齊口裂腹魚感染嗜水氣單胞菌后血液生化指標(biāo)與組織病理學(xué)研究

羅 輝，楊月靜，向夢(mèng)斌，葉 華，鄭曙明，王曉清

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.西南大學(xué)魚類繁育與健康養(yǎng)殖研究中心，重慶 402460；3.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德 415000)

齊口裂腹魚感染嗜水氣單胞菌后血液生化指標(biāo)與組織病理學(xué)研究

羅 輝1,2,3，楊月靜2，向夢(mèng)斌2，葉 華2，鄭曙明2，王曉清1,3

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.西南大學(xué)魚類繁育與健康養(yǎng)殖研究中心，重慶 402460；3.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德 415000)

為了研究嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)對(duì)齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)血液生理生化指標(biāo)的影響，將180尾齊口裂腹魚平均分成6組(4、24和48 h對(duì)照組；4、24和48 h感染組)。對(duì)照組腹腔注射0.2 mL 0.65%的無(wú)菌生理鹽水，感染組腹腔注射0.2 mL 2.5×107CFU/mL的嗜水氣單胞菌液。分別測(cè)定4、24和48 h對(duì)照組和感染組齊口裂腹魚各項(xiàng)血液生理生化指標(biāo)，并對(duì)腎臟、肝臟和肌肉組織進(jìn)行病理學(xué)觀察。結(jié)果顯示：谷丙轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白、總膽固醇、葡萄糖、乳酸脫氫酶、鉀、鈉、氯、鈣和磷含量均有顯著變化。谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、總蛋白、球蛋白、甘油三酯則沒(méi)有受到顯著影響。由此可見(jiàn)，嗜水氣單胞菌感染后對(duì)齊口裂腹魚血液指標(biāo)產(chǎn)生了顯著的影響。對(duì)病魚的病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)病魚體表多處出現(xiàn)充血出血，潰瘍和腹水，尤其是肝臟、腎臟和肌肉組織均出現(xiàn)不同程度的損傷，變性和局部壞死。

齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)；嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)；血液生理生化指標(biāo)；組織病理

齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti(Tchang))是長(zhǎng)江上游著名的土著經(jīng)濟(jì)魚類，在分類上屬于鯉形目鯉科裂腹魚亞科裂腹魚屬。齊口裂腹魚為底棲性冷水魚類，其肉質(zhì)細(xì)嫩，肉味鮮美，極具商業(yè)價(jià)值[1]。其人工養(yǎng)殖和繁殖的相關(guān)研究在2001年取得初步成功后[2-4]，逐漸在四川、重慶、云南等地形成了規(guī)模養(yǎng)殖[5]。伴隨著養(yǎng)殖規(guī)模和密度的迅速擴(kuò)大，齊口裂腹魚的養(yǎng)殖業(yè)也飽受細(xì)菌和寄生蟲病的困擾，其中尤以嗜水氣單胞菌等為代表的細(xì)菌性疾病以其高致病性，高死亡率和難治愈性危害極大[6-10]。嗜水氣單胞菌曾在四川雅安和攀枝花等地惡性傳染，導(dǎo)致養(yǎng)殖魚30%～80%的感染，病魚體表嚴(yán)重?fù)p傷，肌肉潰爛，從而失去商品價(jià)值[8]。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是魚類常見(jiàn)的重要病原菌，可引起組織局部損傷、壞死、水腫、突眼、腹部膨脹、腹水、貧血以及內(nèi)臟器官損傷等多種癥狀，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[11,12]。研究表明嗜水氣單胞菌感染會(huì)引起水產(chǎn)動(dòng)物血液生理生化指標(biāo)發(fā)生變化，尤其對(duì)免疫功能和肝功能相關(guān)生化指標(biāo)產(chǎn)生顯著影響[5,13-14]。然而目前關(guān)于嗜水氣單胞菌感染后對(duì)齊口裂腹魚血液生化指標(biāo)和組織病理?yè)p傷影響的研究較少[5,15]。病原菌侵襲水生動(dòng)物后，在進(jìn)入體內(nèi)的最初0～24 h通常為其粘附宿主組織并緩慢擴(kuò)增期。在成功定植后，24～48 h即可達(dá)到指數(shù)增長(zhǎng)期，48 h以后細(xì)菌的增殖就進(jìn)入平臺(tái)期[16]。因此，如何在感染早期確診就顯得尤為重要，其研究成果對(duì)魚類的人工養(yǎng)殖和疾病防治更具指導(dǎo)意義。但嗜水氣單胞菌感染后在細(xì)菌緩慢擴(kuò)增期(0～24 h)和指數(shù)增長(zhǎng)期(24～48 h)對(duì)齊口裂腹魚血液生理生化指標(biāo)和組織病理學(xué)的影響仍未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)嗜水氣單胞菌感染后(0～48 h)齊口裂腹魚的外觀癥狀及組織病理學(xué)觀察，結(jié)合4、24和48 h三個(gè)時(shí)點(diǎn)分別設(shè)置感染組和對(duì)照組的齊口裂腹魚血液生理生化指標(biāo)的測(cè)定，初步探討了嗜水氣單胞菌對(duì)齊口裂腹魚組織損傷和血液生理生化指標(biāo)的影響。本研究可為齊口裂腹魚后續(xù)疾病防治、免疫機(jī)制和種質(zhì)資源保護(hù)等相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)積累。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)于2014年10—11月在西南大學(xué)魚類繁育與健康養(yǎng)殖研究中心進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)材料為人工養(yǎng)殖的齊口裂腹魚，體重(105±36)g，體長(zhǎng)(19±2)cm。試驗(yàn)魚經(jīng)過(guò)2周的暫養(yǎng)，停食1 d后選擇體質(zhì)健壯，反應(yīng)靈敏的個(gè)體進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，攻毒后停止飼喂。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)

