稻田養(yǎng)殖沙塘鱧對(duì)稻田水體及底泥微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響

趙翔剛，羅 衡，劉其根，趙良杰，蔡林榮，戴亮亮，張 真

(上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)種質(zhì)資源與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

稻田養(yǎng)殖沙塘鱧對(duì)稻田水體及底泥微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響

趙翔剛，羅 衡，劉其根，趙良杰，蔡林榮，戴亮亮，張 真

(上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)種質(zhì)資源與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

為了研究養(yǎng)殖沙塘鱧(Odontobutisobscurus)對(duì)稻田水體及底泥的微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響，2015年于浙江海鹽江南四阡現(xiàn)代農(nóng)業(yè)公司進(jìn)行了沙塘鱧的稻田養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)，利用DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)技術(shù)對(duì)養(yǎng)殖過(guò)程中的稻田水體及底泥中細(xì)菌的16S rDNA片段進(jìn)行指紋圖譜分析。DGGE條帶測(cè)序分析結(jié)果顯示：稻田水體及底泥共檢測(cè)到包括α-變形菌亞門(Alphaproteobacteria)、β-變形菌亞門(Betaproteobacteria)、γ-變形菌亞門(Gammaproteobacteria)、δ-變形菌亞門(Deltaproteobacteria)、ε-變形菌亞門(Epsilonproteobacteria)、綠菌門(Chlorobi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)等細(xì)菌門類。多樣性分析結(jié)果顯示，養(yǎng)殖沙塘鱧的稻田底泥微生物DGGE條帶數(shù)多于常規(guī)養(yǎng)殖稻田，養(yǎng)殖稻田的底泥Shannon多樣性指數(shù)2.86，顯著高于常規(guī)稻田的2.27，同時(shí)養(yǎng)殖稻田養(yǎng)殖溝底泥的Shannon多樣性指數(shù)隨養(yǎng)殖時(shí)間由2.56變化到2.16。PCA(Principal Component Analysis)及DGGE聚類分析結(jié)果顯示，養(yǎng)殖稻田的水體及底泥微生物群落結(jié)構(gòu)與常規(guī)稻田存在較大差異。結(jié)果表明，稻田養(yǎng)殖環(huán)境的微生態(tài)條件可能優(yōu)于常規(guī)稻田。

稻田養(yǎng)魚；DGGE;沙塘鱧(Odontobutisobscurus)

我國(guó)在稻田養(yǎng)魚有著悠久的歷史，人們利用稻田的水環(huán)境，并對(duì)其加以改造，在種植水稻的同時(shí)養(yǎng)殖水產(chǎn)品，一方面使稻田的水資源、雜草、水生動(dòng)物、昆蟲等資源被充分利用，另一方面通過(guò)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的活動(dòng)達(dá)到給稻田除草、增肥及滅蟲的效果，合理地改善了水稻的生長(zhǎng)發(fā)育條件，促進(jìn)了稻谷的生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)稻魚雙豐收的目標(biāo)[1]。謝建等[2]的調(diào)查表明，稻田養(yǎng)魚模式相較于傳統(tǒng)稻田可以減少68%的農(nóng)藥及24%的化肥使用量，稻魚互利共生，魚的活動(dòng)可以減少水稻蟲害而稻田也相應(yīng)的為養(yǎng)殖魚類提供適合的生長(zhǎng)環(huán)境，并降低N、P對(duì)環(huán)境的污染。俞水炎等[3]研究表明，稻田放養(yǎng)草魚、鯉、尼羅羅非魚后,對(duì)早稻第3代白背飛虱的蟲口能減少34.48%～74.31%,晚稻第5代褐飛虱可減少51.23%～55.49%,早稻2代二化螟下降44.26～51.10%,早稻紋枯病減輕42.65%～59.91%。并可基本控制本田期萌生稗草、牛毛氈、矮慈菇等19種雜草。林傳政等[4]研究顯示，不同稻魚共生方式對(duì)中稻、再生稻主要農(nóng)藝性狀及稻、魚產(chǎn)量有影響。平作稻養(yǎng)魚和平作稻凼式養(yǎng)魚共生方式水稻單產(chǎn)能保持平作稻產(chǎn)量水平，增收魚53.6～69.4 kg/667 m2，增加純收益745～780元/667m2；壟稻溝魚共生方式水稻單產(chǎn)比平作稻增產(chǎn)9.13%，增收魚66.9 kg/667m2，增加純收益1 040元/667m2。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外大多數(shù)的研究主要集中于稻魚共生互利機(jī)制、稻田養(yǎng)殖病蟲害控制及經(jīng)濟(jì)效益等機(jī)關(guān)研究，而國(guó)內(nèi)對(duì)于稻魚共生系統(tǒng)中養(yǎng)殖生物對(duì)微生物的影響的研究鮮見(jiàn)。

