗原呈遞[4]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異而引起的DNA序列的改變，位于基因編碼區(qū)的SNP位點(diǎn)會(huì)影響翻譯后氨基酸的類型，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。SLA-DRA基因位于SLAⅡ類分子α鏈上，能在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行表達(dá)，其編碼產(chǎn)物與抗原肽結(jié)合能產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。早期研究表明，SLA-DRA基因不存在SNP位點(diǎn)[5-6]。而Nielsen和Thomsen[7]發(fā)現(xiàn)SLA-DRA基因具有多態(tài)性。孫俊麗等[8]發(fā)現(xiàn)五指山豬DRA基因外顯子2上有1個(gè)SNP位點(diǎn)。Yang 等[9]對杜洛克豬、大白豬和長白豬的DRA基因進(jìn)行檢測，在外顯子1、2和4上分別檢測到2、2和6個(gè)SNP位點(diǎn)。Yang等[10]和Huang等[11]發(fā)現(xiàn)煙臺(tái)黑豬DRA基因外顯子1、2和4上分別有2、2和7個(gè)SNP位點(diǎn)[10-11]。Dillender等[12]發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的淋巴細(xì)胞可以表達(dá)SLA-DR基因。八眉豬DRA外顯子2上僅有1個(gè)SNP位點(diǎn)[13]，另外，DRA基因與仔豬腹瀉具有一定的相關(guān)性[9-11]，八眉豬DRA蛋白的免疫應(yīng)答概率較高[14]。

八眉豬又被稱為注川豬或西豬，是我國著名的地方豬種，具有適應(yīng)性強(qiáng)和抗逆性好等特點(diǎn)，且遺傳性能穩(wěn)定，是優(yōu)質(zhì)的地方良種豬[15]。甘南蕨麻豬又稱合作豬或山豬，是甘肅省的原始地方特色品種，具有生命力和抗逆能力強(qiáng)等特點(diǎn)，且有近交不退化等特征[16]。甘肅黑豬是甘肅省經(jīng)過雜交試驗(yàn)、橫交擴(kuò)群和閉鎖繁育培育得到的豬新品種，含有八眉豬、巴克夏和內(nèi)江豬的血緣，具有繁殖力強(qiáng)和抗逆性強(qiáng)等特征[17]。

本研究利用PCR-SSCP和測序技術(shù)對八眉豬、蕨麻豬和甘肅黑豬SLA-DRA基因4個(gè)外顯子序列進(jìn)行了SNPs檢測，并預(yù)測了SLA-DRA基因mRNA二級結(jié)構(gòu)，對比分析了SNP位點(diǎn)突變前后DRA蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，為研究DRA基因?qū)膊〉挠绊懙於ɡ碚摶A(chǔ)，也為八眉豬、蕨麻豬和甘肅黑豬的保種和抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和基因組DNA提取

八眉豬(222頭)來源于青海省八眉豬保種廠，蕨麻豬(147頭)來源于甘肅省臨夏縣盛源牧業(yè)有限責(zé)任公司，甘肅黑豬(102頭)來源于蘭州軍區(qū)寺兒坪養(yǎng)殖基地。選取哺乳期仔豬為采樣對象，于仔豬出生后1周內(nèi)剪取耳組織約3～5 g，置于裝有75%乙醇的離心管中，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎脗鹘y(tǒng)的酚-氯仿抽提法進(jìn)行豬耳組織基因組DNA提取，并通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2 PCR引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中太湖豬DRA基因序列(登錄號AY303990)，使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)DRA基因4對引物(表1)，分別擴(kuò)增DRA基因4個(gè)外顯子，引物由大連寶生物科技股份有限公司合成。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積25 μL，其中10×PCR buffer(25 mmol·L-1MgCl2) 2.5 μL，dNTP (各2.5 mmol·L-1)1 μL，TaqDNA 聚合酶 (5 U·μL-1)0.5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，基因組DNA(50～100 ng·μL-1)1 μL，滅菌超純水18.5 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