本研究所用嗜水氣單胞菌為西南大學(xué)魚類繁育與健康養(yǎng)殖研究中心鑒定保存的菌株，分離自患典型細(xì)菌性敗血癥的南方鯰內(nèi)臟。將嗜水氣單胞菌菌株在LB培養(yǎng)基于28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，然后挑取單菌落于LB培養(yǎng)基，28 ℃，200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，取150 μL菌液涂布到無(wú)氨芐的LB固體培養(yǎng)基上，在28 ℃下培養(yǎng)6 h，用無(wú)菌生理鹽水收集菌液，用麥?zhǔn)媳葷岱y(cè)定細(xì)菌數(shù)量，再用無(wú)菌生理鹽水稀釋至2.5×107CFU/mL ，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 攻毒試驗(yàn)

選擇180尾健康無(wú)傷的暫養(yǎng)齊口裂腹魚，分成2組，每組3個(gè)重復(fù)(3個(gè)重復(fù)分別對(duì)應(yīng)取樣時(shí)間4、24和48 h)，每重復(fù)30尾魚。第一組為對(duì)照組，腹腔注射0.2 mL 0.65%的無(wú)菌生理鹽水；第二組為攻毒組，分別腹腔注射0.2 mL 2.5×107CFU/mL的嗜水氣單胞菌，每組注射結(jié)束后記錄時(shí)間。保持水溫在20 ℃±1 ℃，增氧機(jī)持續(xù)增氧。

1.2.3 樣品的采集與測(cè)定

在注射無(wú)菌生理鹽水或嗜水氣單胞菌后4、24和48 h分別在對(duì)應(yīng)重復(fù)組中隨機(jī)取5尾魚，用300 mg/L的MS222麻醉，用2 mL一次性無(wú)菌注射器尾靜脈取血，采血后測(cè)量體長(zhǎng)、體重，隨后迅速解剖魚體，取肌肉、肝臟和腎臟用于組織病理學(xué)觀察。血液迅速放入離心管內(nèi)，2 000 r/min離心10 min，用移液槍將上層澄清血液轉(zhuǎn)入PT離心管中備用。每尾魚的血液生化指標(biāo)及離子成分的測(cè)定采用北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒，在自動(dòng)生化分析儀(Beckman Coulter，USA)測(cè)定(其中酶活單位的定義為37 ℃條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol/L底物的酶量為1個(gè)酶活單位，即為U/L)。分別取對(duì)照組和有典型癥狀的齊口裂腹魚的肝臟、腎臟和肌肉組織，用Bouin氏液固定24小時(shí)，在經(jīng)過(guò)脫水和透明處理后用石蠟包埋。通過(guò)KD-202輪轉(zhuǎn)切片機(jī)切片后HE染色，用中性樹膠封片，在正置DPT2型OLMPUS顯微鏡拍攝系統(tǒng)下觀察并進(jìn)行顯微拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。對(duì)照組數(shù)據(jù)取注射無(wú)菌生理鹽水三個(gè)時(shí)點(diǎn)(4、24和48 h)的平均值，注射嗜水氣單胞菌的各時(shí)點(diǎn)數(shù)值經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理，公式為Y=個(gè)體某一指標(biāo)測(cè)定值 ×(對(duì)照組對(duì)應(yīng)指標(biāo)三個(gè)時(shí)點(diǎn)的平均值/單一時(shí)點(diǎn)某指標(biāo)平均值)。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析和Duncan法多重比較各組的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 攻毒后外觀癥狀