眾所周知，細(xì)菌既是分解者，又可作為水生生物的間接或直接餌料，與此同時(shí)，水體中細(xì)菌對(duì)腐質(zhì)碳的礦化作用在水體碳循環(huán)中也起著重要作用[5]。大量實(shí)驗(yàn)證明，稻田土壤微生物群落在推動(dòng)土壤有機(jī)質(zhì)積累、轉(zhuǎn)換、礦化及N的釋放過(guò)程中扮演著十分重要的角色[6]。田相利等[7]研究發(fā)現(xiàn)草魚(Ctenopharyngodonidellus)、鰱(Hypophythalmichthysmolitrix)和鯉魚(Cyprinuscarpio)的三元合理混養(yǎng)使得系統(tǒng)中微生物的結(jié)構(gòu)和功能得到優(yōu)化，細(xì)菌群落的組成與代謝功能更趨于豐富化和多樣化。鑒于微生物在生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用，深入研究不同養(yǎng)殖模式下環(huán)境中微生物數(shù)量和功能，對(duì)于進(jìn)一步理解微生物在人工生態(tài)系統(tǒng)中的作用及其機(jī)制具有十分重要的意義[8]。

沙塘鱧(Odontobutisobscurus)隸屬鱸形目(Perci-formes)虎魚亞目(Gobioidei)沙塘鱧科(Odontobuti-dae),為東亞特有的小型淡水底棲肉食性魚類,特別是在江浙地區(qū)為傳統(tǒng)的名貴食用魚，具有較高的漁業(yè)價(jià)值[9]。目前稻田養(yǎng)殖沙塘鱧的研究報(bào)道鮮見(jiàn)。本研究基于DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)分子技術(shù)對(duì)稻田養(yǎng)殖沙塘鱧對(duì)稻田水體及底泥微生物的影響進(jìn)行探究，以期為研究稻田沙塘鱧種養(yǎng)模式優(yōu)化、了解共生機(jī)制提供理論依據(jù)，為后續(xù)研究稻田養(yǎng)殖沙塘鱧的研究者提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)了六個(gè)實(shí)驗(yàn)田，其中四個(gè)為稻田養(yǎng)殖沙塘鱧組，其余兩個(gè)為常規(guī)稻田組，六個(gè)稻田面積均為6 670 m2，養(yǎng)殖沙塘鱧的稻田四周具有環(huán)溝，寬度為3.5 m，深0.8 m，稻田內(nèi)部有三條縱溝，長(zhǎng)40 m，寬3 m，深0.7 m，常規(guī)稻田無(wú)溝。四個(gè)養(yǎng)殖稻田均放養(yǎng)密度為0.5尾/m2，養(yǎng)殖規(guī)格為平均2 cm/尾的沙塘鱧。除此之外，養(yǎng)殖稻田每畝還增加放養(yǎng)了規(guī)格為3～4 cm/尾的抱卵青蝦1.5 kg。養(yǎng)殖過(guò)程中不使用化肥及農(nóng)藥。

1.2 樣品采集及處理

分別于7月、9月、10月進(jìn)行樣品的采集，水樣采用5 L的采水器于水面下方0.2 m處采集，分為七個(gè)采集點(diǎn)，均為每條養(yǎng)殖溝的中部位置，七個(gè)點(diǎn)混合在無(wú)菌桶內(nèi)用500 mL的無(wú)菌瓶進(jìn)行收集，泥樣采集在稻田中隨機(jī)采集7個(gè)點(diǎn)的稻田表層泥及于養(yǎng)殖溝中7個(gè)點(diǎn)采集水底表層泥，裝入無(wú)菌收集瓶?jī)?nèi)，樣品采集后，保存于-20 ℃冰箱。水體樣品采用0.22 μm濾膜進(jìn)行抽濾，抽樣體積為200 mL。在實(shí)驗(yàn)室中將四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的底泥樣品進(jìn)行充分混勻，最終每次采樣得到三個(gè)待測(cè)樣品，G#(養(yǎng)魚稻田溝中樣品)D#(養(yǎng)魚稻田樣品)K#(常規(guī)稻田樣品)，按次序分別記錄為第一次(G1#、D1#、K1#)、第二次(G2#、D2#、K2#)、第三次(G3#、D3#、K3#)采樣。水樣以s表示，泥樣以n表示。