擴(kuò)增條件：94 ℃ 2min; 94 ℃ 20s,退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.3 PCR-SSCP分析

取2 μL PCR產(chǎn)物和8 μL的DNA變性緩沖液，混勻后98 ℃變性10 min，冰浴10 min后上樣于聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。DRA基因各外顯子電泳條件見表2。

表1DRA基因引物序列

Table 1 DNA primers information ofDRAgene

外顯子Exons引物序列Sequence(5′→3′)退火溫度Annealingtemperature/℃片段長度LengthofPCRproduction/bp外顯子1Exon1(151-226)F：CTTTGCTTGTATTGCR：ACCTAACTACCCCTC568186外顯子2Exon2(2884-3129)F：CAGAGAATCACGTGATCATR：ACAGGTACCATTGGTGTT550257外顯子3Exon3(3573-3854)F：TGCTAAACAGGGAAGGCTR：ACAAAGGAGACTGAGGGATG568352外顯子4Exon4(4155-4309)F：TCCCGTAATACATCGTTCR：TTCCTTTCCTTGGCTCAT556357

1.4 序列測定和分析

對SSCP結(jié)果進(jìn)行判型，選取各外顯子不同基因型個(gè)體進(jìn)行PCR產(chǎn)物直接測序。利用MEGA6.0軟件對測序結(jié)果進(jìn)行校正和序列拼接，并將測序結(jié)果與AY303990序列進(jìn)行比對，從而確定SNP位點(diǎn)。利用BioEdit對序列峰圖進(jìn)行編輯。

1.5 SNP位點(diǎn)基因頻率計(jì)算

利用Popgene 32軟件計(jì)算等位基因頻率，依據(jù)DRA基因4個(gè)外顯子等位基因頻率和SNP位點(diǎn)在等位基因中的分布計(jì)算SNP位點(diǎn)基因頻率。

1.6 單倍型構(gòu)建

利用SHEsis在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)構(gòu)建DRA基因SNP位點(diǎn)的單倍型，并分析SNP位點(diǎn)間的連鎖不平衡。

1.7 生物信息學(xué)分析

利用RNA fold web server(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)預(yù)測DRA基因mRNA二級結(jié)構(gòu)；利用PredictProtein在線服務(wù)器預(yù)測DRA蛋白二級結(jié)構(gòu)(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html)；利用SWISS-MODEL同源建模方法構(gòu)建DRA蛋白三級結(jié)構(gòu)模型(http://swissmodel.expasy.org/)，運(yùn)用PyMOL軟件對突變前后DRA蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比并繪制結(jié)果視圖。

表2DRA基因4個(gè)外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物SSCP電泳條件

Table 2 The optimized electrophoresis conditions for PCR amplicons of four exons ofDRAgene

PCR產(chǎn)物PCRproduct凝膠濃度ConcentrationofPAGE/%冷循環(huán)溫度Circulatingwatercoolanttemperature/℃電壓Voltage/V電泳時(shí)間Time/h電壓Voltage/V電泳時(shí)間Time/h外顯子1Exon112(39∶1)42500520020外顯子2Exon210(29∶1)42500520020外顯子3Exon310(39∶1)42500520020外顯子4Exon410(29∶1)182500520016

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

3個(gè)豬種耳組織基因組DNA提取結(jié)果經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳檢測見過如圖1所示，依據(jù)圖片結(jié)果，選取條帶清晰明亮、無拖帶的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳片段大小與預(yù)期片段大小相符，且條帶清晰、特異性良好(圖2)。

圖1 豬基因組DNA提取結(jié)果Fig.1 Extraction results of genomic DNA of pigs

M1、M3、M4， 100 bp DNA marker；M2， DL2000 DNA marker； A， 外顯子1 PCR產(chǎn)物； B， 外顯子2 PCR產(chǎn)物； C， 外顯子3 PCR產(chǎn)物； D， 外顯子4 PCR產(chǎn)物M1， M3 and M4， 100 bp DNA marker; M2， DL2000 DNA marker; A， PCR product of exon1; B， PCR product of exon2; C， PCR product of exon3; D， PCR product of exon4圖2 DRA基因4個(gè)外顯子PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Agarose gel results of PCR amplification result of four exons in DRA gene