腹腔注射嗜水氣單胞菌后4 h觀察齊口裂腹魚與對(duì)照組無(wú)明顯差異，游動(dòng)正常，外觀無(wú)明顯癥狀。24 h開始出現(xiàn)明顯發(fā)病癥狀，主要表現(xiàn)為魚體發(fā)黑，體表粘液分泌增加，部分魚游動(dòng)急促，呼吸加快，繼而呆滯不動(dòng)，體表和鰭條基部可見(jiàn)充血發(fā)紅，并出現(xiàn)1尾死魚。48 h死魚數(shù)量增至15尾，魚體表出現(xiàn)潰瘍，充血更加明顯，病魚出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)失調(diào)，無(wú)法保持平衡。臨檢病魚可發(fā)現(xiàn)體表多處充血，體表粘液增多，眼球微微外凸，腹部膨大，腹壁變薄，上下頜及頤部嚴(yán)重充血(圖1)，鰭條及鰭條基部充血，肛門紅腫外凸。解剖后腹腔內(nèi)有大量黃色或帶血積水，肝、腎、脾等內(nèi)臟充血甚至腫脹，嚴(yán)重者腸出現(xiàn)糜爛(圖2)。

圖1 發(fā)病魚體表充血、潰瘍(←)Fig.1 Hyperemia and ulceration on the body surface of the diseased fish(←)

圖2 發(fā)病魚內(nèi)臟充血、腫脹(←)Fig.2 The diseased fish showed enlarged and reddened viscera(←)

2.2 嗜水氣單胞菌感染對(duì)齊口裂腹魚血液生化指標(biāo)的影響

嗜水氣單胞菌感染后齊口裂腹魚血液生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。感染組48 h齊口裂腹魚血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶濃度顯著高于對(duì)照組，同時(shí)也顯著高于4 h和24 h組。血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶濃度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，盡管24 h與4 h組之間差異不顯著，但升高的趨勢(shì)明顯。攻毒后4 h，齊口裂腹魚血清中白蛋白含量顯著低于對(duì)照組，也低于24 h和48 h組，但白蛋白隨著攻毒后時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高至與對(duì)照組差異不顯著的水平。攻毒的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清中總膽固醇含量與對(duì)照組相比，差異均不顯著，但4 h與48 h兩組間則差異顯著，從其變化規(guī)律可以看出，隨著攻毒后時(shí)間的延長(zhǎng)，血清中膽固醇含量逐漸回升，并在48 h時(shí)顯著高于4 h組，其余各組間則差異不顯著。攻毒后48 h血糖含量顯著低于對(duì)照組，其余兩組與對(duì)照組差異不顯著，且攻毒后血糖含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸降低，但相互之間沒(méi)有顯著差異。攻毒后各組乳酸脫氫酶含量與對(duì)照組差異均不顯著，但48 h組顯著高于24 h組。

攻毒后血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、總蛋白、球蛋白和甘油三酯的含量與對(duì)照組均無(wú)差異顯著性，且攻毒組各時(shí)點(diǎn)之間差異也不顯著。但從各指標(biāo)的數(shù)據(jù)可以看出，堿性磷酸酶、總蛋白和球蛋白在攻毒后存在一定的規(guī)律性變化，即在4 h時(shí)血清中含量最低，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，有逐漸升高的趨勢(shì)。而甘油三脂的變化則是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)有逐漸降低的趨勢(shì)。

表1 嗜水氣單胞菌對(duì)齊口裂腹魚血液生化指標(biāo)的影響Tab.1 Effect of A.hydrophila on blood biochemical indices of S.prenanti