1.3 樣品DNA提取

泥樣中微生物DNA的提取利用上海博彩生物科技公司的土壤DNA抽提試劑盒進(jìn)行提取，水樣中微生物DNA的提取，首先用滅菌的剪刀及鑷子將濾膜充分剪碎，置于1.5 mL滅菌的離心管中，接下來(lái)利用上海博彩生物科技公司的3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒V2.2進(jìn)行樣品DNA的提取。

1.4 PCR反應(yīng)及DGGE電泳

本實(shí)驗(yàn)中，擴(kuò)增的DNA片段為細(xì)菌的16S部分序列，引物為357F-GC-clamp和518R[10],擴(kuò)增長(zhǎng)度為220～230 bp，使用Peltier Thermal Cycle-200 PCR儀完成，模式為降落PCR(touchdown-PCR,td-PCR)[11]。反應(yīng)體系為50 μL，包括引物357F-GC-clamp 1 μL，518R 1 μL，dNTP 1 μL，10×Buffer 5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 40.5 μL，DNA模板1 μL。反應(yīng)程序設(shè)定：95 ℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，65 ℃退火1 min(每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5 ℃直至55 ℃)，72 ℃延伸30 s，以上進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，此過(guò)程進(jìn)行15個(gè)循環(huán)，72 ℃最終延伸8 min，產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

利用美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)的D-code System電泳儀進(jìn)行DGGE分離實(shí)驗(yàn)，DGGE條帶的切割和擴(kuò)增；DNA載體連接、轉(zhuǎn)化；細(xì)菌群落的挑選方法等參考唐永濤等[12]的實(shí)驗(yàn)。

1.4 分析方法及運(yùn)用的公式

數(shù)據(jù)處理利用BIO-RAD Quantity One 4.6.2軟件，PCA分析利用SPSS、EXCEL軟件，微生物的多樣性指數(shù)以條帶數(shù)目S、Shannon多樣性指數(shù)H、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)λ、Margalef豐富度指數(shù)R及Pielou均勻度指數(shù)J為參考進(jìn)行計(jì)算，以下為各指數(shù)計(jì)算方法：

H=-∑[(ni/N)ln(ni/N)]

λ=∑[ni(ni-1)/N(N-1)]

R=(S-1)/lnLN

J=H/lnLS

注：S為每個(gè)電泳條帶中光亮的條帶數(shù)；ni為第i個(gè)條帶的光密度值；N為某一電泳條帶的總的光密度。

2 結(jié)果

2.1 微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性統(tǒng)計(jì)分析

2.1.1 不同樣品的多樣性指數(shù)

泥樣G1n#、G2n#、G3n#的平均Shannon多樣性指數(shù)H為2.25，D1n#、D2n#、D3n#的平均Shannon多樣性指數(shù)H為2.86，K1n#、K2n#、K3n#的平均Shannon多樣性指數(shù)H為2.27。水樣G1s#、G2s#、G3s#的平均Shannon多樣性指數(shù)H為2.22，D1s#、D2s#、D3s#的平均Shannon多樣性指數(shù)H為2.34，K1s#、K2s#、K3s#的平均Shannon多樣性指數(shù)H為2.36。Shannon多樣性指數(shù)HG1s#>G2s#>G3s#，D2s#>D3s#>D1s#,K2s#>K3s#=K1s#(表1)。

表1 不同樣品的多樣性指數(shù)Tab.1 Diversity index of different samples

2.1.2 DGGE聚類分析

2.1.2.1 泥樣聚類分析

根據(jù)泥樣聚類分析圖(圖1)可以看出，G1n#、G2n#、G3n#聚在一起，D1n#、D2n#、D3n#聚在一起，K1n#、K2n#、K3n#聚在一起，可以看出三次采樣養(yǎng)殖稻田底泥、常規(guī)稻田底泥、養(yǎng)殖稻田溝底泥都各自具有較高的相似性，且表現(xiàn)出空間距離差異，不同地點(diǎn)采集的樣品聚類距離較遠(yuǎn)。