2.3 PCR-SSCP檢測結(jié)果

DRA基因4個(gè)外顯子PCR-SSCP檢測結(jié)果和判型如圖3所示，3個(gè)豬種DRA基因4個(gè)外顯子分別檢測到3、3、1和6種基因型和2、2、1和5種等位基因，DRA基因外顯子1、2和4均具有多態(tài)性而外顯子3無多態(tài)性。3個(gè)豬種DRA基因4個(gè)外顯子各基因型頻率如圖4所示，在外顯子1上，3個(gè)豬種的BB型為優(yōu)勢基因型；在外顯子4上，3個(gè)豬種的GH型為優(yōu)勢基因型；而在外顯子2上，八眉豬的優(yōu)勢基因型為CC，而蕨麻豬和甘肅黑豬的優(yōu)勢基因型為CD。

2.4 序列測定結(jié)果

序列測定結(jié)果表明，3個(gè)豬種DRA基因4個(gè)外顯子上共有6個(gè)SNP位點(diǎn)，A177G位于外顯子1上，A3093C位于外顯子2上，A4167G、A4246G、C4282T和G4293A位于外顯子4上(圖5)。其中A3093C、A4167G和G4293A為錯(cuò)義突變，分別導(dǎo)致甲硫氨酸(Met)變?yōu)榱涟彼?Leu)、谷氨酰胺(Gln)變?yōu)榫彼?Arg)以及精氨酸(Arg)變?yōu)榻M氨酸(His)。

2.5DRA基因SNP位點(diǎn)基因頻率

DRA基因SNP位點(diǎn)基因頻率計(jì)算結(jié)果見表3，三個(gè)豬種各SNP位點(diǎn)基因頻率差異較大，蕨麻豬在6個(gè)位點(diǎn)上均檢測到多態(tài)性，而八眉豬在G4293A位點(diǎn)上未檢測到多態(tài)性，甘肅黑豬在A4246G位點(diǎn)上未檢測到多態(tài)性。

圖3 三個(gè)豬種DRA基因4個(gè)外顯子PCR-SSCP檢測結(jié)果Fig.3 PCR-SSCP banding patterns for four exons of DRA in three pig breeds

圖4 三個(gè)豬種DRA基因4個(gè)外顯子基因型頻率Fig.4 Genotype frequency of four exons of DRA gene in three pig breeds

圖5 DRA基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序峰圖及SNP位點(diǎn)Fig.5 Sequencing peak of PCR products and SNP sites of DRA gene

2.6 單倍型構(gòu)建和連鎖不平衡分析

利用DRA基因3個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)(A3093C、A4167G和G4293A)構(gòu)建單倍型，結(jié)果表明,3個(gè)SNP位點(diǎn)共有6種單倍型組合(表4)，分別為：H1(A-A-G)、H2(A-A-A)、H3(A-G-G)、H4(C-A-G)、H5(C-A-A)和H6(C-G-G)，其中H1、H3和H6為主要單倍型，頻率分別為0.25、0.21和0.21，H2頻率最低，僅為0.05。將GenBank中太湖豬DRA基因(登錄號AY303990)定義為野生型單倍型，對比發(fā)現(xiàn)，H1與野生型序列完全相同，H2的突變位點(diǎn)為G4293A，H3的突變位點(diǎn)為A4167G，H4的突變位點(diǎn)為A3093C，H5的突變位點(diǎn)為A3093C和G4293A，H6的突變位點(diǎn)為A3093C和A4167G。對3個(gè)SNP位點(diǎn)兩兩之間進(jìn)行連鎖不平衡參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，估計(jì)各位點(diǎn)之間的連鎖不平衡程度，結(jié)果表明，3個(gè)SNP位點(diǎn)之間均處于連鎖不平衡狀態(tài)