注：同一行數(shù)據(jù)不同上標(biāo)字母表示差異顯著(P<0.05)。表2同。

2.3 嗜水氣單胞菌感染對(duì)齊口裂腹魚血液離子水平的影響

嗜水氣單胞菌感染后齊口裂腹魚血液離子水平的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。攻毒后血液中的離子含量均發(fā)生了顯著變化。其中鉀、鈉和氯離子有相似的變化規(guī)律，攻毒后24 h鉀離子濃度顯著高于對(duì)照組，其余各組與對(duì)照組差異不顯著。而鈉離子則是在攻毒后4 h顯著升高，24 h和48 h血中鈉離子水平有所回落，與對(duì)照組差異不顯著。血清中氯離子濃度也在攻毒后4 h顯著高于對(duì)照組，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其含量又逐漸降低至對(duì)照組相近水平，最終在24 h和48 h時(shí)與對(duì)照組差異不顯著。血清中鈣離子和磷離子的變化趨勢(shì)類似，即在攻毒后4 h血清中含量顯著低于對(duì)照組，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)又逐漸升高。其中鈣離子水平除在4 h時(shí)顯著低于對(duì)照組外，24 h和48 h含量升高，與對(duì)照組差異不顯著。磷離子水平則是4 h時(shí)顯著低于對(duì)照組，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，并在48 h時(shí)顯著高于對(duì)照組。

表2 嗜水氣單胞菌對(duì)齊口裂腹魚血液離子水平的影響Tab.2 Effect of A.hydrophila on concentration of ion in blood of S.prenanti

2.4 組織病理變化

齊口裂腹魚感染嗜水氣單胞菌的病理學(xué)變化主要表現(xiàn)為機(jī)體多組織器官充血出血，腫脹，細(xì)胞壞死、變性，并伴有炎癥。對(duì)照組肌肉組織中肌細(xì)胞排列緊密，條紋清晰，細(xì)胞核位于細(xì)胞邊緣。病魚肌細(xì)胞著色不均，部分區(qū)域肌漿溶解，肌原纖維斷裂、彎曲不齊，肌纖維間隙增大(圖3)。對(duì)照組腎臟腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎間質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)充滿紅細(xì)胞，各細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。病魚腎臟的腎小管上皮細(xì)胞排列松散，管腔結(jié)構(gòu)不清晰，腎間質(zhì)出血，伴有嗜中性白細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4)。對(duì)照組肝臟肝細(xì)胞界限清晰，細(xì)胞核圓形深染，位于細(xì)胞一側(cè)，胞漿不著色空泡化。病魚肝細(xì)胞嚴(yán)重空泡變性，細(xì)胞核崩解，細(xì)胞融合、界限消失，少數(shù)肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死(圖5-6)。

圖3 病魚肌細(xì)胞著色不均， 部分區(qū)域肌漿溶解，肌原纖維斷裂(←)Fig.3 The myocytes of disease fish showed uneven coloring, the sarcoplasm dissolved,the myofibril ruptured

圖4 病魚腎小管上皮細(xì)胞 排列松散(←)，管腔結(jié)構(gòu)不清，腎間質(zhì)出血Fig.4 The tubular epithelial cells arranged in loose,the lumen structure is unclear,the renal interstitium suffer a hemorrhage

圖5 病魚肝細(xì)胞空泡變性，局部區(qū)域出現(xiàn)壞死(←)Fig.5 Liver cells of diseased fish were vacuolar degeneration and necrosis in local area(←)

3 討論

3.1 嗜水氣單胞菌對(duì)齊口裂腹魚的致病性

過(guò)去通常認(rèn)為致病性嗜水氣單胞菌是條件性致病菌，但近年來(lái)的研究表明其更可能是原發(fā)性致病菌[7,17]，并已發(fā)展成為水產(chǎn)養(yǎng)殖的一大殺手，給我國(guó)鯉 (Cyprinuscarpio)、鯽 (Carassiusauratus)、黃鱔(Monopterusalbus)、香魚(Plecoglossusaltivelis)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、鱸 (Micropterussalmoides)、鰻鱺(Anguillajaponica)、白斑狗魚(Esoxlucius)、牛蛙(Ranacatesbeiana)、鱉(Trionyxsinensis)等水產(chǎn)動(dòng)物的養(yǎng)殖帶來(lái)了嚴(yán)重的損失[17-23]。本實(shí)驗(yàn)使用嗜水氣單胞菌人工感染齊口裂腹魚，導(dǎo)致其在24 h全身充血出血，48 h明顯出現(xiàn)眼球突出、潰瘍等癥狀，甚至死亡，與文獻(xiàn)報(bào)道的齊口裂腹魚自然感染癥狀相似[7,8]，同時(shí)與其他淡水魚類爆發(fā)嗜水氣單胞菌病的癥狀也有諸多相似之處[17,22-23]。