圖1 泥樣聚類分析Fig.1 Cluster analysis of mud samples

2.1.2.2 水樣聚類分析

從圖2中可以明顯看出采樣初期G1s#、K1s#、D1s#具有較高的微生物群落結(jié)構(gòu)相似性，三者聚在一起。第二次采樣G2s#、D2s#、K2s#三者距離相對(duì)較遠(yuǎn)，表現(xiàn)出空間上的差異，說(shuō)明隨著養(yǎng)殖的進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)分化。后期采樣聚類結(jié)果同樣表現(xiàn)出空間差異，G3s#與D3s#相聚較近，與K3s#距離較遠(yuǎn)，到養(yǎng)殖后期養(yǎng)殖稻田水與養(yǎng)殖稻田溝中水的微生物群落結(jié)構(gòu)相似性較大，而與常規(guī)稻田則相似性較低。另外，聚類還顯示，G1s#與G2s#、G3s#距離較近，而D1s#與D2s#、D3s#距離較遠(yuǎn)，K1s#與K2s#、K3s#亦距離較遠(yuǎn)，可以看出隨著養(yǎng)殖時(shí)間推移，養(yǎng)殖稻田溝微生物群落結(jié)構(gòu)相似性較高，系統(tǒng)穩(wěn)定。而養(yǎng)殖稻田及常規(guī)稻田的微生物群落結(jié)構(gòu)則發(fā)生變化，到后期趨于穩(wěn)定。

圖2 水樣聚類分析Fig.2 Cluster analysis of water samples

2.1.3 PCA分析

2.1.3.1 泥樣PCA分析

通過(guò)主成分分析法根據(jù)各條帶因子得分系數(shù)利用PC1、PC2這兩個(gè)占比超過(guò)50%的主成分因子構(gòu)建PCA二維圖，從圖3中可以看出，三次采樣養(yǎng)殖稻田底泥、養(yǎng)殖稻田溝底泥、常規(guī)稻田底泥均各自聚集在一起，位置很接近。而每一次采樣的G#、D#、K#均位置較遠(yuǎn)。

2.1.3.2 水樣PCA分析

水樣PCA圖(圖4)顯示，第一次采樣G#、D#、K#位置接近，從第二次采樣開始出現(xiàn)分化，G#、D#、K#位置相距較遠(yuǎn)，第二次及最后一次采樣G#與D#位置相對(duì)接近，與K#位置相對(duì)疏遠(yuǎn)。水樣及泥樣的PCA分析結(jié)果與DGGE聚類分析結(jié)果相似。

圖3 泥樣PCAFig.3 PCA of mud sample

圖4 水樣PCAFig.4 PCA of water samples

2.2 DGGE切膠圖譜及物種測(cè)定結(jié)果

分別對(duì)DGGE圖譜上較為清晰且具有一定明顯特征的條帶進(jìn)行切割，水樣和泥樣分別切割8、10個(gè)條帶(圖5、圖6)。將條帶進(jìn)行回收并重新克隆后進(jìn)行測(cè)序，所得到的DNA片段通過(guò)U.S National Library of Medicine 的nucleotide blast項(xiàng)目進(jìn)行匹配，找出相似性較高的物種，相似性在93%～100%之間結(jié)果顯示，總共匹配的物種門類分別是變形菌門(α-變形菌亞門、β-變形菌亞門、γ-變形菌亞門、δ-變形菌亞門、ε-變形菌亞門)、綠菌門、酸桿菌門、厚壁菌門、放線菌門、藍(lán)藻門。養(yǎng)殖稻田溝底泥主要的細(xì)菌為β-變形菌亞門、ε-變形菌亞門、綠菌門、酸桿菌門。養(yǎng)殖稻田底泥主要的細(xì)菌門類為ε-變形菌亞門、綠菌門、酸桿菌門、β-變形菌亞門、δ-變形菌亞門。常規(guī)稻田主要細(xì)菌門類為ε-變形菌亞門、厚壁菌門、α-變形菌亞門、酸桿菌門、β-變形菌亞門、γ-變形菌亞門、δ-變形菌亞門。綠菌門沒(méi)有出現(xiàn)在常規(guī)稻田中，α-變形菌亞門、厚壁菌門、γ-變形菌亞門只出現(xiàn)在常規(guī)稻田(表2)。