表3 三個(gè)豬種DRA基因SNP位點(diǎn)基因頻率

Table 3 Frequencies of SNP sites ofDRAgene in three pig breeds

SNPs所處位置Location八眉豬Bameipigs蕨麻豬Juemapigs甘肅黑豬GansuBlackpigsA177G外顯子1Exon1A(041)A(012)A(026)G(059)G(088)G(074)A3093C外顯子2Exon2A(074)A(066)A(063)C(026)C(034)C(037)A4167G外顯子4Exon4A(052)A(037)A(083)G(048)G(063)G(017)A4246G外顯子4Exon4A(016)A(011)A(000)G(084)G(089)G(100)C4282T外顯子4Exon4C(052)C(043)C(090)T(048)T(057)T(010)G4293A外顯子4Exon4G(100)G(097)G(037)A(000)A(003)A(063)

表4DRA基因3個(gè)SNP位點(diǎn)單倍型構(gòu)建及頻率

Table 4 Haplotype frequency of three SNP sites inDRAgene

單倍型HaplotypeA3093CA4167GG4293A頻率FrequencyH1AAG025H2AAA005H3AGG021H4CAG012H5CAA018H6CGG021

(表5)，其中A4167G和G4293A之間的連鎖不平衡程度最高。

表5DRA基因3個(gè)SNP位點(diǎn)之間的連鎖不平衡參數(shù)估計(jì)

Table 5 Analysis into linkage disequilibrium parameters among three SNP sites inDRAgene

參數(shù)ParameterA3093C?A4167GA3093C?G4293AA4167G?G4293Ar2000100720151D′003305991

圖6 DRA基因各單倍型mRNA二級結(jié)構(gòu)Fig.6 Secondary structure of haplotypes in DRA gene

2.7DRA基因mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

預(yù)測野生型和本研究所構(gòu)建的單倍型的mRNA二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖6所示。野生型和H1的mRNA二級結(jié)構(gòu)自由能為-1 008.22 kJ·mol-1，H2和H3自由能有所增大，分別為-1 007.38和-1 006.96 kJ·mol-1，而H4、H5和H6自由能有所減小，H4和H5均為-1 011.98 kJ·mol-1，H6為-1 010.72 kJ·mol-1。

2.8 DRA蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

DRA基因各單倍型蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果見表6。由表中數(shù)據(jù)可知，無規(guī)則卷曲是所有單倍型DRA蛋白二級結(jié)構(gòu)中的主要元件，與野生型蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相比，H4結(jié)構(gòu)中各組成沒有變化，H2和H5的延伸鏈比例降低而無規(guī)則卷曲比例增大，H3和H6的α螺旋比例增大而延伸鏈比例降低。DRA基因各單倍型蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖7所示，各單倍型三級結(jié)構(gòu)與野生型并不能完全重合，存在一定的差異。

表6DRA基因各單倍型蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

Table 6 Putative results of secondary structure of DRA protein before and after mutation

突變位點(diǎn)Mutationsiteα螺旋Alphahelix/%延伸鏈Extendedstrand/%β轉(zhuǎn)角Betaturn/%無規(guī)則卷曲Randomcoil/%野生型Wildtype/H1246030568733611H2246030168733651H3254029768733611H4246030568733611H5246030168733651H6254029768733611

螺旋狀, α-螺旋; 片狀, β-折疊; 線形, β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲Heliciform, alpha helix; Sheet, β-sheet; Linear, beta turn and random coil圖7 DRA蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.7 Putative result of tertiary structure of DRA protein