3.2 嗜水氣單胞菌對(duì)齊口裂腹魚血液生化指標(biāo)和組織器官的影響

血液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶在正常情況下酶活低且相對(duì)恒定，但當(dāng)肝臟等組織受到損傷或受到環(huán)境脅迫時(shí)，血液中這兩種酶活將升高，二者在評(píng)估肝臟和其他器官的狀態(tài)方面起著重要的作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn)齊口裂腹魚感染嗜水氣單胞菌48 h時(shí)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶顯著高于對(duì)照組，同時(shí)發(fā)現(xiàn)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，在48 h時(shí)谷丙轉(zhuǎn)氨酶濃度比4 h時(shí)升高141%。從肝臟、腎臟和肌肉的病理切片可以看出病魚肝臟受損，肝細(xì)胞嚴(yán)重空泡變性，細(xì)胞核崩解，細(xì)胞融合、界限消失，少數(shù)肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死。腎臟和肌肉組織也受到破壞，腎間質(zhì)出血，伴有嗜中性白細(xì)胞浸潤(rùn)，病魚肌肉組織中肌漿溶解，肌原纖維斷裂、彎曲不齊，肌纖維間隙增大，提示血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的升高可能是肝臟等器官受損導(dǎo)致其分泌到血液中所致。這與大黃魚(Larimichthys crocea)感染哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)和歐洲鰻鱺患“狂游病”的研究結(jié)果類似[25,26]。

研究表明乳酸脫氫酶的含量與魚體肌肉組織的健康狀況有關(guān)[25,27]。徐曉津等[26]研究發(fā)現(xiàn)大黃魚感染哈維氏弧菌后病魚乳酸脫氫酶含量顯著升高，表明大黃魚肌肉組織受到破壞，這與大黃魚患病后產(chǎn)生皮膚潰瘍的癥狀相吻合。本研究發(fā)現(xiàn)盡管攻毒組在4 h和24 h時(shí)乳酸脫氫酶含量與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異，但48 h攻毒組則顯著高于對(duì)照組，并顯著高于24 h攻毒組。推測(cè)攻毒后魚體肌肉組織受損，產(chǎn)生了病變，這與肌肉病理切片發(fā)現(xiàn)病魚肌漿溶解，肌原纖維斷裂、彎曲不齊，肌纖維間隙增大的病理癥狀相吻合。有趣的是攻毒后24 h組乳酸脫氫酶含量與對(duì)照組和攻毒后4 h盡管沒(méi)有顯著差異，但卻有較明顯的下降趨勢(shì)，其中的原因有待進(jìn)一步深入研究。

血中葡萄糖是動(dòng)物機(jī)體生化活動(dòng)所需能量的來(lái)源之一，在正常生理狀態(tài)下，其含量相對(duì)恒定，但會(huì)隨著機(jī)體活動(dòng)和適應(yīng)環(huán)境因子的改變而變化。因此血糖含量可作為魚體響應(yīng)環(huán)境應(yīng)激因子的指示指標(biāo)[28]。本研究中，齊口裂腹魚感染嗜水氣單胞菌后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，血糖含量顯著下降，48 h組血糖含量顯著低于對(duì)照組。這可能是由于機(jī)體在病菌侵入后迅速調(diào)動(dòng)先天性免疫防疫機(jī)制以抵抗病原的粘附和增殖，從而消耗大量能量致使血液中血糖含量顯著下降。徐曉津等[26]在研究大黃魚(Larimichthyscrocea)感染哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)時(shí)，觀察到病魚血液中血糖含量顯著下降。余毅等[29]在患瘋狂病的白鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)血液指標(biāo)的研究中也發(fā)現(xiàn)病魚血糖含量顯著降低，與本研究的結(jié)果類似。