水樣匹配的細(xì)菌門類為放線菌門、藍(lán)藻門、α-變形菌亞門。第一次樣品各個(gè)不同位置的細(xì)菌門類相似，含有放線菌門、藍(lán)藻門、α-變形菌亞門。第二次及第三次采樣均未在常規(guī)稻田中發(fā)現(xiàn)放線菌門、藍(lán)藻門聚球藻屬、α-變形菌亞門。藍(lán)藻門色球藻屬第二次及第三次采樣未在養(yǎng)殖稻田溝水體中出現(xiàn)(表2)。

圖5 泥樣切膠圖譜Fig.5 Rubber cutting map of mud samples

圖6 水樣切膠圖譜Fig.6 Rubber cutting map of water samples表2 16S rDNA-V3區(qū)片段序列比對(duì)結(jié)果Tab.2 Comparison of 16S rDNA-V3 sequences by sequencing and BLAST analysis

條帶編號(hào)基因登記號(hào)同源性最近種類相似度N1HM535225.1Thiobacillusthioparus97%N2KM979608.1Sulfuricurvumsp98%N3LC076472.1Sulfurirhabdus98%N4JQ669498.1Chlorobibacterium93%N5KM200457.1UnculturedAcidobacteriabacterium96%N6GU257819.1UnculturedZoogloeasp99%N7KT428289.1Pelagibacasp97%N8KT322923.1UnculturedAnaeromyxobactersp98%N9AB811051.1Legionellagresilensis93%N10KM585603.1Cetobacteriumsp99%S1GQ366691.1UnculturedKnoelliasp97%S2HQ707131.1UnculturedCyanobacteriumsp94%S3JN371211.1Unculturedactinobacterium97%S4KT893450.1Synechococcussp100%S5EF088332.1Merismopediasp100%S6KT893450.1Synechococcussp100%S7AB920864.1UnculturedHyphomicrobiumsp100%S8JN409246.1Unculturedcyanobacterium99%

3 討論

微生物群落是水體生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分，在水體中氮、 磷、 硫和碳等要素的循環(huán)和利用中起到至關(guān)重要的作用[13]。土壤的功能及維持很大程度上取決于微生物的活動(dòng)[14]。細(xì)菌多樣性對(duì)其所在的生態(tài)系統(tǒng)所發(fā)生的生化反應(yīng)具有重要的影響，因此，對(duì)環(huán)境中細(xì)菌多樣性的研究可以用來(lái)監(jiān)控環(huán)境變化[15]。李成芳等[16]研究結(jié)果表明，與常規(guī)稻作相比,稻鴨共作能顯著提高土壤微生物數(shù)量,其中細(xì)菌數(shù)最多,放線菌次之,真菌最少。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出的沙塘鱧養(yǎng)殖稻田系統(tǒng)中底泥的變形菌最多，其余還有綠菌門、酸桿菌門等，常規(guī)稻田中檢測(cè)出的β-變形菌亞門、δ-變形菌亞門、酸桿菌門與陳俊輝等[17]研究得出的稻田土壤常見(jiàn)微生物種類相符合。電泳條帶的多少，可以直觀反映出樣品中細(xì)菌群落的遺傳多樣性，多樣性指數(shù)又是用以衡量群落物種數(shù)及個(gè)體的分布均勻度的一個(gè)綜合指標(biāo)[18]。本實(shí)驗(yàn)中，K1n#的物種條帶數(shù)比D1n#的少6條，K2n#的物種條帶數(shù)比D2n#的少8條，K3n# 的物種條帶數(shù)比D3n#的少10條，G1n#、G2n#、G3n#的平均Shannon多樣性指數(shù)為2.25， D1n#、D2n#、D3n#的平均Shannon多樣性指數(shù)為2.86，K1n#、K2n#、K3n#的平均Shannon多樣性指數(shù)為2.27，無(wú)論是物種的條帶數(shù)還是Shannon指數(shù)，養(yǎng)殖沙塘鱧的稻田均優(yōu)于常規(guī)稻田，說(shuō)明稻田養(yǎng)殖沙塘鱧可以增加稻田底泥微生物種類數(shù)及微生物多樣性，使底泥環(huán)境更加穩(wěn)定，從而有利于養(yǎng)殖生物的生長(zhǎng)及水稻的生長(zhǎng)。從PCA及DGGE聚類圖的結(jié)果及分析可以得出，稻田養(yǎng)殖沙塘鱧可以對(duì)稻田的底泥微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大的影響。G1n#>G2n# 、G3n#，養(yǎng)殖稻田的溝底泥微生物多樣性由高到低變化。