3 討論

MHC基因的一個(gè)顯著特征就是具有高度多態(tài)性。多態(tài)性是指同一基因位點(diǎn)在同一隨機(jī)交配的群體中可存在兩個(gè)或兩個(gè)以上的等位基因，有時(shí)甚至可達(dá)到幾十個(gè)或者幾百個(gè)等位基因。MHC出現(xiàn)高度多態(tài)性的原因很多，如基因缺失、重復(fù)、倒位、顛倒、轉(zhuǎn)換等，突變基因可能經(jīng)過長期的自然選擇從而形成新的等位基因。SLA-DRB和DQB具有高度多態(tài)性，DQA屬于中度多態(tài)基因，而DRA基因的多態(tài)性較低[6]。迄今為止，MHC-IPD數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.ac.uk/ipd.htmL)收錄的SLA-DRA等位基因僅有13個(gè)。本研究在蕨麻豬DRA基因的外顯子1、2和4上分別檢測到1、1和4個(gè)SNP位點(diǎn)，而在八眉豬和甘肅黑豬3個(gè)外顯子上分別檢測到1、1和3個(gè)SNP位點(diǎn)，證實(shí)了DRA基因較低的多態(tài)性。與前人研究結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，本研究三個(gè)豬種DRA基因的SNP位點(diǎn)數(shù)均少于杜洛克、大白豬、長白豬和煙臺(tái)黑豬[9-11]，由此可見，八眉豬、蕨麻豬和甘肅黑豬DRA基因的多態(tài)性低于其他品種豬。

對豬SLA-DRA基因外顯子區(qū)域SNP位點(diǎn)的檢測有助于分析核苷酸突變對該基因功能的影響?；蛲怙@子區(qū)域的核苷酸突變可以導(dǎo)致氨基酸發(fā)生變化，從而可能影響該基因的功能，單個(gè)氨基酸的改變就能影響跨膜蛋白的功能[18]。SLA-DRA外顯子2的A3093C突變以及外顯子4上的A4167G和G4293A突變?yōu)殄e(cuò)義突變，分別導(dǎo)致甲硫氨酸(極性中性氨基酸)變?yōu)榱涟彼?非極性疏水性氨基酸)、谷氨酰胺(極性中性氨基酸)變?yōu)榈木彼?堿性氨基酸)以及精氨酸變?yōu)榻M氨酸，這些氨基酸性質(zhì)的改變有可能最終導(dǎo)致DRA蛋白的某些功能發(fā)生變化。

真核生物基因的外顯子編碼蛋白質(zhì)，外顯子序列上核苷酸突變可能引起mRNA二級結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)和功能[19]。對SLA-DRA基因錯(cuò)義突變SNP位點(diǎn)構(gòu)建的單倍型mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，單倍型H2和H3的mRNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變小，而H4、H5和H6的mRNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變大，由此可見，G4293A和A4167G突變降低了DRA基因mRNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，而A3093C突變增強(qiáng)了DRA基因mRNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，且A3093C突變對mRNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的增強(qiáng)作用高于G4293A和A4167G突變降低作用。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，單倍型H4蛋白二級結(jié)構(gòu)與野生型相同，而H2、H3、H5和H6的蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，由此可見，DRA基因外顯子2的A3093C突變并未改變蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)組成，而外顯子4的A4167G和G4293A突變均對蛋白二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，研究表明，SLAⅡ類基因α鏈的外顯子4編碼跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)[4]，DRA基因外顯子4結(jié)構(gòu)的改變有可能影響細(xì)胞的抗原呈遞和免疫應(yīng)答，從而影響機(jī)體對某些疾病的抵抗力。各單倍型間的DRA蛋白三級結(jié)構(gòu)存在差異，進(jìn)一步表明，DRA基因外顯子上的SNP位點(diǎn)可能影響到蛋白質(zhì)的某些生物學(xué)功能。

本研究篩選出的DRA基因3個(gè)SNP錯(cuò)義位點(diǎn)可作為影響豬疾病的候選分子標(biāo)記，為進(jìn)一步研究DRA基因?qū)ωi某些疾病的調(diào)節(jié)作用提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)，后期應(yīng)進(jìn)一步分析DRA基因SNP位點(diǎn)與豬疾病的關(guān)聯(lián)性，探討該基因?qū)ωi疾病的調(diào)控作用。

[1] MORRIS A， HEWITT C， YOUNG S. The major histocompatibility complex: Its genes and their roles in antigen presentation[J].MolecularAspectsofMedicine， 1994， 15(5)：377-503.