血清蛋白在維持血漿正常膠體滲透壓，對(duì)物質(zhì)的運(yùn)輸和體內(nèi)酸堿平衡方面都起到十分重要的作用。因此血清總蛋白、白蛋白和球蛋白含量也可以作為衡量魚類響應(yīng)外界應(yīng)激的重要參考指標(biāo)[20]。本研究中齊口裂腹魚感染嗜水氣單胞菌后血清總蛋白、球蛋白均沒(méi)有顯著變化，但白蛋白含量在4 h時(shí)顯著低于對(duì)照組。在24 h和48 h時(shí)血清中白蛋白含量有所回升，并與對(duì)照組差異不顯著?？偟鞍缀恳灿泄ザ竞蠼档?，隨后逐漸升高的趨勢(shì)。分析原因可能是由于機(jī)體在病原侵入機(jī)體后迅速動(dòng)用免疫防御機(jī)制對(duì)病原進(jìn)行清除，白蛋白作為載體在此過(guò)程中被迅速消耗，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，機(jī)體穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)使白蛋白的數(shù)量逐步恢復(fù)正常。強(qiáng)俊等[30]在研究海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)感染羅非魚(Oreochromisspp.)時(shí)也觀察到血清總蛋白、白蛋白和球蛋白從0～48 h期間經(jīng)歷了先降低后升高的變化，與本研究觀察到的現(xiàn)象類似。

3.3 嗜水氣單胞菌對(duì)齊口裂腹魚腎臟和血液離子水平的影響

魚類的腎臟不僅是重要的免疫器官，同時(shí)也是重要的排泄器官，對(duì)調(diào)節(jié)魚體滲透壓和水鹽平衡至關(guān)重要[31]。本研究中發(fā)現(xiàn)齊口裂腹魚腎臟明顯受損，腎小管上皮細(xì)胞排列松散，管腔結(jié)構(gòu)不清，腎間質(zhì)出血，并伴有嗜中性白細(xì)胞浸潤(rùn)。這必然影響魚體正常的生理代謝和免疫功能。本研究中發(fā)現(xiàn)Na+和Cl-含量在感染4 h時(shí)顯著升高，但隨后逐漸降低至與對(duì)照組差異不顯著。 K+含量也在24 h顯著升高，但在48 h也降低到與對(duì)照組差異不顯著的水平。分析可能是細(xì)菌攻擊宿主腎臟等組織，導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排，滲透性異常，從而使血中Na+、Cl-、K+濃度升高。同時(shí)細(xì)胞骨架重排等效應(yīng)是短暫且可逆的，重排的骨架蛋白在所附著的病菌下部短暫積聚，待病菌被細(xì)胞攝入后，骨架中的某些成分迅速解離，細(xì)胞骨架又恢復(fù)到穩(wěn)定平衡狀態(tài)[32]，從而使血清中離子濃度趨于正常。徐曉津等[26]在大黃魚感染哈維氏弧菌的研究中也發(fā)現(xiàn)血漿中K+和Cl-的濃度在感染后顯著升高，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

研究表明當(dāng)腎臟受損時(shí)，機(jī)體磷代謝就會(huì)出現(xiàn)異常。在人類慢性腎衰竭時(shí)，機(jī)體磷代謝發(fā)生紊亂，即出現(xiàn)血磷升高[33]。本研究中齊口裂腹魚感染后4 h血液中磷含量顯著低于對(duì)照組，而在48 h時(shí)顯著高于對(duì)照組。這可能是病原入侵機(jī)體后，磷首先作為ATP、核酸、磷脂、細(xì)胞膜和多種輔酶的重要組成成分，參與能量轉(zhuǎn)化等多種生理生化反應(yīng)而被消耗，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，病原對(duì)魚體腎臟的損害加劇，導(dǎo)致腎臟功能紊亂，磷排泄異常，致使磷在血液中積聚并迅速升高。腎臟病理切片結(jié)果顯示病魚腎小管上皮細(xì)胞排列松散，管腔結(jié)構(gòu)不清晰，腎間質(zhì)出血，伴有嗜中性白細(xì)胞浸潤(rùn)，這與血液磷水平的變化相吻合。本研究中發(fā)現(xiàn)齊口裂腹魚嗜水氣單胞菌感染后4 h血清中鈣含量顯著降低，隨后在24 h和48 h開始逐步升高并最終與對(duì)照組差異不顯著，但在攻毒后48 h血清鈣含量顯著高于4 h的鈣含量。這可能是由于病原菌感染后對(duì)多種組織器官產(chǎn)生了破壞作用，機(jī)體為了應(yīng)對(duì)病原菌的侵襲，需要激活多種抗菌相關(guān)酶類，從而導(dǎo)致機(jī)體動(dòng)用更多的Ca2+參與酶促反應(yīng)所致。