唐永濤等[12]通過(guò)樣品的聚類分析得出，蝦單養(yǎng)(SH1#)和蝦與三角帆蚌混養(yǎng)(SH3#)水體菌群組成和群落結(jié)構(gòu)相似性較高，而蝦和鰱鳙混養(yǎng)(SH2#)和蝦、三角帆蚌、鰱鳙混養(yǎng)(SH4#)相似性較高，SH1#、SH3#與 SH2#、SH4#距離較遠(yuǎn)，相似性很低。本實(shí)驗(yàn)的水樣DGGE聚類圖及PCA圖同樣清楚地反應(yīng)了個(gè)樣品之間的聚類遠(yuǎn)近，除了前期差異不明顯，可能是前期各組的進(jìn)水來(lái)自同一個(gè)蓄水池，所以無(wú)法顯現(xiàn)微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，G2s#、D2s#、K2s#相聚較遠(yuǎn)，G3s#、D3s#、K3s#也相聚較遠(yuǎn)，表現(xiàn)出不同采樣點(diǎn)之間的空間差異，這也充分體現(xiàn)了沙塘鱧養(yǎng)殖稻田對(duì)于稻田水體及溝中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，第二次及第三次樣放線菌門、藍(lán)藻門、α-變形菌亞門只出現(xiàn)在稻田養(yǎng)殖系統(tǒng)水體中，且藍(lán)藻門色球藻屬只出現(xiàn)在養(yǎng)殖稻田的溝中水體，這說(shuō)明沙塘鱧養(yǎng)殖稻田的微生物種類要比常規(guī)稻田的稻田水體豐富，這也從一個(gè)側(cè)面體現(xiàn)了沙塘鱧稻田養(yǎng)殖模式的優(yōu)越性。物種條帶數(shù)及Shannon多樣性指數(shù)各采樣點(diǎn)間數(shù)據(jù)沒(méi)有明顯的差異(P>0.05)。G1s#與G2s#、G3s#從圖中可以看出相聚較近，D1s#與D2s#、D3s#距離較遠(yuǎn)，K1s#與K2s#、K3s#亦距離較遠(yuǎn)，前者體現(xiàn)了養(yǎng)殖稻田溝的水體微生物群落結(jié)構(gòu)三次采樣時(shí)間相似度較高，說(shuō)明養(yǎng)殖稻田的溝的水體環(huán)境相對(duì)養(yǎng)殖稻田的稻田水體環(huán)境及常規(guī)稻田的水體環(huán)境要穩(wěn)定。