[2] SMITH T P， ROHRER G A， ALEXANDER L J， et al. Directed integration of the physical and genetic linkage maps of swine chromosome 7 reveals that the SLA spans the centromere[J].GenomeResearch， 1995， 5(3)：259-271.

[3] GEFFROTIN C， POPESCU C P， CRIBIU E P， et al. Assignment of MHC in swine to chromosome 7 by in situ hybridization and serological typing[J].Annalesdegenetique， 1984， 27(4)：213-219.

[4] LUNNEY J K， HO C S， WYSOCKI M， et al. Molecular genetics of the swine major histocompatibility complex， the SLA complex[J].DevelopmentalandComparativeImmunology， 2009， 33(3， SI)：362-374.

[5] SACHS D H， GERMANA S， EL-GAMIL M， et al. Class II genes of miniature swine[J].Immunogenetics，1988， 28(1)：22-29.

[6] CHARDON P， RENARD C， VAIMAN M. The major histocompatibility complex in swine[J].ImmunologicalReviews， 1999， 167(1)：179-192.

[7] NIELSEN V H， THOMSEN B. PvuII RFLPs at SLA class II loci:DQAandDRA[J].AnimalGenetics， 1997， 28(2)：151.

[8] 孫俊麗 牟玉蓮， 顧茂松， 等. 五指山豬近交系群體中DRA和DRB基因的SSCP檢測[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2005， 33(8)：1458-1461. SUN J L， MOU Y L， GU M S， et al. Characterization ofSLA-DRADRBgene in inbreed line of WZSP group by SSCP[J].JournalofAnhuiAgricultureScience， 2005， 33 (8)：1458-1461. (in Chinese with English abstract)

[9] YANG Q L， ZHAO S G， WANG D W， et al. Association between genetic polymorphism in the swine leukocyte antigen-DRAgene and piglet diarrhea in three Chinese pig breeds[J].Asian-AustralasianJournalofAnimalSciences， 2014， 27(9)：1228-1235.

[10] YANG Q L， HUANG X Y， YUAN J H， et al. Polymorphisms in theSLA-DQAandDRAgene exon 2 and their association with piglet diarrhea in Chinese Yantai Black pig[J].PhilippineAgriculturalScientist， 2015， 98(3)：253-261.

[11] HUANG X， YANG Q， YUAN J， et al. Effect of genetic diversity in swine leukocyte antigen-DRAgene on piglet diarrhea[J].Genes， 2016， 7(7): 36.

[12] DILLENDER M J， LUNNEY J K. Characteristics of T lymphocyte cell lines established from NIH minipigs challenge inoculated withTrichinellaspiralis[J].Veterinaryimmunologyandimmunopathology， 1993， 35(3)：301-319.

[13] 金麗， 譚小音， 母童， 等. 八眉豬SLA-DRA基因第2外顯子多態(tài)性分析[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2016， 28(6): 922-927. JIN L， TAN X Y， MU T， et al. Polymorphism ofSLA-DRAexon 2 in Bamei pigs[J].ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016， 28(6)：922-927. (in Chinese with English abstract)

[14] 劉麗霞， 張麗， 趙生國， 等. 八眉豬DRA基因編碼區(qū)多態(tài)性及生物信息學(xué)分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)， 2015，30(4)：66-71. LIU L X， ZHANG L， ZHAO S G， et al. Cloning and bioinformatics analysis on coding regions ofDRAgene in Bamei pigs[J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica， 2015，30(4)：66-71. (in Chinese with English abstract)

[15] 冶占順， 包淑英. 八眉豬的保種與利用[J]. 中國畜牧獸醫(yī)， 2008， 35(9)：148-150. YE Z S， BAO S Y. Storage and utilization of Bamei pig[J].ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine， 2008， 35(9)：148-150. (in Chinese)