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(責(zé)任編輯：鄧 薇)

Blood biochemical indices and histopathology of theSchizothoraxprenantiduring early stage of infection byAeromonashydrophila

LUO Hui1,2,3,YANG Yue-jing2,XIANG Meng-bin2,YE Hua2,ZHENG Shu-ming2,WANG Xiao-qing1,3

(1.CollegeofAnimalScience&Technology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128;Hunan,China;2.FisheriesBreedingandHealthyCultivationResearchCentre，SouthwestUniversity，Chongqing402460,China;3.CollaborativeInnovationCenterforEfficientandHealthProductionofFisheriesinHunanProvince,Changde,415000，Hunan,China)

Schizothoraxprenanti(S.prenanti) is an indigenous fish species and distributed in the upstream regions of the Yangtze River and its tributaries in China.S.prenantihas important commercial value in the southwest of China because of its fleshness and good flavor as food fish.Concurrently,the wild resources and populations ofS.prenantihave rapidly declined because of water pollution and the construction of hydropower stations.In recent years,it has become one of the most important cold-water aquaculture species in China.However,overly dense stocking levels and rapid expansion of aquaculture has led to several problems affecting the sustainable development of the industry due to a frequent outbreak of infectious diseases.In order to study the effects ofAeromonashydrophila(A.hydrophila) on blood biochemical indices,one hundred and eighty juvenilesS.prenantiwith an initial weight of (105±36) g were used and randomly divided into 6 groups (4,24,and 48h controlled groups;4,24,and 48h challenged groups) with three timepoints of 30 fish.Fish used in both the controlled and challenged groups were intraperitoneally injected with equal volumes (0.2 mL) of sterile physiological saline (0.65%) and a bacterial suspension (2.5×107CFU/mL),respectively.From fish each group at 4，24 and 48 h timepoints post challenged,blood samples were collected to evaluate haematological biochemical indices and ion concentrations.The results showed that the activities of glutamic-pyruvic transaminase (ALT),albumin (ALB),total cholesterol (CHOL),blood glucose (GLU),lactic dehydrogenase (LDH),the concentration of potassium (K) ,sodium (Na),chlorine (Cl),calcium (Ca) and phosphorus (P) in infected groups was changed significantly.The activities of ALT increased significantly on 48 h after challenged,the concentration of ALB decreased significantly on 4 h after challenged,GLU decreased significantly on 48 h after challenged,the concentration of K increased significantly on 24 h after challenged,Na and Cl increased significantly on 4 h after challenged,Ca decreased significantly on 4 h and 24 h after challenged,P decreased significantly on 4 h,but increased significantly on 48 h after challenged.There were no significant differences in the level of aspartate aminotransferase (AST),alkaline phosphatase (ALP),total protein (TP),globulin (GLO),triglyceride (TG).Among the test indices,ALT,K,P was most affected byA.hydrophila,being able to the sensitive index ofS.prenantiafter infected.Histopathological examination showed hemorrhage,necrosis,edema and the inflammatory response in many organs,especially in liver,kidney,and muscle.In conclusion,A.hydrophilacould influence the blood biochemical indices ofS.prenanti,and destroy the liver,muscle,and kidney tissue ofS.prenanti.

Schizothoraxprenanti;Aeromonashydrophila;blood biochemical indices;histopathology

2016-10-20；

2017-04-21

湖南省教育廳資助科研項(xiàng)目(15A087)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31402302)；中央高?；緲I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(XDJK2015C034，XDJK2014C152)；西南大學(xué)榮昌校區(qū)科研啟動(dòng)專項(xiàng)資金(20700208,20700918)

羅 輝(1979-)，男，博士，講師，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種與生物技術(shù)研究。E-mail:luohui2629@126.com

鄭曙明，E-mail:zhsm199@163.com；王曉清，E-mail: wangxiao8258@126.com

S941.4

A

1000-6907-(2017)04-0044-07