研究發(fā)現(xiàn)，稻田底泥中變形菌門的種類最多，這與陳香碧等[19]進(jìn)行的變形菌的相關(guān)研究得出的研究區(qū)土壤4中類型樣地中分布最廣、多樣性最高的細(xì)菌類群是變形菌的結(jié)果一致。酸桿菌門是苯酚的主要降解菌[20]，本實(shí)驗(yàn)中它在不同的采樣點(diǎn)均有出現(xiàn)，這也體現(xiàn)了此類細(xì)菌在稻田的常見(jiàn)性。在張銳[21]的研究中發(fā)現(xiàn)，厭氧脫氮系統(tǒng)中存在變形菌門、 擬桿菌門和綠菌門這幾種主要的細(xì)菌，變形菌同樣是最主要的菌群，同時(shí)這也發(fā)現(xiàn)綠菌門也參與脫氮反應(yīng)，在本實(shí)驗(yàn)中綠菌門沒(méi)有出現(xiàn)在常規(guī)稻田，說(shuō)明可能沙塘鱧養(yǎng)殖稻田的環(huán)境更適合它生活，從側(cè)面反映出沙塘鱧養(yǎng)殖稻田微生物群落結(jié)構(gòu)的豐富，這也有可能與綠菌門的習(xí)性有關(guān)，綠菌門主要是一些厭氧光合細(xì)菌，這就可以解釋其只在沙塘鱧養(yǎng)殖稻田出現(xiàn)的原因了，可能是養(yǎng)殖稻田的水體深度較之常規(guī)稻田深，形成了微弱的厭氧環(huán)境，更適合其生存，但是由于此類細(xì)菌均為未被培養(yǎng)的細(xì)菌，很難鑒定其在生態(tài)中的理化特性及功能[22]。本實(shí)驗(yàn)中厚壁菌門只在常規(guī)稻田出現(xiàn)，而韓崗等認(rèn)為，厚壁菌門細(xì)菌是一類生活在腸道內(nèi)的與脂肪有關(guān)的細(xì)菌，可見(jiàn)此類細(xì)菌可能會(huì)造成水體的污染，沙塘鱧養(yǎng)殖稻田中檢測(cè)出厚壁菌門說(shuō)明此養(yǎng)殖模式從一定程度上有利于環(huán)境的凈化，提高生態(tài)系統(tǒng)的安全性。后期的水體樣品顯示，常規(guī)稻田所含有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門類遠(yuǎn)少于沙塘鱧養(yǎng)殖稻田，而養(yǎng)殖稻田溝的種類亦小于養(yǎng)殖稻田，可以得出，沙塘鱧養(yǎng)殖稻田的稻田水體的優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)最豐富。

稻田引入沙塘鱧，可以提高稻田底泥的微生物多樣性及改善其群落結(jié)構(gòu)，豐富底泥微生物的種類數(shù)。對(duì)稻田的水體微生物群落結(jié)構(gòu)具有一定的影響，提高其微生物種類數(shù)目。研究發(fā)現(xiàn)，沙塘鱧養(yǎng)殖稻田養(yǎng)殖溝渠中水體的微生物群落結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，底泥多樣性出現(xiàn)由高向低變化。α-變形菌亞門、γ-變形菌亞門只出現(xiàn)在常規(guī)稻田，沙塘鱧稻田養(yǎng)殖對(duì)于微生物具體的影響方式等還有待進(jìn)一步的研究探討。

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(責(zé)任編輯：張紅林)

Influence of the cultured Odontobutis obscurus to the microbial community structure and diversity in rice-fish system

ZHAO Xiang-gang,LUO Heng,LIU Qi-gen,ZHAO Liang-jie,CAI Lin-rong,DAI Liang-liang,ZHANG Zhen

(KeyLaboratoryofAquaticGeneticResourceandUtilization,MinistryofAgriculture/ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306,China)

In order to study influence of the culturedOdontobutisobscurusto the microbial community structure and diversity in rice-fish system.We investigated the microbial diversity of the water and sediment in rice-fish system using DGGE technology in Haiyan,Zhejiang.In this study,we detected species of Alphaproteo bacteria,Betaproteo bacteria,Gammaproteo bacteria,Deltaproteo bacteria,Epsilonproteo bacteria,Chlorobi,Acido bacteria,Firmicutes,Actino bacteria,Cyano bacteria.Diversity analysis showed that the number of sediment microbial species in rice-fish system were higher than that in the conventional rice fields.The Shannon-Weiner index in sediment of the rice-fish system was 2.86,significantly higher than 2.27 of the conventional rice field The Shannon-Weiner index in sediment was declined from 2.56 to 2.16 along the cultured process in rice-fish system.PCA and DGGE results showed the obvious differences of the microbial community structure in water and sediment between the rice-fish system and the conventional paddy fields,which indicated the cultured speciesO.obscurusmay play an important role in the regulation of the microbial community structure.

rice-fish system;DGGE;Odontobutisobscurus

2016-03-29；

2017-04-24

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項(xiàng)：淡水池塘工程化改造與環(huán)境修復(fù)技術(shù)研究與示范(201203083)；上海市高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目(ZF1206)

趙翔剛(1989- )，男，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)槌靥辽鷳B(tài)養(yǎng)殖。E-mail:zxg198908@gmail.com

劉其根。E-mail: qgliu@shou.edu.cn

S931.3

A

1000-6907-(2017)04-0008-07