[16] 楊具田， 臧榮鑫， 盧建雄. 蕨麻豬種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用[J]. 畜牧與獸醫(yī)， 2003， 35(12)：15-16. YANG J T， ZANG R X， LU J X. Protection and utilization of germplasm resources in Juema pig[J].AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine， 2003， 35(12):15-16. (in Chinese)

[17] 雨林. 甘肅黑豬品種培育成功[J]. 甘肅畜牧獸醫(yī)， 1986(1)：48. YU L. Gansu black pig is breed successfully[J].GansuAnimalandVeterinarySciences， 1986(1)：48. (in Chinese)

[18] 楊巧麗， 孔晶晶， 趙生國， 等. 豬SLA-DRA基因外顯子 2 多態(tài)性及其與仔豬腹瀉的關(guān)聯(lián)分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2012， 43(7)：1020-1027. YANG Q L， KONG J J， ZHAO S G， et al. Polymorphism ofSLA-DRAgene exon 2 and its correlation with piglet diarrhea[J].ChineseJournalofAnimalandVeterinarySciences， 2012， 43(7): 1020-1027. (in Chinese with English abstract)

[19] 顧麗菊， 任麗群， 燕志宏， 等. 宗地花豬和從江香豬ADRP基因多態(tài)性及生物信息學(xué)分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2015， 34(11)：2395-2401. GU L J， REN L Q， YAN Z H， et al. Polymorphism and bioinformatics analysis ofADRPgene in pigs of Zongdihua and Congjiangxiang[J].GenomicsandAppliedBiology， 2015， 34(11)：2395-2401. (in Chinese with English abstract)

(責(zé)任編輯 盧福莊)

SNP screening and bioinformatics analysis ofSLA-DRAgene in pigs

LIU Lixia， ZHANG Li， TIAN Xiaojing， CHEN Hong， CUN Haixia， JIN Li， TAN Xiaoyin， XIE Deqiong

(CollegeofLifeScienceandEngineering，NorthwestUniversityforNationalities，Lanzhou730030，China)

The single nucleotide polymorphism (SNP) site of four exons ofSLA-DRAgene in Bamei， Juema and Gansu Black pigs were screened via polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) and DNA sequencing analysis， and further secondary structure of mRNA， secondary and tertiary structures of DRA protein were predicted through the bioinformatics tools. The results showed that 6 SNP sites were detected， including A177G， located in exon 1， A3093C, located in exon 2， A4167G, A4246G， C4282T and G4293A， located in exon 4， and among these SNP sites， A3093C， A4167G and G4293A were missense mutation， A3093C led to methionine (Met) into leucine (Leu)， A4167G led to glutamine (Gln) into arginine (Arg)， and G4293A led to arginine (Arg) into histidine (His). Based on the 3 missense SNPs， 6 haplotypes were constructed， in which H1， H3 and H6 were the main haplotypes with frequencies 0.25， 0.21 and 0.21， respectively. The results of bioinformatics showed that secondary structure of mRNA， secondary and tertiary protein structures ofDRAhaplotypes in three pigs were different from those in wild type. The consequence would provide basis for study of breed conservation and molecular breeding in disease resistance for Bamei， Juema and Gansu Black pigs.

pig;SLA-DRA; SNP site; bioinformatics

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.07.04

2016-11-16

甘肅省農(nóng)牧廳生物技術(shù)專項(xiàng)(GNSW-2008-04)；西北民族大學(xué)引進(jìn)人才項(xiàng)目(xbmuyjrc201408)；西北民族大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(31920170029)

劉麗霞(1983—)，女，甘肅隴南人，博士，高級實(shí)驗(yàn)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究。E-mail: skllx@xbmu.edu.cn

S852.4；Q751

A

1004-1524(2017)07-1077-09

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(7): 1077-1085

劉麗霞，張麗，田曉靜，等. 豬SLA-DRA基因SNP位點(diǎn)篩選及其生物信息學(xué)分析[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2017，28(7): 1077-1085.